מודל אקולוגי מבוסס אגרוז לטיפוח מתאנוטרופים בשיפוע מונה מתאן-חמצן

פרטי הריאגנטים והציוד ששימש במחקר מפורטים בטבלת החומרים. 1. הכנה ושחול של מזרקים הדרגתיים הערה: הכנת מזרק הדרגתי צריכה להתבצע בטכניקה סטרילית. השתמש במספר מושבות של Methylomonas sp. LW13 שגדל טרי על צלחת כדי לחסן 6 מ”ל של מלחים מינרליים חנקתיים (NMS) בינוני בצינור זכוכית בגודל 18 מ”מ x 150 מ”מ. אטמו את הצינור עם פקק בסרום ואטם אלומיניום, והוסיפו מתאן באמצעות מזרק לאטמוספירה סופית של 50% (v/v) מתאן באוויר. נערו את התרבית הנוזלית הפלנקטונית הזו ב-200 סל”ד בטמפרטורת החדר עד לעכירות (בערך יום אחד). מעבר תרביות נוזליות 1:10 למדיה רעננה. המשך גידול תרביות נוזליות של מתאנוטרופים לגידול שלב לוג (OD600 של ~0.5) והתאם ל- OD600 =1.0. הכינו מזרקים על ידי הסרת הבוכנה הנלווית ושמירתם במיכל סטרילי. חברו קצה מסנן PTFE סטרילי למזרק והניחו אותו במדף מבחנה סטנדרטי כשהקצה פונה כלפי מטה. עבור כל מזרק 10 מ”ל, יש לערבב היטב 1 מ”ל תאים משלב 1.2 עם 5 מ”ל NMS ו-4 מ”ל אגרוז מותך (0.5% m/v, מקורר ל-55°C) בצינור חרוטי סטרילי. ניתן להגדיל נפחים אלה כדי למלא מזרקים מרובים במקביל. לאט לשפוך או להשתמש פיפט סרולוגי להוסיף את התערובת לכל מזרק, עד סימון 8 מ”ל. אפשר לאגרוז בתוך מזרקים להתמצק (~ 15 דקות), ואז מכסים עם פקק בוטיל גומי סטרילי בקוטר 20 מ”מ. הדקו את הפקק למזרק באמצעות סרט מעבדה ותייגו אותו בתכולת מזרק. כדי להוסיף מתאן למרווח הראש של המזרק, מלא מזרק גדול (60 מ”ל) עם 100% CH4 וחבר קצה מסנן PTFE (0.2 מיקרומטר, 25 מ”מ) המחובר למחט סטרילית (23 גרם). ניקבו את פקק הגומי עם המזרק הגדול ונקבו מחט סטרילית שנייה דרך הפקק ליצירת יציאת גז. לחץ על הבוכנה על המזרק הגדול כדי לאפשר 20 מ”ל של 100% CH4 לשטוף דרך חלל הראש, דואג להסיר את מחט היציאה כאשר נשאר 1-2 מ”ל של CH4 במזרק הגדול כדי למנוע זרימת חמצן דרך מחט היציאה. לדגור על מזרקים ב 18 ° C, לחזור על שלבים 1.6 ו 1.7 מדי יום כדי לחדש את המתאן. כדי להבליט אגרוז, החלף את קצה מסנן PTFE במחט סטרילית של 23 גרם והחלף את פקק הגומי בבוכנת המזרק שסופקה. לחץ באיטיות על הבוכנה כדי לחלק מרווחים של 1 מ”ל לצינורות מיקרוצנטריפוגות סטריליים נפרדים של 1.5 מ”ל. 2. קביעת ריכוזי גזי שיפוע נגדיים מדידת שיפוע החמצן המומסהשתמש בסכין גילוח כדי לחתוך לרוחב מזרק מלא אגארוז (שהוכן לפי שלבים 1.1-1.8) קרוב למסנן PTFE. הדקו את המזרק הפתוח למשאבת מזרק המכוונת למיקרואלקטרודה מסוג קלארק, כאשר הקצה הפתוח פונה לקצה האלקטרודה. התאם את ההגדרות של משאבת המזרק כדי להזיז את המזרק לכיוון המיקרואלקטרודה בקצב של 1 מ”ל/דקה (0.6 ס”מ לדקה); התחל להקליט את מדידות החמצן המומס בתוכנת Unisense Logger ברגע שמשאבת המזרק מתחילה לנוע. מדידת שיפוע המתאןמיד לפני השחול, החלף את קצה מסנן המזרק בסטפקוק חד כיווני המחובר למחט 23 גרם, והחלף במהירות את פקק הגומי בבוכנה מזרק. הוסף שמונה עלי