النظام البيئي النموذجي القائم على الأغاروز لزراعة الميثانوتروف في تدرج مضاد للميثان والأكسجين
Summary
يتم وصف بروتوكول لإعداد نظام بيئي نموذجي بسيط يعيد إنشاء التدرج المضاد للميثان والأكسجين الموجود في الموائل الطبيعية للبكتيريا المؤكسدة للميثان الهوائية ، مما يتيح دراسة فسيولوجيتها في سياق يتم حله مكانيا. كما تم وصف التعديلات على المقايسات البيوكيميائية الشائعة للاستخدام مع النظام الإيكولوجي النموذجي القائم على الأغاروز.
Abstract
تلعب البكتيريا المؤكسدة للميثان الهوائية ، والمعروفة باسم الميثانوتروف ، أدوارا مهمة في الدورة البيوجيوكيميائية. تحتل الميثانوتروف مكانة بيئية محددة داخل تدرجات مضادة للميثان والأكسجين الموجودة في التربة والرواسب ، مما يؤثر على سلوكها على المستوى الفردي والمجتمعي. ومع ذلك ، فإن الطرق التقليدية لدراسة فسيولوجيا هذه الكائنات الحية الدقيقة المخففة لغازات الدفيئة غالبا ما تستخدم ثقافات العوالق المتجانسة ، والتي لا تمثل بدقة التدرجات المكانية والكيميائية الموجودة في البيئة. هذا يعيق فهم العلماء لكيفية تصرف هذه البكتيريا في الموقع. هنا ، يتم وصف نظام بيئي نموذجي بسيط وغير مكلف يسمى حقنة التدرج ، والذي يستخدم الأغاروز شبه الصلب لإعادة إنشاء التدرجات المضادة للميثان والأكسجين شديدة الانحدار المميزة للموائل الطبيعية للميثانوتروفس. تسمح المحقنة المتدرجة بزراعة سلالات ميثانوتروفية وإثراء اتحادات مختلطة مؤكسدة للميثان من عينات بيئية ، مما يكشف عن الأنماط الظاهرية المرئية فقط في هذا السياق الذي تم حله مكانيا. يبلغ هذا البروتوكول أيضا عن العديد من المقايسات الكيميائية الحيوية التي تم تعديلها لتكون متوافقة مع مصفوفة الأغاروز شبه الصلبة ، والتي قد تكون ذات قيمة للباحثين الذين يزرعون الكائنات الحية الدقيقة داخل الأنظمة الأخرى القائمة على الأغاروز.
Introduction
غالبا ما تخدم الكائنات الحية الدقيقة التي تعيش في واجهة نقص الأكسجين والأكسجين أدوارا بيئية مهمة1. أحد الأمثلة على ذلك هو البكتيريا المؤكسدة للميثان الهوائية (methanotrophs) ، والتي توجد في تدرجات مضادة للميثان والأكسجين في التربة والرواسب2. تمتلك هذه الكائنات الحية الدقيقة خصائص أيضية وفسيولوجية فريدة تمكنها من استغلال تدرجات الغاز الموجودة في بيئاتها وكانت موضوع بحث مستمر منذ عقود3،4،5. في الوقت الحالي ، تستند معظم الأبحاث المنشورة حول الميثانوتروف والمجتمعات المؤكسدة للميثان إلى العمل مع ثقافات العوالق المتجانسة التي غالبا ما تفشل في التقاط التدرجات المكانية والكيميائية المتأصلة في موائلها الميكروبية الطبيعية. يعيق هذا القيد فهمنا لعلم وظائف الأعضاء الميكروبية وقدرتنا على ربط المعلومات الجينومية بسمات النمط الظاهري.
يبلغ هذا البروتوكول عن نظام بيئي نموذجي بسيط قائم على المختبر يخلق ظروفا قابلة للتكرار لدراسة كل من الميثانوتروف المحددة ، مثل سلالة Methylomonas sp. LW13 ، والمجتمعات المؤكسدة للميثان مباشرة من عينات التربة البيئية. الأهم من ذلك ، أن الزراعة في حقنة التدرج تؤدي إلى أنماط ظاهرية خاصة بالتدرج المضاد غير موجودة في مزارع العوالقالمتجانسة 6 ، مما يسلط الضوء على قدرة النظام على الكشف عن جوانب جديدة من فسيولوجيا الميثانوتروف. مستوحاة من النظم الإيكولوجية النموذجيةالمنشورة سابقا 7،8،9 ، فإن حقنة التدرج هي طريقة مبسطة يمكن استخدامها لجمع المعلومات الكيميائية والجزيئية من الكائنات الحية الدقيقة المستزرعة باستخدام هذا النهج.
