Immunocompetent darm-op-chip-model voor het analyseren van immuunresponsen van het darmslijmvlies
Özet
Ons gedetailleerde protocol schetst de creatie en het gebruik van het geavanceerde darm-op-chip-model, dat menselijk darmslijmvlies simuleert met 3D-structuren en verschillende celtypen, waardoor een diepgaande analyse van immuunresponsen en cellulaire functies als reactie op microbiële kolonisatie mogelijk is.
Abstract
Er is een geavanceerd darm-op-chip-model ontwikkeld dat epitheliale 3D-organotypische villusachtige en crypte-achtige structuren nabootst. Het immunocompetente model omvat endotheelcellen van de menselijke navelstrengader (HUVEC), Caco-2 darmepitheelcellen, in het weefsel wonende macrofagen en dendritische cellen, die zichzelf organiseren in het weefsel en de kenmerken van het menselijke darmslijmvlies weerspiegelen. Een uniek aspect van dit platform is het vermogen om circulerende menselijke primaire immuuncellen te integreren, waardoor de fysiologische relevantie wordt vergroot. Het model is ontworpen om de reactie van het intestinale immuunsysteem op bacteriële en schimmelkolonisatie en infectie te onderzoeken. Vanwege de vergrote holtegrootte biedt het model diverse functionele uitlezingen zoals permeatietests, cytokine-afgifte en immuuncelinfiltratie, en is het compatibel met immunofluorescentiemeting van 3D-structuren gevormd door de epitheelcellaag. Het biedt hierbij uitgebreid inzicht in celdifferentiatie en -functie. Het darm-op-chip-platform heeft zijn potentieel aangetoond bij het ophelderen van complexe interacties tussen surrogaten van een levende microbiota en menselijk gastheerweefsel binnen een microfysiologisch doorbloed biochipplatform.
Introduction
Organ-on-Chip (OoC) systemen vertegenwoordigen een opkomende techniek van 3D-celcultuur die in staat is om de kloof tussen conventionele 2D-celcultuur en diermodellen te overbruggen. OoC-platforms bestaan doorgaans uit een of meer compartimenten met weefselspecifieke cellen die zijn gekweekt op een breed scala aan steigers, zoals membranen of hydrogels1. De modellen zijn in staat om een of meer gedefinieerde organotypische functies na te bootsen. Pompen maken continue microfluïdische perfusie van celkweekmedium mogelijk voor de verwijdering van cellulaire afvalproducten, toevoer van voeding en groeifactoren voor verbeterde cellulaire differentiatie en het nabootsen van essentiële in vivo omstandigheden. Met de integratie van immuuncellen kunnen OoC-systemen de menselijke immuunrespons in vitro nabootsen 2. Tot op heden is een breed scala aan organen en functionele eenheden gepresenteerd1. Deze systemen omvatten modellen van het vaatstelsel3, long4, lever 2,5 en darm6 die kunnen worden gefaciliteerd voor het testen van geneesmiddelen 5,7 en infectiestudies 6,8.
We presenteren hier een menselijk darm-op-chip-model dat menselijke epitheelcellen integreert en een organotypische 3D-topografie vormt van villusachtige en crypte-achtige structuren gecombineerd met een endotheelbekleding en weefsel-residente macrofagen. Het model wordt gekweekt in een microfluïdisch geperfundeerde biochip in de vorm van een microscopisch objectglaasje. Elke biochip bestaat uit twee afzonderlijke microfluïdische holtes. Elke holte is door een poreus polyethyleentereftalaat (PET) membraan verdeeld in een boven- en onderkamer. Het membraan zelf dient ook als steiger voor de cellen om aan elke kant te groeien. De poriën van het membraan maken cellulaire overspraak en celmigratie tussen cellagen mogelijk. Elke kamer is toegankelijk via twee vrouwelijke poorten ter grootte van een luer-slot. Optioneel kan een extra poort ter grootte van een mini-luer-slot toegang bieden tot de boven- of onderkamer (Figuur 1).
Het OoC-platform biedt een aantal uitlezingen die uit een enkel experiment kunnen worden gehaald. De darm-op-chip is afgestemd op het combineren van geperfuseerde 3D-celcultuur, effluentanalyse en fluorescentiemicroscopie om de expressie van celmarkers, metabolisatiesnelheden, immuunrespons, microbiële kolonisatie en infectie en barrièrefunctie te beoordelen 3,6,8. Het model omvat weefsel-residente immuuncellen en direct contact van levende micro-organismen met het gastheerweefsel, wat een voordeel is in vergelijking met andere gepubliceerde modellen9. Verder organiseren epitheelcellen zichzelf tot driedimensionale structuren die een fysiologisch relevante interface bieden voor de kolonisatie met een levende microbiota6.
