JoVE Journal > Environment
Summary
Abstract
Introduction
Protocol
Results
Discussion
Disclosures
Acknowledgements
Materials
References
русский

Automatically Generated
Please note that all translations are automatically generated. Click here for the English version.
Environment

Модельная экосистема на основе агарозы для культивирования метанотрофов в метано-кислородном контрградиенте

Published: September 06, 2024
doi:
10.3791/67191
,
1Department of Chemistry and the Henry Eyring Center for Cell and Genome Science,University of Utah

Summary

Описан протокол подготовки простой модели экосистемы, воссоздающей метано-кислородный счетчик градиента, обнаруженный в естественной среде обитания аэробных метаноокисляющих бактерий, что позволяет изучать их физиологию в пространственно разрешенном контексте. Также описаны модификации общих биохимических анализов для использования с модельной экосистемой на основе агарозы.

Abstract

Аэробные метаноокисляющие бактерии, известные как метанотрофы, играют важную роль в биогеохимическом цикле. Метанотрофы занимают определенную экологическую нишу в метано-кислородных контрградиентах, обнаруженных в почвах и отложениях, что влияет на их поведение на индивидуальном и общественном уровне. Тем не менее, традиционные методы изучения физиологии этих микроорганизмов, снижающих выбросы парниковых газов, часто используют однородные планктонные культуры, которые не точно представляют пространственные и химические градиенты, обнаруженные в окружающей среде. Это мешает ученым понять, как эти бактерии ведут себя in situ. Здесь описывается простая, недорогая модельная экосистема, называемая градиентным шприцем, в которой используется полутвердая агароза для воссоздания крутых метано-кислородных контрградиентов, характерных для естественной среды обитания метанотрофов. Градиентный шприц позволяет культивировать метанотрофные штаммы и обогащать смешанные метаноокисляющие консорциумы из образцов окружающей среды, выявляя фенотипы, видимые только в этом пространственно разрешенном контексте. В этом протоколе также представлены различные биохимические анализы, которые были модифицированы для обеспечения совместимости с полутвердой агарозной матрицей, что может быть ценным для исследователей, культивирующих микроорганизмы в других системах на основе агарозы.

Introduction

Микроорганизмы, живущие на бескислородно-кислородной границе, часто выполняют важную экологическую роль1. Одним из примеров являются аэробные метаноокисляющие бактерии (метанотрофы), которые существуют в противоположных градиентах метана и кислорода в почвах и отложениях2. Эти микроорганизмы обладают уникальными метаболическими и физиологическими характеристиками, которые позволяют им использовать газовые градиенты, присутствующие в их окружающей среде, и являются предметом продолжающихся исследований в течение десятилетий 3,4,5. В настоящее время большинство опубликованных исследований метанотрофов и метаноокисляющих сообществ основано на работе с однородными планктонными культурами, которым часто не удается уловить пространственные и химические градиенты, присущие их естественной микробной среде обитания. Это ограничение препятствует нашему пониманию физиологии микробов и нашей способности связывать геномную информацию с фенотипическими признаками.

В этом протоколе описывается простая лабораторная модельная экосистема, которая создает воспроизводимые условия для изучения как конкретных метанотрофов, таких как штамм Methylomonas sp. LW13, так и метаноокисляющих сообществ непосредственно из образцов почвы окружающей среды. Важно отметить, что культивирование в градиентном шприце приводит к появлению противоградиент-специфичных фенотипов, которые отсутствуют в однородных планктонных культурах6, что подчеркивает способность системы открывать новые аспекты физиологии метанотрофа. Вдохновленный ранее опубликованными моделями экосистем 7,8,9, градиентный шприц представляет собой упрощенный метод, который может быть использован для сбора химической и молекулярной информации от микроорганизмов, культивируемых с использованием этого подхода.

Описанные процедуры генетического, химического и молекулярного анализа были модифицированы для надежной работы на микробных культурах, выращенных в полутвердой агарозной матрице. Эти процедуры также могут быть полезны для анализа бактерий, выращенных в других полутвердых системах на основе агарозы, таких как те, которые используются для анализа плавания бактериального мягкого агара. Адаптация этих анализов к пространственно разрешенным контекстам может открыть новые возможности для изучения микробной жизни в более экологически значимых условиях.

