JoVE Journal > Environment
Summary
Abstract
Introduction
Protocol
Results
Discussion
Disclosures
Acknowledgements
Materials
References
Nederlands

Automatically Generated
Please note that all translations are automatically generated. Click here for the English version.
Environment

Op agarose gebaseerd modelecosysteem voor het kweken van methanotrofen in een methaan-zuurstof-tegengradiënt

Published: September 06, 2024
doi:
10.3791/67191
,
1Department of Chemistry and the Henry Eyring Center for Cell and Genome Science,University of Utah

Summary

Er wordt een protocol beschreven voor het voorbereiden van een eenvoudig modelecosysteem dat de methaan-zuurstof-tegengradiënt nabootst die wordt aangetroffen in de natuurlijke habitat van aërobe methaanoxiderende bacteriën, waardoor hun fysiologie in een ruimtelijk opgeloste context kan worden bestudeerd. Modificaties van gangbare biochemische assays voor gebruik met het op agarose gebaseerde modelecosysteem worden ook beschreven.

Abstract

Aërobe methaanoxiderende bacteriën, bekend als methanotrofen, spelen een belangrijke rol in de biogeochemische cyclus. Methanotrofen bezetten een specifieke milieuniche binnen methaan-zuurstof-tegengradiënten die in bodems en sedimenten worden aangetroffen, wat hun gedrag op individueel en gemeenschapsniveau beïnvloedt. Conventionele methoden om de fysiologie van deze broeikasgasbeperkende micro-organismen te bestuderen, maken echter vaak gebruik van homogene planktonische culturen, die de ruimtelijke en chemische gradiënten die in het milieu worden aangetroffen niet nauwkeurig weergeven. Dit belemmert het begrip van wetenschappers over hoe deze bacteriën zich in situ gedragen. Hier wordt een eenvoudig, goedkoop modelecosysteem beschreven, de gradiëntspuit genaamd, die halfvaste agarose gebruikt om de steile methaan-zuurstof-tegengradiënten na te bootsen die kenmerkend zijn voor de natuurlijke habitats van methanotrofen. De gradiëntspuit maakt het mogelijk om methanotrofe stammen te kweken en gemengde methaanoxiderende consortia te verrijken uit milieumonsters, waardoor fenotypes worden onthuld die alleen zichtbaar zijn in deze ruimtelijk opgeloste context. Dit protocol rapporteert ook verschillende biochemische assays die zijn aangepast om compatibel te zijn met de semi-vaste agarosematrix, wat waardevol kan zijn voor onderzoekers die micro-organismen kweken in andere op agarose gebaseerde systemen.

Introduction

Micro-organismen die op een anoxisch-oxisch grensvlak leven, vervullen vaak belangrijke ecologische rollen1. Een voorbeeld zijn aërobe methaanoxiderende bacteriën (methanotrofen), die voorkomen in tegengradiënten van methaan en zuurstof in bodems en sedimenten2. Deze micro-organismen bezitten unieke metabolische en fysiologische kenmerken die hen in staat stellen de gasgradiënten in hun omgeving te benutten en zijn al tientallen jaren het onderwerp van lopend onderzoek 3,4,5. Momenteel is het meeste gepubliceerde onderzoek over methanotrofen en methaanoxiderende gemeenschappen gebaseerd op werk met homogene planktonische culturen die er vaak niet in slagen de ruimtelijke en chemische gradiënten vast te leggen die inherent zijn aan hun natuurlijke microbiële habitats. Deze beperking belemmert ons begrip van microbiële fysiologie en ons vermogen om genomische informatie te koppelen aan fenotypische eigenschappen.

Dit protocol rapporteert een eenvoudig, laboratoriumgebaseerd modelecosysteem dat reproduceerbare omstandigheden creëert voor het bestuderen van zowel specifieke methanotrofen, zoals Methylomonas sp. stam LW13, als methaanoxiderende gemeenschappen rechtstreeks uit milieubodemmonsters. Belangrijk is dat de teelt in de gradiëntspuit resulteert in contragradiëntspecifieke fenotypes die niet aanwezig zijn in homogene planktonculturen6, wat het vermogen van het systeem benadrukt om nieuwe aspecten van de methanotrofe fysiologie te onthullen. Geïnspireerd door eerder gepubliceerde modelecosystemen 7,8,9, is de gradiëntspuit een vereenvoudigde methode die kan worden gebruikt om chemische en moleculaire informatie te verzamelen van micro-organismen die met deze benadering zijn gekweekt.