Protocol
Representative Results
Discussion
Het gepresenteerde protocol beschrijft de noodzakelijke stappen voor het genereren van een immunocompetent darm-op-chip-model. We beschreven specifieke technieken en mogelijke uitleesmethoden zoals immunofluorescentiemicroscopie, cytokine- en metabolietanalyse, flowcytometrie, eiwit- en genetische analyse en permeabiliteitsmeting.
Het beschreven model bestaat uit primaire HUVEC’s, van monocyten afgeleide macrofagen en van monocyten afgeleide dendritische cellen die samen zijn gekweekt met een …
Açıklamalar
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Het werk werd financieel ondersteund door het Collaborative Research Center, PolyTarget 1278 (projectnummer 316213987) aan V.D.W. en A.S.M., A.F. en A.S.M. erkennen verder de financiële steun van het Cluster of Excellence “Balance of the Microverse” in het kader van de Duitse Excellence Strategy – EXC 2051 – Project-ID 690 390713860. We willen Astrid Tannert en het Jena Biophotonic and Imaging Laboratory (JBIL) bedanken voor het feit dat ze ons toegang hebben gegeven tot hun confocale laserscanmicroscoop ZEISS LSM980. Figuur 1C tr Figuur 2 zijn gemaakt met Biorender.com.
Materials
| 96-well plate black, clear bottom | Thermo Fisher | 10000631 | Consumables |
| Acetic acid | Roth | 3738.4 | Chemicals |
| Alexa Fluor 488 AffiniPure, donkey, anti-mouse IgG (H+L) | Jackson Immuno Research | 715-545-150 | Secondary Antibody Vascular Staining and Epithelial Staining |
| Alexa Fluor 647 AffiniPure, donkey, anti-rabbit IgG (H+L) | Jackson Immuno Research | 711-605-152 | Secondary Antibody Epithelial Staining |
| Alexa Fluor 647, donkey, anti-rabbit IgG (H+L) | Thermo Fisher Scientific, Invitrogen | A31573 | Secondary Antibody Vascular Staining |
| Axiocam ERc5s camera | Zeiss | 426540-9901-000 | Technical equipment |
| Basal Medium MV, phenol red-free | Promocell | C-22225 | Cell culture consumables |
| Biochip | Dynamic 42 | BC002 | Microfluidic consumables |
| BSA fraction V | Gibco | 15260-037 | Cell culture consumables |
| C2BBe1 (clone of Caco-2) | ATCC | CRL-2102 | Epithelial Cell Source |
| Chloroform | Sigma | C2432 | Chemicals |
| CO2 Incubator | Heracell | 150i | Technical equipment |
| Collagen IV from human placenta | Sigma-Aldrich | C5533 | Cell culture consumables |
| Coverslips (24 x 40 mm; #1.5) | Menzel-Gläser | 15747592 | Consumables |
| Cy3 AffiniPure, donkey, anti-goat IgG (H+L) | Jackson Immuno Research | 705-165-147 | Secondary Antibody Vascular Staining |
| Cy3 AffiniPure, donkey, anti-rat IgG (H+L) | Jackson Immuno Research | 712-165-150 | Secondary Antibody Epithelial Staining |
| DAPI (4',6-Diamidin-2-phenylindol, Dilactate) | Thermo Fisher Scientific, Invitrogen | D3571 | Vascular and Epithelial Staining |
| Descosept PUR | Dr.Schuhmacher | 00-323-100 | Cell culture consumables |
| DMEM high glucose | Gibco | 41965-062 | Cell culture consumables |
| DMEM high glucose w/o phenol red | Gibco | 31053028 | Cell culture consumables |
| DPBS (-/-) | Gibco | 14190-169 | Cell culture consumables |
| DPBS (+/+) | Gibco | 14040-133 | Cell culture consumables |
| EDTA solution | Invitrogen | 15575-038 | Cell culture consumables |
| Endothelial Cell Growth Medium | Promocell | C-22020 | Cell culture consumables |
| Endothelial Cell Growth Medium supplement mix | Promocell | C-39225 | Cell culture consumables |
| Ethanol 96%, undenatured | Nordbrand-Nordhausen | 410 | Chemicals |
| Fetal bovine Serum | invitrogen | 10270106 | Cell culture consumables |
| Fluorescein isothiocyanate (FITC)-dextran (3-5 kDa) | Sigma Aldrich | FD4-100MG | Chemicals |
| Fluorescent Mounting Medium | Dako | S3023 | Chemicals |
| Gentamycin (10mg/mL) | Sigma Aldrich | G1272 | Cell culture consumables |
| GlutaMAX Supplement (100x) | Gibco | 35050061 | Cell culture consumables |