Protocol

Подробная информация о реагентах и оборудовании, использованном в исследовании, приведена в Таблице материалов. 1. Подготовка и экструзия градиентных шприцев ПРИМЕЧАНИЕ: Градиентная подготовка шприца должна проводиться с использованием стерильной техники. Используйте несколько колоний Methylomonas sp. LW13, только что выращенных на тарелке, чтобы инокулировать 6 мл среды нитратных минеральных солей (NMS) в стеклянную пробирку размером 18 мм x 150 мм. Запечатайте пробирку сывороточной пробкой и алюминиевым обжимным уплотнением и добавьте метан с помощью шприца до конечной атмосферы 50% (v/v) метана в воздухе. Встряхните эту планктонную жидкую культуру при 200 об/мин при комнатной температуре до помутнения (около суток). Пассаж жидких культур 1:10 в свежие среды. Продолжайте выращивание жидких культур метанотрофов до логарифмического роста (наружный диаметр600 ~0,5) и доведите до наружного диаметра600 =1,0. Подготовьте шприцы, сняв прилагаемый поршень и храня их в стерильном контейнере. Прикрепите стерильный наконечник фильтра из ПТФЭ к шприцу и поместите его в стандартный штатив для пробирок наконечником вниз. Для каждого шприца объемом 10 мл тщательно смешайте 1 мл клеток с этапа 1,2 с 5 мл NMS и 4 мл расплавленной агарозы (0,5% m/v, охлажденной до 55 °C) в стерильной конической пробирке. Эти объемы можно масштабировать для параллельного наполнения нескольких шприцев. Медленно налейте или используйте серологическую пипетку, чтобы добавить смесь в каждый шприц, до маркировки 8 мл. Дайте агарозе в шприцах застыть (~15 минут), затем накройте крышкой стерильной резиновой бутиловой пробкой толщиной 20 мм. Закрепите пробку на шприце с помощью лабораторной ленты и пометьте ее содержимым шприца. Чтобы добавить метан в свободное пространство шприца, наполните большой (60 мл) шприц 100% CH4 и прикрепите наконечник фильтра из ПТФЭ (0,2 мкм, 25 мм), соединенный со стерильной иглой (23 G). Проткните резиновую пробку большим шприцем и проткните вторую стерильную иглу через пробку, чтобы образовался выход газа. Нажмите на поршень большого шприца, чтобы 20 мл 100% CH4 промылось через свободное пространство, осторожно извлекая выходную иглу, когда в большом шприце остается 1-2 мл CH4 , чтобы предотвратить обратный поток кислорода через выходную иглу. Инкубируйте шприцы при температуре 18 °C, повторяя шаги 1,6 и 1,7 ежедневно для восполнения метана. Чтобы выдавить агарозу, замените наконечник фильтра из ПТФЭ на стерильную иглу 23 G и замените резиновую пробку на плунжер шприца, входящий в комплект поставки. Медленно нажмите на поршень, чтобы распределить 1 мл в отдельные стерильные микроцентрифужные пробирки объемом 1,5 мл. 2. Определение концентраций газа с противоположным градиентом Измерение градиента растворенного кислородаС помощью бритвенного лезвия разрежьте по ширине наполненный агарозой шприц (подготовленный в соответствии с шагами 1.1-1.8) рядом с фильтром из ПТФЭ. Закрепите открытый шприц на шприцевом насосе, ориентированном на микроэлектрод типа Кларка, открытым концом которого должен быть направлен на кончик электрода. Отрегулируйте настройки шприцевого насоса так, чтобы шприц двигался по направлению к микроэлектроду со скоростью 1 мл/мин (0,6 см/мин); Начните записывать измерения концентрации растворенного кислорода в программном обеспечении Unisense Logger, как только шприцевой насос начнет работать. Измерение градиента метанаНепосредственно перед экструзией замените наконечник фильтра шприца на односторонний запорный кран, подключенный к игле 23 G, и быстро замените резиновую пробку на поршень шприца. Добавьте восемь аликвот агарозы по 1 мл в отдельные вакуумированные газонепроницаемые флаконы объемом 12 мл и дайте образцам сбалансироваться при комнатной температуре в течение 1 часа. Уравновесьте флаконы с образцами атмосферным давлением, открыв и немедленно запечатав флаконы или проколов и быстро удалив иглу. С помощью газонепроницаемого шприца введите 500 мкл пузырькового пространства в газовый хроматограф с пламенно-ионизационным детектированием (GC-FID). Создание калибровочной кривой, полученной на основе стандартов CH4 , для преобразования пиковой площади (пА*мин) в моль/л. 3. Подсчет ячеек в градиентном шприце Проточная цитометрияЭкструдируйте 1 мл агарозных сегментов из градиентных шприцев, инокулированных LW13 дикого или мутантного типа, как описано в шаге 1.9. Также приготовьте и выдавите агарозу из бесклеточного, стерильного шприца в качестве отрицательного контроля. Добавьте 0,75 мл 0,85% (м/об) NaCl в воде во все экструдированные образцы агарозы и гомогенизируйте путем вортексирования. Далее разбавляют образцы в соотношении 1:10, переливая 100 мкл в новую микроцентрифужную пробирку и добавляя 900 мкл раствора соли. Добавьте 3 мкл смеси красителей SYTO9 и йодида пропидида в соотношении 1:1, затем выдерживайте в темноте при комнатной температуре в течение 15 минут. Чтобы определить количество клеток на мл агарозы, ультразвуком обрабатывают микросферу счетной суспензией на водяной бане в течение 5 мин. Затем добавьте 10 мкл суспензии в каждый образец перед анализом проточной цитометрии. Анализируют образцы с помощью проточного цитометра10,11 со следующими параметрами: запуск по зеленой флуоресценции, скорость потока 10 мкл/с и скорость анализа частиц ниже 1000 частиц/с.