De gerapporteerde procedures voor genetische, chemische en moleculaire analyses zijn aangepast om betrouwbaar te werken op microbiële culturen die worden gekweekt in een halfvaste agarosematrix. Deze procedures kunnen ook nuttig zijn voor het analyseren van bacteriën die worden gekweekt in andere semi-vaste agarose-gebaseerde systemen, zoals die worden gebruikt voor bacteriële zachte agar-zwemtests. Het aanpassen van deze analyses aan ruimtelijk opgeloste contexten kan nieuwe wegen openen voor het bestuderen van microbieel leven in meer ecologisch relevante omgevingen.

Protocol

De details van de reagentia en de apparatuur die in het onderzoek zijn gebruikt, staan vermeld in de materiaaltabel. 1. Voorbereiding en extrusie van gradiëntspuiten OPMERKING: De voorbereiding van de gradiëntspuit moet worden uitgevoerd met behulp van een steriele techniek. Gebruik enkele kolonies Methylomonas sp. LW13 vers gekweekt op een bord om 6 ml nitraatmineraalzouten (NMS) medium te inoculeren in een glazen buis van 18 mm x 150 mm. Sluit de buis af met een serumstop en aluminium krimpafdichting en voeg methaan toe met een spuit tot een uiteindelijke atmosfeer van 50% (v/v) methaan in de lucht. Schud deze planktonische vloeibare cultuur bij 200 rpm bij kamertemperatuur tot troebel (ongeveer een dag). Vloeibare culturen 1:10 overbrengen naar verse media. Ga door met het kweken van vloeibare culturen van methanotrofen tot groei in de log-fase (OD600 van ~0,5) en pas aan aan een OD600 = 1,0. Bereid de spuiten voor door de meegeleverde zuiger te verwijderen en ze in een steriele container te bewaren. Bevestig een steriele PTFE-filtertip aan de spuit en plaats deze in een standaard reageerbuisrek met de tip naar beneden. Meng voor elke spuit van 10 ml grondig 1 ml cellen uit stap 1.2 met 5 ml MNS en 4 ml gesmolten agarose (0,5% m/v, afgekoeld tot 55 °C) in een steriele kegelvormige buis. Deze volumes kunnen worden opgeschaald om meerdere spuiten parallel te vullen. Giet langzaam of gebruik een serologische pipet om het mengsel aan elke spuit toe te voegen, tot de markering van 8 ml. Laat agarose in spuiten stollen (~15 min) en sluit vervolgens af met een steriele rubberen butylstop van 20 mm. Bevestig de stop aan de spuit met behulp van laboratoriumtape en label deze met de inhoud van de spuit. Om methaan toe te voegen aan de hoofdruimte van de spuit, vult u een grote spuit (60 ml) met 100% CH4 en bevestigt u een PTFE-filtertip (0,2 μm, 25 mm) die is aangesloten op een steriele naald (23 G). Prik met de grote spuit in de rubberen stop en prik een tweede steriele naald door de stop om een gasuitlaat te creëren. Druk de zuiger op de grote spuit in zodat 20 ml 100% CH4 door de hoofdruimte kan spoelen, en zorg ervoor dat u de uitlaatnaald verwijdert wanneer er nog 1-2 ml CH4 in de grote spuit zit om te voorkomen dat zuurstof terugstroomt door de uitlaatnaald. Incubeer de spuiten bij 18 °C en herhaal stap 1.6 en 1.7 dagelijks om het methaan aan te vullen. Om agarose te extruderen, vervangt u de PTFE-filtertip door een steriele naald van 23 G en vervangt u de rubberen stop door de meegeleverde spuitzuiger. Druk de zuiger langzaam in om stappen van 1 ml in aparte steriele microcentrifugebuisjes van 1,5 ml te doseren. 