تم تعديل الإجراءات المبلغ عنها للتحليلات الجينية والكيميائية والجزيئية للعمل بشكل موثوق على الثقافات الميكروبية المزروعة داخل مصفوفة الأغاروز شبه الصلبة. قد تكون هذه الإجراءات مفيدة أيضا لتحليل البكتيريا المزروعة في أنظمة أخرى شبه صلبة قائمة على الأغاروز ، مثل تلك المستخدمة في فحوصات سباحة الأجار اللينة البكتيرية. قد يفتح تكييف هذه التحليلات مع السياقات التي تم حلها مكانيا طرقا جديدة لدراسة الحياة الميكروبية في بيئات أكثر صلة بالبيئة.
Protocol
Representative Results
Discussion
طرق زراعة الميثانوتروف
تمت دراسة Methanotrophs لعقود من الزمن لفهم فسيولوجيتها ، وسلوكها الفردي والمجتمعي في البيئة الطبيعية ، وقدرتها على التخفيف من الميثان في التطبيقات الصناعية. خلال هذه الدراسات ، تم إجراء الكثير من الأبحاث التي أجريت باستخدام ثقافات العوالق المتجانسة حيث يتم فقدان السياق المكاني. تم تطوير النظام البيئي لنموذج الحقن المتدرج لتكرار خاصية التدرج المضاد للميثان والأكسجين لموائل الميثانوتروف الطبيعية في المختبر ، مما يسمح للباحثين بدراسة نمو الميثانوتروف في بيئة تشبه إلى حد كبير المكان الذي تطورت فيه هذه الكائنات الحية.
على مدى السنوات ال 30 الماضية ، أعاد الباحثون إنشاء تدرج عداد الميثان والأكسجين في المختبر باستخدام مجموعة متنوعة من الطرق ، غالبا بهدف أساسي هو عزل وتصنيف الميثانوتروف من اتحادات مؤكسدة الميثان المختلطة. يمكن تقسيم هذه الطرق إلى طريقتين ، كلاهما ينطوي على استخدام غرف متعارضة من الميثان والأكسجين: تعليق التربة غير المضطربة نسبيا على غشاء16،17،18 ، أو تلقيح كميات صغيرة من التربة أو الثقافة البكتيرية النقية في وسط صغير في الأغاروز7،8،19. تجمع طريقة الحقن المتدرجة الموصوفة هنا بين النهج القائم على المحاقن ل Dedysh وزملاء العمل9 مع زراعة الميثانوتروف من العمل السابق من قبل Amaral و Knowles8 و Schink وزملاء العمل7. وضعت هذه الطرق الأخيرة الأساس لزراعة الميثانوتروف في تدرج مضاد للميثان والأكسجين واستخدمت تدفقا مستمرا من الميثان والأكسجين على جانبي سدادة الأغاروز. في حين أن هذا يوفر بيئة أكثر ثباتا ، فإن هذا النهج يضيف تعقيدا إلى الإعداد التجريبي ويتطلب مصادر غاز مخصصة.
في المقابل ، تعتمد المحقنة المتدرجة الموصوفة هنا على التنظيف اليومي للمحقنة لتوفير الميثان الطازج ، وهي عملية تستغرق أقل من دقيقة لكل حقنة ، مع توفير الوصول المستمر إلى الأكسجين الجوي من خلال طرف مرشح PTFE معقم. قد تمكن هذه الطريقة الأبسط من اعتماد هذا النظام البيئي النموذجي على نطاق أوسع لدراسة الميثانوتروف في سياق يتم حله مكانيا. يفصل البروتوكول الموصوف أيضا التحليلات الكيميائية والجزيئية التي يمكن إجراؤها مباشرة على البكتيريا المحتضنة في الأغاروز شبه الصلب. نتيجة لذلك ، لا تحتاج البكتيريا إلى استئصالها واستزراعها خارج مصفوفة الأغاروز قبل التحليل ، مما يحافظ على ظروف تدرج الغاز في وقت أخذ العينات.