Сравните SSC с. Точечные диаграммы FITC между бесклеточными контрольными образцами и инокулированными образцами агарозы для создания затворов напряжения «бактериального события», которые исключают фоновые частицы агарозы. Кроме того, нарисуйте затворы напряжения для подсчета микросфер, которые должны быть одинаковыми между образцами. Чтобы определить концентрацию клеток в каждом сегменте агарозы в градиентном шприце, используйте следующее уравнение, отметив, что коэффициент разведения для указанного протокола составляет 17,7275 и что 10-6 мл составляют объем одной микросферы. Подсчет колониеобразующих единиц в градиентном шприцеВыдавите 1 мл агарозных сегментов в отдельные, стерильные микроцентрифужные пробирки объемом 2 мл, добавьте 800 мкл NMS и вдохните в течение 10 с, чтобы помочь в пипетировании. Приготовьте стерильный планшет на 96 лунок, добавив 180 мкл NMS в каждую лунку. Добавьте по 20 мкл разведенных образцов агарозы в каждую лунку в первой колонне и перемешайте с помощью пипетки. С помощью многоканальной пипетки последовательно разбавляйте образцы в десять раз, перенося 20 мкл из первого ряда лунок во второй ряд лунок и пипетируя 10 раз для перемешивания. Продолжайте этот процесс до последнего ряда тарелки. Наклейте этикетки на пластины квадратной сетки, содержащие агар NMS или другой носитель. С помощью многоканальной пипетки нанесите 5 мкл из колонки 96-луночного планшета на агаровую пластину. В зависимости от размера агаровой пластины на одной пластине можно заметить несколько столбиков. Инкубируйте планшеты с содержанием метана в воздухе до 40% и выращивайте при 18 °C. Подсчитайте колонии бактерий через 2-3 дня и определите колониеобразующие единицы на миллилитр (КОЕ/мл). 4. Анализы на обнаружение биомолекул Полисахаридный анализВыдавите 1 мл сегментов агарозы в отдельные микроцентрифужные пробирки объемом 2 мл и смешайте с 1 мл 1% (м/об) раствора Na2CO3 в воде. Нагрейте образцы до 80 °C в течение 30 минут с вихревым нагревом каждые 5-10 минут, а затем центрифугирование при 4 000 x g при 4 °C в течение 20 минут. Соберите надосадочную жидкость в сочетании с тремя объемами 100% этанола и инкубируйте при 20 °C не менее 2 часов (или в течение ночи). Соберите осажденные этанолом полисахариды путем центрифугирования при 16 100 x g при 4 °C в течение 30 минут. Удалите надосадочную жидкость и высушите гранулу на воздухе. Повторно суспендируйте гранулу в 100 μл деионизированной воды. Измерьте относительное содержание полисахаридов в каждом агарозном сегменте с помощью фенол-сернокислотного колориметрического анализа12,13. Смешайте 50 мкл ресуспендированного экстракта со 150 мкл концентрированной серной кислоты и 30 мкл 5% фенола в воде в прозрачной 96-луночной пластине. Измерьте поглощение на длине волны 490 нм с помощью считывателя микропланшетов и рассчитайте относительное содержание полисахаридов в каждом агарозном сегменте в процентах от поглощения агарозного сегмента, ближайшего к фильтру из ПТФЭ. Анализ белкаВыдавите агарозу в отдельные микроцентрифужные пробирки объемом 1,5 мл и перенесите по 100 мкл каждой аликвоты в стеклянные пробирки. Определите общую концентрацию белка с помощью протокола в пробирке набора для анализа белка BCA. Приготовьте стандарт альбумина BSA с агарозой, выдавленной из стерильного шприца, в качестве разбавителя. Анализ внеклеточной ДНКВыдавите агарозу в отдельные микроцентрифужные пробирки объемом 1,5 мл и перенесите по 20 мкл каждой в микроцентрифужные пробирки объемом 0,2 мл. Измерьте концентрации ДНК с помощью коммерчески доступного набора для высокочувствительного анализа 1x dsDNA в соответствии с протоколом производителя. 