אגרוז 1 מ”ל לבקבוקונים אטומים לגז שפונו 12 מ”ל ואפשר לדגימות להתאזן בטמפרטורת החדר למשך שעה אחת. אזנו את בקבוקוני הדגימה ללחץ אטמוספרי על ידי פיצוח פתיחה ואטימה מחדש מיידית של בקבוקונים או פירסינג והסרה מהירה של מחט. הזריקו 500 מיקרוליטר של מרווח ראש בקבוקון לכרומטוגרף גז עם זיהוי יינון להבה (GC-FID) באמצעות מזרק אטום לגז. צור עקומת כיול הנגזרת מתקני CH4 כדי להמיר שטח שיא (pA*min) ל- μmol/L. 3. ספירת תאים במזרק ההדרגתי ציטומטריית זרימהלהוציא 1 מ”ל של מקטעי אגרוז ממזרקים הדרגתיים שחוסנו ב-LW13 פראי או מוטנטי כמתואר בשלב 1.9. כמו כן, הכינו והוציאו אגרוז ממזרק סטרילי ללא תאים כבקרה שלילית. הוסף 0.75 מ”ל של 0.85% (m/v) NaCl במים לכל דגימות האגרוז המורחבות והומוגניזציה על ידי מערבולות. יתר על כן, לדלל דגימות 1:10 על ידי העברת 100 μL לתוך צינור מיקרוצנטריפוגה חדש והוספת 900 μL של תמיסת מלח. הוסיפו 3 μL של תערובת 1:1 של כתמי SYTO9 ופרופידיום יודיד, ולאחר מכן דגרו בחושך בטמפרטורת החדר למשך 15 דקות. כדי לקבוע את התאים לכל מ”ל של agarose, sonicate מיקרוספירה ספירת חרוזים השעיה באמבט מים במשך 5 דקות. לאחר מכן, הוסף 10 μL של התרחיף לכל דגימה לפני ניתוח ציטומטריית זרימה. נתח דגימות עם ציטומטר זרימה10,11 עם הפרמטרים הבאים: הפעלת פלואורסצנטיות ירוקה, קצב זרימה של 10 μL/s וקצב ניתוח חלקיקים מתחת ל-1,000 חלקיקים לשנייה.השוואה בין SSC ל- נקודות FITC מתחלקות בין דגימות בקרה נטולות תאים לבין דגימות אגרוז מחוסנות כדי לצייר שערי מתח “אירוע חיידקי” שאינם כוללים חלקיקי אגרוז ברקע. בנוסף, ציירו שערי מתח עבור חרוזי ספירת המיקרספירה, אשר צריכים להיות עקביים בין הדגימות. כדי לקבוע את ריכוז התאים בכל מקטע אגרוז בתוך מזרק השיפוע, השתמש במשוואה הבאה, וציין כי גורם הדילול עבור הפרוטוקול לעיל הוא 17.7275 וכי 10-6 מ”ל הוא נפח של חרוז מיקרוספירה אחד. ספירת יחידות יוצרות מושבה בתוך מזרק השיפועשלטו 1 מ”ל של מקטעי אגרוז לצינורות מיקרוצנטריפוגות נפרדים וסטריליים של 2 מ”ל, הוסיפו 800 מיקרוליטר של NMS, ומערבולות במשך 10 שניות כדי לסייע בפיפט. הכינו צלחת סטרילית של 96 בארות על ידי הוספת 180 מיקרוליטר NMS לכל באר. מוסיפים 20 μL של דגימות אגרוז מדוללות לכל באר בטור הראשון ופיפט לערבוב. באמצעות פיפטה רב-ערוצית, מדללים דגימות סדרתיות פי עשרה על ידי העברת 20 μL מהשורה הראשונה של הבארות לשורה השנייה של הבארות וצנרת 10 פעמים כדי לערבב. המשך בתהליך זה עד לשורה האחרונה של הצלחת. תייג לוחות רשת מרובעים המכילים NMS, אגר או מדיה לפי בחירה. בעזרת פיפטה רב ערוצית, מאתרים 5 μL מעמוד של צלחת 96 בארות על צלחת האגר. בהתאם לגודל צלחת האגר, ניתן להבחין במספר עמודות על אותה צלחת. לדגור על לוחות מתחת ל-40% מתאן באוויר ולגדול ב-18°C. ספרו מושבות חיידקים לאחר 2-3 ימים וקבעו את היחידות יוצרות המושבה למיליליטר (CFU/mL). 