ملاحظات على البروتوكول
نظرا لأن البكتيريا مستزرعة داخل حقنة حجمية من مادة البولي بروبيلين ، يمكن للباحثين استخدام مكبس المحقنة المصاحب لتقسيم سدادة الأغاروز بدقة وتكرار مع الحفاظ على السلامة المكانية لمصفوفة الأغاروز التي لا تزال موجودة في برميل المحقنة. بدون التصميم المحكم للهواء المتأصل في المحقنة ، ستحتاج سدادات الأغاروز إلى إزالتها من برميل المحقنة وتقطيعها إلى شرائح ، مما يؤدي إلى عدم اليقين في حجم شرائح الأغاروز ، وإطلاق كميات غير قابلة للقياس الكمي من الميثان والأكسجين المذاب في الغلاف الجوي. قذف الأغاروز من خلال إبرة معقمة يبسط تحضير العينة ويساعد على تجانس الأجزاء المبثوقة دون قص الخلايا البكتيرية. تسمح هذه الطريقة للباحثين بتقسيم كل حقنة متدرجة ملقحة إلى ثمانية أجزاء من الأغاروز على الأقل وإجراء تجارب موازية على الميثانو تروفس الذي ينمو في مجموعة من تركيزات الأكسجين والميثان.
في تحسين استخراج الحمض النووي الريبي من محتوى السكاريد العالي ، وجد أن الكواشف الشائعة مثل ثيوسيانات جوانيديوم وتريزول أدت إلى هلام الأغاروز ، الذي أعاق أعمدة التنقية وقاوم التكوير عن طريق الطرد المركزي. كانت غلة الحمض النووي الريبي المنخفضة وجودتها مصدر قلق أيضا لأن جزيئات السكاريد الكبيرة يمكن أن تحبس الأحماض النووية بينما يمكن أن تترسب السكريات الصغيرة مع الحمض النوويالريبي 20. بدلا من ذلك ، تم استخدام مخزن استخراج يحتوي على الفاعل بالسطح الكاتيوني CTAB ، والذي يذيب الأغشية الدهنية20 ؛ وكلوريد الصوديوم، الذي يمنع تكون معقدات الحمض النووي CTAB، ويسمح للأحماض النووية بالترسب، لكنه يحتفظ بمتعددات السكريات في المحلول21. تم تغيير طبيعة RNases عن طريق إدراج β-mercaptoethanol في المخزن المؤقت CTAB. بالنسبة لتجربة RNA-seq ، تم تضمين خطوة تنقية اختيارية قائمة على العمود لاستبعاد الحمض النووي الريبي الصغير (<200 نيوكليوتيدات) قبل إعداد المكتبة.
القيود والاعتبارات
في حين أن NMS والأغاروز يوفران مصفوفة متوسطة دنيا لزراعة البكتيريا الميتانوتروفية ، فإن المحقنة المتدرجة كما هو موضح هنا تعيد فقط إنشاء التدرجات الغازية للموائل الميتانوتروفية ، ولكن ليس التدرجات الأخرى الموجودة في تلك البيئات مثل المعادن النزرة22 أو الملوحة23 أو العناصر الغذائية الأخرى24. من الممكن إضافة هذه التدرجات إلى نظام مماثل في المستقبل. بالإضافة إلى ذلك ، فإن حجم المحقنة (8 مل من الأغاروز) يحد من الكتلة الحيوية الكلية لكل حقنة ، مما يستلزم تجميع محاقن متعددة لبعض التحليلات (كما هو موضح في الخطوة 5.16). على الرغم من أن المحقنة المحمولة تقسم الأغاروز بشكل ملائم إلى حصص 1 مل ، إلا أن حجمها يحد أيضا من مساحة الرأس إلى حوالي 4 مل ، مما يحد من كمية الميثان السائبة التي يمكن تخزينها للميكروبات المزروعة. نظرا لأن معدلات أكسدة الميثان تتناسب مع معدل نمو الميثانوتروف الهوائية25 ، يوصى بالتجديد اليومي لميثان فراغ الرأس. في حين أن هذا قد لا يزال يؤدي إلى فترات من الحد من الميثان ، فإن هذه الفترات قابلة للتكرار في المختبر ومن المحتمل أن تحاكي المواقف الموجودة في البيئات الطبيعية.