5. Экстракция РНК Приготовьте экстракционный буфер, смешав в 800 мл воды, не содержащей РНКазы: 2,0 г CTAB, 2,0 г поливинилпирролидона (PVP 40), 81,8 г NaCl, 100 мМ Tris-HCl (pH 8,0) и 20 мМ ЭДТА. Доведите объем до 1 л и автоклав; хранить при температуре 4 °C. Приготовьте приготовленный экстракционный буфер и добавьте 1% (v/v) конечную концентрацию бета-меркаптоэтанола непосредственно перед использованием. Нагрейте буфер до 65 °C с помощью водяной бани или теплового блока. Разделите каждый градиентный шприц на секции объемом 1 мл, выдавливая агарозу в отдельные микроцентрифужные пробирки объемом 2 мл без РНКазы, следуя процедуре, описанной в шаге 1.9. Центрифугируйте образцы при температуре 21 000 x g, 4 °C, в течение 15 минут и выбросьте надосадочную жидкость, сохраняя образцы на льду. Добавьте 600 мкл предварительно подогретого экстракционного буфера к каждому гранулированному 1 мл экструдированной агарозы. Добавьте примерно 200 μл гранул диоксида циркония/кремнезема и гомогенизируйте образцы в течение 3 минут с частотой 30 Гц/с с помощью бисерной машины, сделав паузу на полпути, чтобы поместить образцы на лед на 2 минуты. Центрифугируйте образцы при температуре 15 000 x g, 4 °C, в течение 2 минут, чтобы уменьшить пенообразование. Извлечь образцы, добавив в пробирки 600 мкл хлороформа: изоамилового спирта (24:1) и провести вортекс в течение 10 с. Центрифугируйте образцы при температуре 15 000 x g, 4 °C, в течение 8 минут. Осторожно перенесите верхнюю водную фазу в новую микроцентрифужную пробирку, не содержащую РНКазы, и добавьте 600 мкл хлороформа: изоамиловый спирт (24:1) в перенесенную верхнюю фазу и вихрь на 10 с. Центрифугируйте образцы при температуре 15 000 x g, 4 °C, в течение 8 мин и перенесите новую верхнюю водную фазу в новую микроцентрифужную пробирку, не содержащую РНКазы. Добавьте равный объем изопропанола в перенесенную верхнюю фазу и инкубируйте образцы в течение нескольких часов при -20 °C. Дополнительно: образцы можно оставить при температуре -20 °C на ночь. Соберите РНК-содержащие осадки путем центрифугирования образцов при температуре 16 100 x g, 4 °C в течение 30 минут. Выбросьте надосадочную жидкость и промойте гранулу 300 μл холодного этанола 75% (v/v) из воды, не содержащей РНКазы, и центрифугируйте при 16 100 x g, 4 °C, в течение 5 минут. Снова промойте гранулы, следуя шагу 5.10. После удаления надосадочной жидкости этанола дайте гранулам высохнуть на воздухе в течение 15 минут. Растворите гранулы в 100 μл воды, не содержащей РНКазы. Обрабатывайте образцы ДНКазой I при 37 °C в течение 30 минут в соответствии с протоколом производителя. Инактивировать ДНКазу I путем добавления 300 мкл кислотного фенола: хлороформа: IAA (125:24:1, pH 4,5). Вортекс в течение 10 с и инкубировать при комнатной температуре в течение 5 мин. Центрифугируйте при температуре 16 100 x g, 4 °C в течение 5 минут и сохраняйте верхнюю водную фазу, перенося ее в новую микроцентрифужную пробирку, не содержащую РНКазы. Дополнительно: Объедините РНК из одного и того же сегмента во всех реплицируемых шприцах, объединив верхние фазы в коническую трубку. Добавить 1 объем изопропанола, равный объему РНК-содержащей верхней фазы и добавить 7,5 М LiCl до конечной концентрации 0,8 М, несколько раз инвертируя для перемешивания. Инкубируйте образцы в течение нескольких часов при температуре -20 °C. Дополнительно: образцы можно оставить при температуре -20 °C на ночь. Центрифугируйте образцы при температуре 16 100 x g, 4 °C, в течение 15 мин и осторожно выбросьте надосадочную жидкость. Дважды промойте РНК-содержащую гранулу, добавив холодный 70% этанол в воду, не содержащую РНКазы, центрифугируя при 16 100 x g, 4 °C, в течение 5 минут и удалив надосадочную жидкость. Дайте гранулам высохнуть на воздухе при комнатной температуре в течение 10 минут и повторно суспендируйте в 50 мкл воды, не содержащей РНКазы. Храните образцы РНК при температуре -80 °C. Опционально, в зависимости от качества РНК: образцы могут быть повторно очищены с помощью набора для очистки РНК для удаления небольших (<200 нт) РНК. Чтобы убедиться, что образцы РНК не содержат остаточной ДНК, используйте 1 мкл очищенной РНК в качестве матрицы для амплификации ПЦР с использованием универсальных бактериальных праймеров гена 16S рРНК 27F/1492R. Включите две дополнительные ПЦР-реакции, содержащие 1 мкл либо геномной ДНК (разбавленной 1:100), либо воды, не содержащей нуклеаз, в качестве положительного и отрицательного контроля соответственно. Запустите продукты на 1% агарозном геле TBE с помощью гель-электрофореза14.ПРИМЕЧАНИЕ: Образцы РНК без загрязнения ДНК должны приводить к отсутствию полосы на полосе образца. Если образцы РНК имеют загрязнение ДНК, повторите их обработку, начиная с шага 5.13. РНК готова к последующему анализу и может быть дополнительно проанализирована для количественной оценки ее целостности путем измерения числа целостности РНК (RIN).