4. בדיקות זיהוי ביומולקולות בדיקת פוליסכרידהוציאו 1 מ”ל של מקטעי אגרוז לצינורות מיקרוצנטריפוגות נפרדים של 2 מ”ל וערבבו עם 1 מ”ל של תמיסת 1% (m/v) Na2CO3 במים. מחממים דגימות ל-80°C למשך 30 דקות עם מערבולות כל 5-10 דקות, ולאחר מכן צנטריפוגה ב-4,000 x גרם ב-4°C למשך 20 דקות. לאסוף את supernatant בשילוב עם שלושה נפחים של 100% אתנול ולדגור ב 20 ° C לפחות 2 שעות (או לילה). אספו את הרב-סוכרים המואצים באתנול באמצעות צנטריפוגה בטמפרטורה של 16,100 x גרם ב-4°C למשך 30 דקות. מוציאים את הסופרנאטנט ומייבשים את הכדורית באוויר. להשעות מחדש את הגלולה ב 100 μL של מים deionized. מדוד את תכולת הרב-סוכר היחסית של כל מקטע אגרוז באמצעות בדיקה קולורימטרית של חומצה פנול-גופרתית12,13. ערבבו 50 μL של תמצית מרחפים עם 150 μL של חומצה גופרתית מרוכזת ו 30 μL של 5% (v/v) פנול במים בצלחת שקופה של 96 בארות. מדוד את הספיגה ב- 490 ננומטר באמצעות קורא מיקרו-לוחות וחשב את תכולת הרב-סוכר היחסית של כל מקטע אגרוז כאחוז מהספיגה של מקטע האגרוז הקרוב ביותר למסנן PTFE. בדיקת חלבוןהוציאו את האגרוז לצינורות מיקרוצנטריפוגות נפרדים של 1.5 מ”ל והעבירו 100 מיקרוליטר מכל אליקוט למבחנות זכוכית. קבע את ריכוז החלבון הכולל באמצעות פרוטוקול המבחנה של ערכת בדיקת חלבון BCA. הכינו אלבומין תקני BSA עם אגרוז שהושחל ממזרק סטרילי כמדלל. בדיקת DNA חוץ-תאישלטו את האגרוז לצינורות מיקרוצנטריפוגות נפרדים של 1.5 מ”ל והעבירו 20 מיקרו-ליטר מכל אחד לצינורות מיקרוצנטריפוגות של 0.2 מ”ל. מדוד ריכוזי DNA באמצעות ערכת הבדיקה 1x dsDNA בעלת רגישות גבוהה הזמינה מסחרית בהתאם לפרוטוקול היצרן. 5. מיצוי RNA הכן את מאגר המיצוי על ידי שילוב הדברים הבאים ב 800 מ”ל של מים ללא RNase: 2.0 גרם של CTAB, 2.0 גרם של polyvinylpyrrolidone (PVP 40), 81.8 גרם של NaCl, 100 mM של Tris-HCl (pH 8.0), ו 20 mM של EDTA. להעלות את עוצמת הקול ל 1 L ו autoclave; יש לאחסן ב-4°C. Aliquot את מאגר מיצוי מוכן ולהוסיף 1% (v/v) ריכוז סופי של בטא מרקפטואתנול ממש לפני השימוש. חממו את החיץ ל-65°C באמצעות אמבט מים או בלוק חום. חלק כל מזרק שיפוע ל -1 מקטעים מ”ל על ידי שחול אגרוז לצינורות מיקרוצנטריפוגות נפרדים ללא RNase 2 מ”ל לאחר ההליך בשלב 1.9. דגימות צנטריפוגות בטמפרטורה של 21,000 x גרם, 4°C, למשך 15 דקות ומשליכות את הסופרנטנט, תוך שמירה על דגימות על קרח. הוסף 600 μL של חיץ מיצוי שחומם מראש לכל גלולה 1 מ”ל של אגרוז מושחל. הוסיפו כ-200 מיקרוליטר של חרוזי זירקוניה/סיליקה וצרו הומוגניות במשך 3 דקות במהירות של 30 הרץ/שנייה באמצעות מקציף חרוזים, ועצרו באמצע הדרך כדי להניח דגימות על קרח למשך 2 דקות. צנטריפוגה את הדגימות ב 15,000 x גרם, 4 ° C, במשך 2 דקות כדי להפחית קצף. לחלץ דגימות על ידי הוספת 600 μL של כלורופורם: אלכוהול איזואמיל (24: 1) לצינורות מערבולות במשך 10 שניות. צנטריפוגה הדגימות ב 15,000 x גרם, 4 ° C, במשך 8 דקות. מעבירים בזהירות את הפאזה המימית העליונה לצינור מיקרוצנטריפוגה