| Histopaque | Sigma-Aldrich | 10771 | Cell culture consumables |
| Hoechst (bisBenzimid) H33342 | Sigma-Aldrich | 14533 | Epithelial Staining |
| Holotransferrin (5mg/mL) Transferrin, Holo, Human Plasma | Millipore | 616397 | Cell culture consumables |
| Human recombinant GM-CSF | Peprotech | 300-30 | Cell culture consumables |
| Human recombinant M-CSF | Peprotech | 300-25 | Cell culture consumables |
| Illumination device | Zeiss | HXP 120 C | Fluorescence Microscope Setup |
| Laser Scanning Microscope | Zeiss | CLSM980 | Fluorescence Microscope Setup |
| Lidocain hydrochloride | Sigma-Aldrich | L5647 | Cell culture consumables |
| Lipopolysaccharide (LPS) | Sigma | L2630 | Cell culture consumables |
| Loftex Wipes | Loftex | 1250115 | Consumables |
| Low attachment tubes (PS, 5 mL) | Falcon | 352052 | Consumables |
| Luer adapter for the top cap (M) | Mo Bi Tec | M3003 | Microfluidic consumables |
| Male mini luer plugs, row of four,PP, opaque | Microfluidic chipshop | 09-0556-0336-09 | Microfluidic consumables |
| MEM Non-Essential Amino Acids Solution | Gibco | 11140 | Cell culture consumables |
| Methanol | Roth | 8388.2 | Chemicals |
| Microscope | Zeiss | Axio Observer 5 | Fluorescence Microscope Setup |
| Microscope slides | Menzel | MZ-0002 | Consumables |
| Monoclonal, mouse, anti-human CD68 Antibody (KP1) | Thermo Fisher Scientific, Invitrogen | 14-0688-82 | Primary Antibody Vascular Staining |
| Monoclonal, rat, anti-human E-Cadherin antibody (DECMA-1) | Sigma-Aldrich, Millipore | MABT26 | Primary Antibody Epithelial Staining |
| Multiskan Go plate reader | Thermo Fisher | 51119300 | Technical equipment |
| Normal donkey serum | Biozol | LIN-END9010-10 | Chemicals |
| Optical Sectioning | Zeiss | ApoTome | Fluorescence Microscope Setup |
| Penicillin-Streptomycin (10,000 U/mL) | Gibco | 15140-122 | Cell culture consumables |
| Plugs | Cole Parmer | GZ-45555-56 | Microfluidic consumables |
| Polyclonal, goat, anti-human VE-Cadherin Antibody | R&D Systems | AF938 | Primary Antibody Vascular Staining |
| Polyclonal, rabbit, anti-human Von Willebrand Factor Antibody | Dako | A0082 | Primary Antibody Vascular Staining |
| Polyclonal, rabbit, anti-human ZO-1 antibody | Thermo Fisher Scientific, Invitrogen | 61-7300 | Primary Antibody Epithelial Staining |
| Power Supply Microscope | Zeiss | Eplax Vp232 | Fluorescence Microscope Setup |
| Primovert microscope | Zeiss | 415510-1101-000 | Technical equipment |
| Reglo ICC peristaltic pump | Ismatec | ISM4412 | Technical equipment |
| SAHA (Vorinostat) | Sigma Aldrich | SML0061-25MG | Chemicals |
| Saponin | Fluka | 47036 | Chemicals |
| S-Monovette, 7.5 mL Z-Gel | Sarstedt | 01.1602 | Consumables |
| S-Monovette, 9.0 mL K3E | Sarstedt | 02.1066.001 | Consumables |
| Sodium Pyruvate | Gibco | 11360-088 | Cell culture consumables |
| Tank 4.5 mL | ChipShop | 10000079 | Microfluidic consumables |
| Trypane blue stain 0.4% | Invitrogen | T10282 | Cell culture consumables |
| Trypsin | Gibco | 11538876 | Cell culture consumables |
| Tubing | Dynamic 42 | ST001 | Microfluidic consumables |
| Tweezers (Präzisionspinzette DUMONT abgewinkelt Inox08, 5/45, 0,06 mm) | Roth | K343.1 | Consumables |
| Wheat Germ Agglutinin (WGA) | Thermo Fisher Scientific, Invitrogen | W32464 | Epithelial Staining |
| X-VIVO 15 | Lonza | BE02-060F | Cell culture consumables, Hematopoietic cell medium |
| Zellkultur Multiwell Platten, 24 Well, sterile | Greiner Bio-One | 662 160 | Consumables |
| Zellkultur Multiwell Platten, 6 Well, sterile | Greiner Bio-One | 657 160 | Consumables |
| Zen Blue Software | Zeiss | Version 3.7 | Microscopy Software |
Referanslar
- Alonso-Roman, R., et al. Organ-on-chip models for infectious disease research. Nat Microbiol. 9 (4), 891-904 (2024).