Representative Results

В данном случае для культивирования одного штамма (метанотрофа Methylomonas sp. штамма LW13) (рис. 1A)6 была использована модельная экосистема градиентного шприца, но она также может быть использована для обогащения метаноокисляющего микробного сообщества путем прямого посева в почву (рис. 1B). Наличие метано-кислородного счетчика было подтверждено путем измерения концентрации метана и кислорода в бесклеточных и инокулированных шприцах (рис. 1C). Для шприцев с градиентом, инокулированным LW13, встречный градиент формировался в течение одного дня после промывки шприца, который становился более крутым в течение трех дней инкубации. За тот же период времени на одной и той же глубине сформировалась горизонтальная полоса, на которой оба газовых субстрата достигли своих самых низких концентраций (рис. 1А). Крутой градиент газа и истощение метана и кислорода за пределами глубины горизонтальной полосы показали, что LW13 аэробно метаболизирует метан и продуцирует фенотип, не наблюдаемый в однородной планктонной культуре. Этот фенотип также продуцируется другими метанотрофными бактериями, выделенными из того же образца окружающей среды, что и LW136. Зависимости от штамма в сроках и глубине развития горизонтальной полосы у различных метанотрофных штаммов позволяют предположить, что на горизонтальную полосу влияет специфическое поведение каждого микроба при культивировании в пространственно разрешенном контексте6. Количество клеток во всей агарозной пробке измеряли с помощью проточной цитометрии и количества колоний (КОЕ/мл) (рис. 2A). Этот метод был использован для сравнения распределения клеток и выживаемости LW13 дикого типа с мутантным штаммом LW13, содержащим делецию в гене фукозозной 4-О-ацетилтрансферазы (ОАТ), которая, как было показано ранее, влияет на развитие горизонтальной полосы6. Мутант ΔOAT LW13 имел более низкий общий рост в градиентном шприце в течение 6 дней по сравнению с диким типом, эффект, который не наблюдался в однородных планктонных культурах тех же штаммов6. Мутантный штамм не образовывал такую же четкую горизонтальную полосу, как дикий тип LW13 при культивировании в градиентном шприце (рис. 2B). Количество клеток и внешний вид горизонтальных полос были восстановлены до уровней, аналогичных дикому типу, после комплементации генов в мутантном штамме. Эти результаты демонстрируют, что градиентный шприц может быть использован для связывания генов с конкретными фенотипами, присутствующими только в градиенте метан-кислородного счетчика. Различные генетические, химические и молекулярные методы были адаптированы для использования с бактериями, выращенными внутри полутвердой агарозной матрицы. Экосистема модели градиентного шприца может быть легко использована для стандартных биомолекулярных количественных анализов с включением неинокулированной агарозы в качестве отрицательного контроля. Была измерена концентрация трех различных биомолекул, обычно встречающихся во внеклеточных полимерных веществах и биопленках: полисахаридов, белка и внеклеточной ДНК15 (рис. 3). В сегментах шприца, инокулированных LW13, горизонтальная полоса содержала значительно больше полисахаридов, чем другие сегменты, без значительного увеличения белка или внеклеточной ДНК. РНК-секвенирование использовали для измерения транскрипционных различий в LW13, растущем на разной глубине шприца. Надежная экстракция РНК была достигнута с использованием экстракционного буфера на основе CTAB с последующим использованием обычного фенола: этапы экстракции хлороформа и осаждения. Результаты анализа РНК-секвенирования были позже использованы для идентификации генов, участвующих в производстве горизонтальной полисахаридной полосы. Эти результаты указывают на то, что полутвердая агароза, необходимая для создания пространственно разрешенной модельной экосистемы, не препятствует дальнейшим биохимическим анализам, которые обычно проводятся для планктонных и пластинчатых культур. Рисунок 1: Модельная экосистема градиентного шприца. (A) Градиентный шприц, инокулированный метанотрофом Methylomonas sp. LW13. Отчетливая горизонтальная полоса (стреловидный наконечник) образуется в течение двух дней после промывки шприца 100% метаном. (Б) Фотографии крупным планом градиентных шприцев, инокулированных почвой, разведенной в соотношении 10-1 и 10-4 и инкубированных в течение двух недель. Градиентные шприцы, содержащие более разбавленную почву, приводили к образованию сферических колоний по всей агарозе, в то время как более концентрированный инокулят почвы приводил к образованию отчетливой полосы. (C) Определение характеристик метано-кислородного счетчика в инокулированных LW13 и стерильных градиентных шприцах после трех дней инкубации. Серой полосой обозначен диапазон глубин, на которых располагалась полисахаридная полоса; Данные показывают среднее значение ± SD трех независимых экспериментов с тремя техническими повторами в каждом. Панели (A) и (C) были модифицированы по Beals et al.6. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этой цифры. Рисунок 2: Количественное определение дикого типа LW13 и мутантного после инкубации в градиентном шприце . (A) Общее количество клеток LW13 на мл экструдированной агарозы, извлеченной из градиентных шприцев в день 0 и 7, измеренное с помощью проточной цитометрии. ΔOAT содержит делецию гена фукозозной 4-О-ацетилтрансферазы, который, как было обнаружено, обладает высокой экспрессией в клетках, расположенных в глубине полисахаридной полосы. ΔOAT+OAT содержит ген OAT, вставленный в дистальное расположение генома ΔOAT. *, достоверно отличающийся (двусторонний гетероскедастический t-критерий, α = 0,05); n.s., существенно не отличается. Данные показывают среднее значение ± SD трех независимых экспериментов с двумя техническими повторами в каждом. (B) Развитие горизонтальной полосы в градиентных шприцах, инокулированных LW13 дикого типа, ΔOAT или ΔOAT+OAT после семи дней инкубации. Эта цифра была изменена по Beals et al.6. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этой цифры. Рисунок 3: Количественное определение биомолекул при увеличении глубины градиентного шприца. Относительное содержание полисахаридов (%), концентрация белка (мкг/мл) и концентрация ДНК (нг/мкл) в восьми секциях градиентных шприцев, инокулированных LW13, инкубировавшихся в течение семи дней (заполненные круги; открытые круги показывают значения из стерильных градиентных шприцев). Данные показывают среднее значение ± SD трех независимых экспериментов с тремя техническими повторениями в каждом. Для относительного содержания полисахаридов * указывает на существенное отличие от стерильного контроля на эквивалентной глубине (двусторонний гетероскедастический t-критерий, α = 0,05). Для концентраций белков и ДНК * указывает на значительное отличие от участка, содержащего горизонтальную полосу (односторонний ANOVA с апостериорным анализом Тьюки-Крамера); н.с., не существенно. Рисунок был изменен по Beals et al.6. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этой цифры.

Discussion

Методы выращивания метанотрофа
Метанотрофы изучались в течение десятилетий, чтобы понять их физиологию, их индивидуальное и общественное поведение в природной среде, а также их потенциал для смягчения последствий метана в промышленных приложениях. На протяжении всех этих исследований большая часть проведенных исследований проводилась с использованием однородных планктонных культур, в которых теряется пространственный контекст. Модельная экосистема градиентного шприца была разработана для воспроизведения метано-кислородного контрградиента, характерного для естественных мест обитания метанотрофов в лаборатории, что позволило исследователям изучать метанотрофы, растущие в среде, которая больше напоминает то, где эволюционировали эти организмы.

За последние 30 лет исследователи воссоздали метано-кислородный счетчик градиента в лаборатории, используя различные методы, часто с основной целью выделения и классификации метанотрофов из смешанных метано-окислительных консорциумов. Эти методы можно разделить на два подхода, оба из которых предполагают использование противоположных камер метана и кислорода: суспендирование относительно ненарушенной почвы на мембране 16,17,18 или инокуляция небольших количеств почвы или чистой бактериальной культуры в минимальную среду в агарозе 7,8,19. Описанный здесь метод градиентного шприца сочетает в себе основанный на шприцах подход Дедыша и его коллег9 с выращиванием метанотрофов из предыдущей работы Амарала и Ноулза8, а также Шинка и коллег7. Последний из этих методов заложил основу для культивирования метанотрофов в метано-кислородном контрградиенте и использовал непрерывный поток метана и кислорода по обе стороны от агарозной пробки. Несмотря на то, что такой подход обеспечивает более стабильную среду, он усложняет экспериментальную установку и требует использования специальных источников газа.