أثناء استخدام المحقنة المتدرجة ، فإن وجود السكريات الأغاروز يستلزم بعض التعديلات على المقايسات المستخدمة لتحليل الميثانوتروف المزروع في هذا النظام. على سبيل المثال ، تحتاج البروتوكولات التي تتطلب نقل كميات صغيرة من الأغاروز المبثوق إلى خطوات تخفيف متعددة مع تجانس شامل بين كل تخفيف لسحب دقيق للسحب. بالإضافة إلى ذلك ، في حالات مثل مقايسة السكريات حيث تتفاعل السكريات المتأصلة في مصفوفة الأغاروز مع كاشف حمض الكبريتيك والفينول ، فإن إدراج عنصر تحكم سلبي معقم خال من الخلايا من الأغاروز أمر ضروري. لم تنجح المحاولات المبكرة للتخفيف من هذه المشكلات من خلال تضمين إنزيم الأغاروز المتحلل بالماء β-agarase وقدمت متغيرا غير معروف للتجارب البيولوجية. يمكن استخدام العديد من النسخ المتماثلة التقنية ، والتخفيف الشامل ، والتجانس ، وإدراج الضوابط للتخفيف من معظم التحديات الكامنة في مصفوفة الأغاروز.
التطبيقات
بالإضافة إلى دراسات السلالة الواحدة ، يمكن أن تدعم حقنة التدرج الزراعة المشتركة لسلالات متعددة ، ويمكن استخدام التربة كلقاح بدلا من الثقافة البكتيرية النقية. التصميم البسيط للنظام البيئي لنموذج حقنة التدرج قابل لثقافة أنواع أخرى من الكائنات الحية الدقيقة الموجودة في الواجهة بين بيئات نقص الأكسجين والأكسجة باستخدام ركيزة غازية مختلفة ، مثل H2 أو CO ، بدلا من الميثان. باختصار ، يسمح استخدام نظام بيئي نموذجي بسيط تم حله مكانيا للباحثين بدراسة علم وظائف الأعضاء الفريد والتكيفات الأيضية للكائنات الحية الدقيقة غير المؤكسجة ويمكن استخدامها لربط الجينات بالأنماط الظاهرية للكائنات الحية.
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
تم دعم هذا العمل من خلال تمويل بدء التشغيل من قسم الكيمياء بجامعة يوتا وجائزة NSF CAREER #2339190. نشكر أعضاء مختبر بوري على المناقشات المفيدة. نشكر راشيل هوريل (جامعة يوتا) على التوجيه الأولي لتجربة قياس التدفق الخلوي.
Materials
| 1% Gas mix analytical standard | Supelco | 22561 | 1% each component in nitrogen: carbon monoxide, carbon dioxide, hydrogen, methane and oxygen |
| 100% Methane | Airgas | ME CP300 | chemically pure grade |
| 15 ppm Gas mix analytical standard | Supelco | 23470-U | 15 ppm each component in nitrogen: methane, ethane, ethylene, acetylene, propane, propylene, propyne, and n-butane |
| 1x Nitrate mineral salts | see CAS numbers below | Dissolve the following in Mili-Q water and autoclave: 0.2 g/L MgSO4·7H2O, 0.2 g/L CaCl2·6H2O, 1 g/L KNO3, and 30 μM LaCl3. Before use, add trace elements to a 1X final concentration and phosphate buffer (pH 6.8) to a final concentration of 5.8 mM. | |
| 23 G needle | BD Biosciences | 305194 | sterile, Luer-Lok |
| 500x Trace elements | see CAS numbers below | Dissolve the following in Milli-Q water: 1.0 g/L Na2-EDTA, 2.0 g/L FeSO4·7H2O, 0.8 g/L ZnSO4·7H2O, 0.03 g/L MnCl2·4H2O, 0.03 g/L H3BO3, 0.2 g/L CoCl2·6H2O, 0.6 g/L CuCl2·2H2O, 0.02 g/L NiCl2·6H2O, and 0.05 g/L Na2MoO·2H2O. | |
| 96 Well plate | CELLTREAT | 229596 | sterile |
| Acid phenol:chloroform:IAA (125:24:1) | Invitrogen | AM9720 | pH 4.5 |
| Agarose | Fisher Scientific | BP160 | molecular biology grade, CAS 9012-36-6 |
| Aluminum crimp seals | VWR | 30618-460 | 20 mm |
| Bead beater | Qiagen | 9003240 | TissueLyser III |
| Butyl rubber stopper | Chemglass Life Science | 50-143-854 | 20 mm, blue |
| Chloroform:isoamyl alcohol (24:1) | Millipore Sigma | 25666 | BioUltra, for molecular biology |
| Clark-type O2 microelectrode | Unisense | OX-500 | |