- Fahrner, R., Groger, M., Settmacher, U., Mosig, A. S. Functional integration of natural killer cells in a microfluidically perfused liver on-a-chip model. BMC Res Notes. 16 (1), 285 (2023).
- Raasch, M., et al. Microfluidically supported biochip design for culture of endothelial cell layers with improved perfusion conditions. Biofabrication. 7 (1), 015013 (2015).
- Deinhardt-Emmer, S., et al. Co-infection with Staphylococcus aureus after primary influenza virus infection leads to damage of the endothelium in a human alveolus-on-a-chip model. Biofabrication. 12 (2), 025012 (2020).
- Kaden, T., et al. Generation & characterization of expandable human liver sinusoidal endothelial cells and their application to assess hepatotoxicity in an advanced in vitro liver model. Toxicology. 483, 153374 (2023).
- Maurer, M., et al. A three-dimensional immunocompetent intestine-on-chip model as in vitro platform for functional and microbial interaction studies. Biomaterials. 220, 119396 (2019).
- Hoang, T. N. M., et al. Invasive aspergillosis-on-chip: A quantitative treatment study of human aspergillus fumigatus infection. Biomaterials. 283, 121420 (2022).
- Kaden, T., et al. Modeling of intravenous caspofungin administration using an intestine-on-chip reveals altered Candida albicans microcolonies and pathogenicity. Biomaterials. 307, 122525 (2024).
- Shah, P., et al. A microfluidics-based in vitro model of the gastrointestinal human-microbe interface. Nat Commun. 7, 11535 (2016).
- Jaffe, E. A., Nachman, R. L., Becker, C. G., Minick, C. R. Culture of human endothelial cells derived from umbilical veins. Identification by morphologic and immunologic criteria. J Clin Invest. 52 (11), 2745-2756 (1973).
- Mosig, S., et al. Different functions of monocyte subsets in familial hypercholesterolemia: Potential function of cd14+ cd16+ monocytes in detoxification of oxidized ldl. FASEB J. 23 (3), 866-874 (2009).
- Peterson, M., Mooseker, M. Characterization of the enterocyte-like brush border cytoskeieton of the c2bbe clones of the human intestinal cell line, caco-2. J Cell Sci. 102, 581-600 (1992).
- Shin, W., Hinojosa, C. D., Ingber, D. E., Kim, H. J. Human intestinal morphogenesis controlled by transepithelial morphogen gradient and flow-dependent physical cues in a microengineered gut-on-a-chip. iScience. 15, 391-406 (2019).
- Kim, H. J., Ingber, D. E. Gut-on-a-chip microenvironment induces human intestinal cells to undergo villus differentiation. Integr Biol (Camb). 5 (9), 1130-1140 (2013).
- Kim, H. J., Huh, D., Hamilton, G., Ingber, D. E. Human gut-on-a-chip inhabited by microbial flora that experiences intestinal peristalsis-like motions and flow. Lab Chip. 12 (12), 2165-2174 (2012).
- Karra, N., Fernandes, J., James, J., Swindle, E. J., Morgan, H. The effect of membrane properties on cell growth in an ‘airway barrier on a chip’. Organs-on-a-Chip. 5, 10025 (2023).