В отличие от этого, описанный здесь градиентный шприц основан на ежедневной промывке шприца для получения свежего метана, процесс, который занимает менее минуты на шприц, обеспечивая при этом непрерывный доступ к атмосферному кислороду через стерильный наконечник фильтра из ПТФЭ. Этот более простой метод может обеспечить более широкое внедрение этой модельной экосистемы для изучения метанотрофов в пространственно разрешенном контексте. В описанном протоколе также подробно описаны химические и молекулярные анализы, которые могут быть выполнены непосредственно на бактериях, инкубированных в полутвердой агарозе. В результате бактерии не нужно иссекать и культивировать вне агарозной матрицы перед анализом, сохраняя условия градиента газа на момент отбора проб.

Замечания к протоколу
Поскольку бактерии культивируются в полипропиленовом объемном шприце, исследователи могут использовать прилагаемый поршень шприца для точного и воспроизводимого сегментирования агарозной пробки, сохраняя при этом пространственную целостность агарозной матрицы, которая все еще остается в цилиндре шприца. Без воздухонепроницаемой конструкции, присущей шприцу, агарозные пробки необходимо было бы извлекать из цилиндра шприца и нарезать, что вносило бы неопределенность в объем агарозных сегментов и выделяло бы в атмосферу неизмеримое количество метана и растворенного кислорода. Экструзия агарозы через стерильную иглу упрощает подготовку образцов и помогает гомогенизировать экструдированные сегменты без сдвига бактериальных клеток. Этот метод позволяет исследователям разделить каждый инокулированный градиентный шприц как минимум на восемь агарозных сегментов и проводить параллельные эксперименты с метанотрофами, растущими в диапазоне концентраций кислорода и метана.

При оптимизации экстракции РНК из агарозы с высоким содержанием полисахаридов было обнаружено, что распространенные реагенты, такие как тиоцианат гуанидия и тризол, приводят к гелеобразованию агарозы, что затрудняет очистные колонны и сопротивляется гранулированию центрифугированием. Низкий выход и качество РНК также вызывали беспокойство, поскольку большие молекулы полисахаридов могут захватывать нуклеиновые кислоты, в то время как маленькие полисахариды могут осаждаться вместе с РНК20. Вместо этого использовали экстракционный буфер, содержащий катионное поверхностно-активное вещество CTAB, которое растворяет липидные мембраны20; и NaCl, который предотвращает образование комплексов CTAB-нуклеиновых кислот и позволяет нуклеиновым кислотам выпадать в осадок, но сохраняет полисахариды в растворе21. РНКазы денатурировали путем включения β-меркаптоэтанола в буфер CTAB. Для эксперимента RNA-seq был включен необязательный этап очистки на основе столбцов для исключения малых (<200 нуклеотидов) РНК перед подготовкой библиотеки.

Ограничения и рекомендации
В то время как NMS и агароза обеспечивают минимальную среднюю матрицу для культивирования метанотрофных бактерий, градиентный шприц, как описано здесь, воссоздает только газовые градиенты метанотрофных местообитаний, но не другие градиенты, присутствующие в этих средах, такие как микрометаллы22, соленость23 или другие питательные вещества24. Возможно, эти градиенты могут быть добавлены в подобную систему в будущем. Кроме того, объем шприца (8 мл агарозы) ограничивает общую биомассу на шприц, что требует объединения нескольких шприцев для некоторых анализов (как описано в шаге 5.16). Несмотря на то, что ручной шприц удобно сегментирует агарозу на 1 мл аликвот, его размер также ограничивает пространство примерно до 4 мл, ограничивая количество метана, которое может храниться для культивируемых микробов. Поскольку скорость окисления метана пропорциональна скорости роста аэробныхметанотрофов25, рекомендуется ежедневное пополнение метана в свободном пространстве. Хотя это все еще может привести к периодам ограничения метана, эти периоды воспроизводятся в лаборатории и, вероятно, имитируют ситуации, обнаруженные в естественной среде.

При использовании градиентного шприца присутствие полисахаридов агарозы требует некоторых корректировок анализов, используемых для анализа метанотрофов, выращенных в этой системе. Например, протоколы, требующие переноса небольших объемов экструдированной агарозы, требуют нескольких этапов разведения с тщательной гомогенизацией между каждым разведением для точного пипетирования. Кроме того, в таких случаях, как анализ на полисахариды, когда полисахариды, присущие агарозной матрице, вступают в реакцию с реагентом серная кислота-фенол, включение стерильного, бесклеточного агарозного отрицательного контроля имеет важное значение. Ранние попытки смягчить эти проблемы путем включения агарозного гидролизующего фермента β-агаразы не увенчались успехом и привели к появлению в биологических экспериментах неизвестной переменной. Использование нескольких технических реплик, тщательное разбавление, гомогенизация и включение элементов управления могут быть использованы для смягчения большинства проблем, присущих агарозной матрице.

Приложений
В дополнение к исследованиям одного штамма, градиентный шприц может поддерживать совместное культивирование нескольких штаммов, а почва может быть использована в качестве инокулята вместо чистой бактериальной культуры. Простая конструкция экосистемы модели градиентного шприца поддается культивированию других типов микроорганизмов, которые существуют на границе между бескислородной и кислородной средами, с использованием другого газового субстрата, такого какH2 или CO, вместо метана. Таким образом, использование простой, пространственно разрешенной модельной экосистемы позволяет исследователям изучать уникальную физиологию и метаболические адаптации бескислородных микроорганизмов и может быть использовано для связывания генов с фенотипами организмов.