| DEPC-treated water | Thermo Scientific | R0601 | |
| DNase I (Ambion) | Invitrogen | AM2222 | |
| Flow cytometer | Beckman Coulter | CytoFLEX | |
| Gas chromatograph (flame ionization detection) | Agilent | 6890N | |
| Gastight analytical syringe | Hamilton | 81220 | 1750 TLL |
| Gastight analytical syringe needle | Hamilton | 7729-07 | 22 G, metal hub needle, 2 in, point style 5 |
| Gas-tight vials | Labco | 938W | Exetainer vial: 12 mL, round bottom |
| Glass culture tubes | Bellco Glass | 2048-00150 | 18 x 150 mm |
| LiCl precipitation solution (7.5 M) | Invitrogen | AM9480 | |
| One-way stopcock | VWR | MFLX30600-00 | inlet port: female luer, outlet port: male luer lock |
| Petri dish, square | Fisher Scientific | FB0875711A | 100 x 100 mm |
| Phosphate buffer, 0.2 M (pH 6.8) | see CAS numbers below | Dissolve the following in Milli-Q water and autoclave: 12.24 g/L KH2PO4, 26.29 g/L Na2HPO4 · 7H2O | |
| Pierce BCA Protein Assay Kit | Thermo Scientific | 23225 | |
| PTFE syringe filter tip | Thermo Scientific | 03-050-469 | hydrophobic, pore size: 0.2 µm, diameter: 4 mm |
| Qubit 1x dsDNA High Sensitivity Assay Kit | Invitrogen | Q33230 | |
| Qubit 4 Fluorometer | Invitrogen | Q33238 | |
| RNA Clean & Concentrator-5 | Zymo Research | R1013 | |
| Serum stopper | Fisher Scientific | 03-340-302 | 20 mm |
| Syringe | BD Biosciences | 302995 | Luer-Lock, 10 mL, single use, sterile |
| Syringe pump | New Era Pump Systems Inc. | 1000-US | NE-1000 one channel programmable |
| SYTO9, propidium iodide, microspheres | Invitrogen | L34856 | LIVE/DEAD BacLight Bacterial Viability Kit |
| Zirconia/silica beads | BioSpec Products | 11079101z | 0.1 mm diameter |
| Chemical reagents | CAS number | ||
| CaCl2·6H2O | 7774-34-7 | ||
| CoCl2·6H2O | 7791-13-1 | ||
| Concentrated sulfuric acid | 7664-93-9 | ||
| CTAB, cetrimonium bromide | 57-09-0 | ||
| CuCl2·2H2O | 10125-13-0 | ||
| Ethanol | 64-17-5 | ||
| FeSO4·7H2O | 7782-63-0 | ||
| H3BO3 | 10043-35-3 | ||
| Isopropanol | 69-63-0 | ||
| KH2PO4 | 7778-77-0 | ||
| KNO3 | 7757-79-1 | ||
| LaCl3 | 10099-58-8 | ||
| MgSO4·7H2O | 10034-99-8 | ||
| MnCl2·4H2O | 13446-34-9 | ||
| Na2CO3, sodium carbonate | 497-19-8 | ||
| Na2-EDTA | 139-33-3 | ||
| Na2HPO4 · 7H2O | 7782-85-6 | ||
| Na2MoO·2H2O | 10102-40-6 | ||
| NaCl, sodium chloride | 7647-14-5 | ||
| NiCl2·6H2O | 7791-20-0 | ||
| Phenol (90% solution in water) | 108-95-2 | ||
| PVP40, polyvinylpyrrolidone | 9003-39-8 | ||
| Tris-HCl | 1185-53-1 | ||
| ZnSO4·7H2O | 7446-20-0 | ||
| β-Mercaptoethanol | 60-24-2 |
References
- Brune, A., Frenzel, P., Cypionka, H. Life at the oxic-anoxic interface: microbial activities and adaptations. FEMS Microbiol Rev. 24 (5), 691-710 (2000).
- Auman, A. J., Stolyar, S., Costello, A. M., Lidstrom, M. E. Molecular characterization of methanotrophic isolates from freshwater lake sediment. Appl Environ Microbiol. 66 (12), 5259-5266 (2000).
- Whittenbury, R., Phillips, K. C., Wilkinson, J. F. Enrichment, isolation and some properties of methane-utilizing bacteria. J Gen Microbiol. 61 (2), 205-218 (1970).
- Koo, C., Rosenzweig, A. Biochemistry of aerobic biological methane oxidation. Chem Soc Rev. 50 (5), 3424-3436 (2021).