חדש ללא RNase ומוסיפים 600 μL של כלורופורם: אלכוהול איזואמיל (24:1) לשלב העליון המועבר ולמערבולת למשך 10 שניות. צנטריפוגות הדגימות ב 15,000 x גרם, 4 ° C, במשך 8 דקות ולהעביר את הפאזה המימית העליונה החדשה לצינור מיקרוצנטריפוגה חדש ללא RNase. הוסף נפח שווה של איזופרופנול לשלב העליון המועבר ודגר על דגימות במשך מספר שעות ב -20 ° C. אופציונלי: דגימות ניתן להשאיר ב -20 °C למשך הלילה. איסוף משקעים המכילים RNA על ידי דגימות צנטריפוגות ב 16,100 x גרם, 4 ° C במשך 30 דקות. השליכו את הסופרנאטנט ושטפו את הגלולה עם 300 מיקרוליטר אתנול קר 75% (v/v) המיוצר עם מים וצנטריפוגות נטולי RNase בטמפרטורה של 16,100 x גרם, 4°C, למשך 5 דקות. שטפו שוב את הכדוריות לאחר שלב 5.10. לאחר הסרת הסופרנטנט אתנול, הניחו לכדוריות להתייבש באוויר במשך 15 דקות. ממיסים כדוריות ב-100 מיקרוליטר מים נטולי RNase. יש לטפל בדגימות עם DNase I בטמפרטורה של 37°C למשך 30 דקות בהתאם לפרוטוקול היצרן. השבתת DNase I על ידי הוספת 300 μL של פנול חומצה: כלורופורם: IAA (125:24:1, pH 4.5). מערבלים במשך 10 שניות ודגרים בטמפרטורת החדר במשך 5 דקות. צנטריפוגה ב 16,100 x גרם, 4 ° C, במשך 5 דקות ולשמור על הפאזה המימית העליונה על ידי העברתו לצינור מיקרוצנטריפוגה חדש ללא RNase. אופציונלי: מאגר RNA מאותו מקטע על פני כל מזרקי ההעתקה על ידי שילוב השלבים העליונים לתוך צינור חרוט. הוסף נפח אחד של איזופרופנול השווה לנפח הפאזה העליונה המכילה RNA והוסף 7.5 M של LiCl לריכוז סופי של 0.8 M, היפוך מספר פעמים כדי לערבב. לדגור את הדגימות במשך מספר שעות ב -20 מעלות צלזיוס. אופציונלי: דגימות ניתן להשאיר ב -20 °C למשך הלילה. צנטריפוגו את הדגימות במהירות של 16,100 x גרם, 4 מעלות צלזיוס, למשך 15 דקות והשליכו בזהירות את הסופרנטנט. שטפו את הגלולה המכילה RNA פעמיים על ידי הוספת אתנול קר 70% (v/v) במים נטולי RNase, צנטריפוגה ב 16,100 x גרם, 4 °C, במשך 5 דקות, והסרת supernatant. הניחו לכדוריות להתייבש באוויר בטמפרטורת החדר למשך 10 דקות והשהו מחדש ב-50 מיקרוליטר מים נטולי RNase. אחסן את דגימות ה- RNA ב -80 ° C. אופציונלי, בהתאם לאיכות הרנ”א: ניתן לטהר מחדש דגימות באמצעות ערכת טיהור RNA כדי להסיר רנ”א קטן (<200 nt). כדי לוודא שדגימות RNA אינן מכילות שאריות DNA, השתמש ב- 1 μL של RNA מטוהר כתבנית להגברת PCR באמצעות פריימרים אוניברסליים של גן rRNA 16S חיידקי 27F/1492R. כלול שתי תגובות PCR נוספות המכילות 1 μL של DNA גנומי (1:100 מדולל) או מים נטולי נוקלאז שישמשו כבקרות חיוביות ושליליות, בהתאמה. הפעל את המוצרים על ג’ל TBE אגרוז 1% באמצעות אלקטרופורזה ג’ל14.הערה: דגימות RNA ללא זיהום DNA אמורות לגרום להיעדר פס בנתיב הדגימה. אם דגימות RNA מראות זיהום DNA, עבד מחדש את הדגימות החל משלב 5.13. RNA מוכן לניתוח במורד הזרם וניתן לנתח אותו באופן אופציונלי כדי לכמת את שלמותו על ידי מדידת מספר שלמות RNA (RIN).