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Эта работа была поддержана финансированием стартапа от химического факультета Университета штата Юта и премией NSF CAREER Award #2339190. Мы благодарим членов Puri Lab за полезные дискуссии. Мы благодарим Рэйчел Харрелл (Университет штата Юта) за первоначальное руководство экспериментом по проточной цитометрии.

Materials

1% Gas mix analytical standard Supelco 22561 1% each component in nitrogen: carbon monoxide, carbon dioxide, hydrogen, methane and oxygen
100% Methane Airgas ME CP300 chemically pure grade
15 ppm Gas mix analytical standard Supelco 23470-U 15 ppm each component in nitrogen: methane, ethane, ethylene, acetylene, propane, propylene, propyne, and n-butane
1x Nitrate mineral salts  see CAS numbers below Dissolve the following in Mili-Q water and autoclave:  0.2 g/L MgSO4·7H2O, 0.2 g/L CaCl2·6H2O, 1 g/L KNO3, and 30 μM LaCl3. Before use, add trace elements to a 1X final concentration and phosphate buffer (pH 6.8) to a final concentration of 5.8 mM.
23 G needle BD Biosciences 305194 sterile, Luer-Lok
500x Trace elements see CAS numbers below Dissolve the following in Milli-Q water: 1.0 g/L Na2-EDTA, 2.0 g/L FeSO4·7H2O, 0.8 g/L ZnSO4·7H2O, 0.03 g/L MnCl2·4H2O, 0.03 g/L H3BO3, 0.2 g/L CoCl2·6H2O, 0.6 g/L CuCl2·2H2O, 0.02 g/L NiCl2·6H2O, and 0.05 g/L Na2MoO·2H2O.
96 Well plate CELLTREAT 229596 sterile
Acid phenol:chloroform:IAA (125:24:1) Invitrogen AM9720  pH 4.5
Agarose Fisher Scientific BP160 molecular biology grade, CAS 9012-36-6
Aluminum crimp seals VWR 30618-460 20 mm
Bead beater Qiagen 9003240 TissueLyser III
Butyl rubber stopper Chemglass Life Science 50-143-854 20 mm, blue
Chloroform:isoamyl alcohol (24:1) Millipore Sigma 25666 BioUltra, for molecular biology
Clark-type O2 microelectrode Unisense OX-500
DEPC-treated water Thermo Scientific R0601
DNase I (Ambion) Invitrogen AM2222
Flow cytometer Beckman Coulter CytoFLEX
Gas chromatograph (flame ionization detection) Agilent 6890N
Gastight analytical syringe Hamilton 81220 1750 TLL
Gastight analytical syringe needle Hamilton 7729-07 22 G, metal hub needle, 2 in, point style 5
Gas-tight vials Labco 938W Exetainer vial: 12 mL, round bottom
Glass culture tubes Bellco Glass 2048-00150 18 x 150 mm
LiCl precipitation solution (7.5 M) Invitrogen AM9480
One-way stopcock VWR MFLX30600-00 inlet port: female luer, outlet port: male luer lock
Petri dish, square Fisher Scientific FB0875711A 100 x 100 mm
Phosphate buffer, 0.2 M (pH 6.8) see CAS numbers below Dissolve the following in Milli-Q water and autoclave: 12.24 g/L KH2PO4, 26.29 g/L Na2HPO4 · 7H2O
Pierce BCA Protein Assay Kit  Thermo Scientific 23225
PTFE syringe filter tip Thermo Scientific 03-050-469 hydrophobic, pore size: 0.2 µm, diameter: 4 mm
Qubit 1x dsDNA High Sensitivity Assay Kit  Invitrogen Q33230
Qubit 4 Fluorometer Invitrogen Q33238
RNA Clean & Concentrator-5 Zymo Research R1013
Serum stopper Fisher Scientific 03-340-302 20 mm
Syringe BD Biosciences 302995 Luer-Lock, 10 mL, single use, sterile
Syringe pump New Era Pump Systems Inc. 1000-US NE-1000 one channel programmable
SYTO9, propidium iodide, microspheres Invitrogen L34856 LIVE/DEAD BacLight Bacterial Viability Kit
Zirconia/silica beads BioSpec Products 11079101z 0.1 mm diameter
Chemical reagents CAS number
CaCl2·6H2O 7774-34-7
CoCl2·6H2O 7791-13-1
Concentrated sulfuric acid 7664-93-9
CTAB, cetrimonium bromide 57-09-0
CuCl2·2H2O 10125-13-0
Ethanol 64-17-5   
FeSO4·7H2O 7782-63-0
H3BO3 10043-35-3
Isopropanol 69-63-0
KH2PO4 7778-77-0
KNO3 7757-79-1
LaCl3 10099-58-8
MgSO4·7H2O 10034-99-8
MnCl2·4H2O 13446-34-9
Na2CO3, sodium carbonate 497-19-8
Na2-EDTA 139-33-3
Na2HPO4 · 7H2O 7782-85-6
Na2MoO·2H2O 10102-40-6
NaCl, sodium chloride 7647-14-5
NiCl2·6H2O 7791-20-0
Phenol (90% solution in water) 108-95-2
PVP40, polyvinylpyrrolidone 9003-39-8
Tris-HCl 1185-53-1
ZnSO4·7H2O 7446-20-0
β-Mercaptoethanol 60-24-2
DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Brune, A., Frenzel, P., Cypionka, H. Life at the oxic-anoxic interface: microbial activities and adaptations. FEMS Microbiol Rev. 24 (5), 691-710 (2000).
  2. Auman, A. J., Stolyar, S., Costello, A. M., Lidstrom, M. E. Molecular characterization of methanotrophic isolates from freshwater lake sediment. Appl Environ Microbiol. 66 (12), 5259-5266 (2000).
  3. Whittenbury, R., Phillips, K. C., Wilkinson, J. F. Enrichment, isolation and some properties of methane-utilizing bacteria. J Gen Microbiol. 61 (2), 205-218 (1970).