- Strong, P. J., Xie, S., Clarke, W. P. Methane as a resource: Can the methanotrophs add value. Environ Sci Technol. 49 (7), 4001-4018 (2015).
- Beals, D. G., Puri, A. W. Linking methanotroph phenotypes to genotypes using a simple spatially resolved model ecosystem. ISME J. 18 (1), wrae060 (2024).
- Bussmann, I., Rahalkar, M., Schink, B. Cultivation of methanotrophic bacteria in opposing gradients of methane and oxygen. FEMS Microbiol. Ecol. 56 (3), 331-344 (2006).
- Amaral, J. A., Knowles, R. Growth of methanotrophs in methane and oxygen counter gradients. FEMS Microbiol Lett. 126 (3), 215-220 (1995).
- Danilova, O. V., et al. A new cell morphotype among methane oxidizers: a spiral-shaped obligately microaerophilic methanotroph from northern low-oxygen environments. ISME J. 10 (11), 2734-2743 (2016).
- Ou, F., McGoverin, C., Swift, S., Vanholsbeeck, F. Absolute bacterial cell enumeration using flow cytometry. J Appl Microbiol. 123 (2), 464-477 (2017).
- Krause, S. M. B., et al. Lanthanide-dependent cross-feeding of methane-derived carbon is linked by microbial community interactions. Proc Natl Acad Sci USA. 114 (2), 358-363 (2017).
- Masuko, T., et al. Carbohydrate analysis by a phenol-sulfuric acid method in microplate format. Anal Biochem. 339 (1), 69-72 (2005).
- Felz, S., Al-Zuhairy, S., Aarstad, O. A., van Loosdrecht, M. C. M., Lin, Y. M. Extraction of structural extracellular polymeric substances from aerobic granular sludge. J Vis Exp. (115), e54534 (2016).
- Lee, P. Y., Costumbrado, J., Hsu, C. Y., Kim, Y. H. Agarose gel electrophoresis for the separation of DNA fragments. J Vis Exp. (62), e3923 (2012).
- Costa, O. Y. A., Raaijmakers, J. M., Kuramae, E. E. Microbial extracellular polymeric substances: Ecological function and impact on soil aggregation. Front Microbiol. 9, 1636 (2018).
- Sinke, A. J. C., Cottaar, F. H. M., Buis, K., Keizer, P. Methane oxidation by methanotrophs and its effects on the phosphate flux over the sediment-water interface in a eutrophic lake. Microb Ecol. 24 (3), 259-269 (1992).
- Murase, J., Frenzel, P. A methane-driven microbial food web in a wetland rice soil. Environ Microbiol. 9 (12), 3025-3034 (2007).
- Reim, A., Lüke, C., Krause, S., Pratscher, J., Frenzel, P. One millimetre makes the difference: High-resolution analysis of methane-oxidizing bacteria and their specific activity at the oxic-anoxic interface in a flooded paddy soil. ISME J. 6 (11), 2128-2139 (2012).
- Rahalkar, M., Bussmann, I., Schink, B. Methylosoma difficile gen. nov., sp. nov., a novel methanotroph enriched by gradient cultivation from littoral sediment of Lake Constance. Int J Syst Evol Microbiol. 57 (5), 1073-1080 (2007).
- Wang, L., Stegemann, J. P. Extraction of high-quality RNA from polysaccharide matrices using cetlytrimethylammonium bromide. Biomaterials. 31 (7), 1612 (2010).
- Liyanage, N. M. N., Chandrasekara, B. C. H. W. M., Bandaranayake, P. C. G. A CTAB protocol for obtaining high-quality total RNA from cinnamon (Cinnamomum zeylanicum Blume). 3 Biotech. 11 (4), 201 (2021).
- Semrau, J. D., DiSpirito, A. A., Gu, W., Yoon, S. Metals and methanotrophy. Appl Environ Microbiol. 84 (6), e02289-e02317 (2018).
- Zhang, S., et al. Salinity significantly affects methane oxidation and methanotrophic community in Inner Mongolia lake sediments. Front Microbiol. 13, 1067017 (2023).
- Fox, A. L., Trefry, J. H. Nutrient fluxes from recent deposits of fine-grained, organic-rich sediments in a Florida estuary. Front Mar Sci. , (2023).
- He, L., et al. A methanotrophic bacterium to enable methane removal for climate mitigation. Proc Natl Acad Sci. 120 (35), e2310046120 (2023).
.