  4. Koo, C., Rosenzweig, A. Biochemistry of aerobic biological methane oxidation. Chem Soc Rev. 50 (5), 3424-3436 (2021).
  5. Strong, P. J., Xie, S., Clarke, W. P. Methane as a resource: Can the methanotrophs add value. Environ Sci Technol. 49 (7), 4001-4018 (2015).
  6. Beals, D. G., Puri, A. W. Linking methanotroph phenotypes to genotypes using a simple spatially resolved model ecosystem. ISME J. 18 (1), wrae060 (2024).
  7. Bussmann, I., Rahalkar, M., Schink, B. Cultivation of methanotrophic bacteria in opposing gradients of methane and oxygen. FEMS Microbiol. Ecol. 56 (3), 331-344 (2006).
  8. Amaral, J. A., Knowles, R. Growth of methanotrophs in methane and oxygen counter gradients. FEMS Microbiol Lett. 126 (3), 215-220 (1995).
  9. Danilova, O. V., et al. A new cell morphotype among methane oxidizers: a spiral-shaped obligately microaerophilic methanotroph from northern low-oxygen environments. ISME J. 10 (11), 2734-2743 (2016).
  10. Ou, F., McGoverin, C., Swift, S., Vanholsbeeck, F. Absolute bacterial cell enumeration using flow cytometry. J Appl Microbiol. 123 (2), 464-477 (2017).
  11. Krause, S. M. B., et al. Lanthanide-dependent cross-feeding of methane-derived carbon is linked by microbial community interactions. Proc Natl Acad Sci USA. 114 (2), 358-363 (2017).
  12. Masuko, T., et al. Carbohydrate analysis by a phenol-sulfuric acid method in microplate format. Anal Biochem. 339 (1), 69-72 (2005).
  13. Felz, S., Al-Zuhairy, S., Aarstad, O. A., van Loosdrecht, M. C. M., Lin, Y. M. Extraction of structural extracellular polymeric substances from aerobic granular sludge. J Vis Exp. (115), e54534 (2016).
  14. Lee, P. Y., Costumbrado, J., Hsu, C. Y., Kim, Y. H. Agarose gel electrophoresis for the separation of DNA fragments. J Vis Exp. (62), e3923 (2012).
  15. Costa, O. Y. A., Raaijmakers, J. M., Kuramae, E. E. Microbial extracellular polymeric substances: Ecological function and impact on soil aggregation. Front Microbiol. 9, 1636 (2018).
  16. Sinke, A. J. C., Cottaar, F. H. M., Buis, K., Keizer, P. Methane oxidation by methanotrophs and its effects on the phosphate flux over the sediment-water interface in a eutrophic lake. Microb Ecol. 24 (3), 259-269 (1992).
  17. Murase, J., Frenzel, P. A methane-driven microbial food web in a wetland rice soil. Environ Microbiol. 9 (12), 3025-3034 (2007).
  18. Reim, A., Lüke, C., Krause, S., Pratscher, J., Frenzel, P. One millimetre makes the difference: High-resolution analysis of methane-oxidizing bacteria and their specific activity at the oxic-anoxic interface in a flooded paddy soil. ISME J. 6 (11), 2128-2139 (2012).
  19. Rahalkar, M., Bussmann, I., Schink, B. Methylosoma difficile gen. nov., sp. nov., a novel methanotroph enriched by gradient cultivation from littoral sediment of Lake Constance. Int J Syst Evol Microbiol. 57 (5), 1073-1080 (2007).
  20. Wang, L., Stegemann, J. P. Extraction of high-quality RNA from polysaccharide matrices using cetlytrimethylammonium bromide. Biomaterials. 31 (7), 1612 (2010).
  21. Liyanage, N. M. N., Chandrasekara, B. C. H. W. M., Bandaranayake, P. C. G. A CTAB protocol for obtaining high-quality total RNA from cinnamon (Cinnamomum zeylanicum Blume). 3 Biotech. 11 (4), 201 (2021).
  22. Semrau, J. D., DiSpirito, A. A., Gu, W., Yoon, S. Metals and methanotrophy. Appl Environ Microbiol. 84 (6), e02289-e02317 (2018).
  23. Zhang, S., et al. Salinity significantly affects methane oxidation and methanotrophic community in Inner Mongolia lake sediments. Front Microbiol. 13, 1067017 (2023).
  24. Fox, A. L., Trefry, J. H. Nutrient fluxes from recent deposits of fine-grained, organic-rich sediments in a Florida estuary. Front Mar Sci. , (2023).
  25. He, L., et al. A methanotrophic bacterium to enable methane removal for climate mitigation. Proc Natl Acad Sci. 120 (35), e2310046120 (2023).

Tags

Environmental Sciences
This article has been published
Video Coming Soon
Keep me updated:

.

PDF
DOI
DOWNLOAD MATERIALS LIST
Cite This Article
Beals, D. G., Puri, A. W. Agarose-Based Model Ecosystem for Cultivating Methanotrophs in a Methane-Oxygen Counter Gradient. J. Vis. Exp. (211), e67191, doi:10.3791/67191 (2024).
Download Citation
Reprints and Permissions

View Video

✖

To prove you're not a robot, please enter the text in the image below

CAPTCHA Image
Play CAPTCHA Audio
Refresh Image