2. Bepaling van gasconcentraties met tegengestelde gradiënt Meten van de gradiënt van opgeloste zuurstofGebruik een scheermesje om de breedte van een met agarose gevulde spuit (bereid volgens stap 1.1-1.8) dicht bij het PTFE-filter door te snijden. Bevestig de geopende spuit aan een spuitpomp die gericht is op een micro-elektrode van het Clark-type, met het open uiteinde naar de punt van de elektrode gericht. Pas de instellingen van de spuitpomp aan om de spuit met een snelheid van 1 ml/min (0,6 cm/min) naar de micro-elektrode te bewegen; begin met het registreren van de metingen van opgeloste zuurstof op de Unisense Logger-software zodra de spuitpomp begint te bewegen. Meten van de methaangradiëntVervang direct voor de extrusie de punt van het spuitfilter door een eenrichtingskraan die is aangesloten op een naald van 23 G en verwissel de rubberen stop snel door een zuiger van de spuit. Voeg acht agarose-aliquots van 1 ml toe om de geëvacueerde gasdichte injectieflacons van 12 ml te scheiden en laat de monsters gedurende 1 uur bij kamertemperatuur in evenwicht komen. Breng de monsterflesjes in evenwicht met de atmosferische druk door de flesjes open te breken en onmiddellijk opnieuw te verzegelen, of door een naald te doorboren en snel te verwijderen. Injecteer 500 μL vrije ruimte in de injectieflacon in een gaschromatograaf met vlamionisatiedetectie (GC-FID) met behulp van een gasdichte spuit. Maak een kalibratiecurve die is afgeleid van CH4-standaarden om het piekoppervlak (pA*min) om te zetten in μmol/L. 3. Cellen tellen in de gradiëntspuit FlowcytometrieExtrudeer 1 ml agarosesegmenten uit gradiëntspuiten die zijn geïnoculeerd met wildtype of mutant LW13 zoals beschreven in stap 1.9. Bereid en extrudeer agarose ook uit een celvrije, steriele spuit als negatieve controle. Voeg 0,75 ml 0,85% (m/v) NaCl in water toe aan alle geëxtrudeerde agarosemonsters en homogeniseer door vortexen. Verdun de monsters verder 1:10 door 100 μl over te brengen in een nieuwe microcentrifugebuis en 900 μl van de zoutoplossing toe te voegen. Voeg 3 μL van een 1:1 mengsel van SYTO9 en propidiumjodidevlekken toe en incubeer vervolgens 15 minuten in het donker bij kamertemperatuur. Om de cellen per ml agarose te bepalen, sonificeert u de microbolvormige telkralensuspensie in een waterbad gedurende 5 minuten. Voeg vervolgens 10 μL van de suspensie toe aan elk monster vóór flowcytometrieanalyse. Analyseer monsters met een flowcytometer 10,11 met de volgende parameters: activering bij groene fluorescentie, stroomsnelheid van 10 μL/s en deeltjesanalysesnelheid van minder dan 1,000 deeltjes/s.Vergelijk SSC vs. FITC-dotplots tussen celvrije controlemonsters en geïnoculeerde agarosemonsters om “bacteriële gebeurtenis”-spanningspoorten te tekenen die achtergrondagarosedeeltjes uitsluiten. Teken bovendien spanningspoorten voor de microbolletjes tellende kralen, die consistent moeten zijn tussen de monsters. Om de concentratie van cellen in elk agarosesegment in de gradiëntspuit te bepalen, gebruikt u de volgende vergelijking, waarbij u opmerkt dat de verdunningsfactor voor het bovenstaande protocol 17,7275 is en dat 10-6 ml het volume is van één microbolleal. Tellen van kolonievormende eenheden in de gradiëntspuitExtrudeer 1 ml agarosesegmenten in afzonderlijke, steriele microcentrifugebuisjes van 2 ml, voeg 800 μl NMS toe en draai gedurende 10 s om te helpen bij het pipetteren. Bereid een steriel bord met 96 putjes voor door aan elk putje 180 μL NMS toe te voegen. Voeg 20 μl verdunde agarosemonsters toe aan elk putje in de eerste kolom en pipette om te mengen. Gebruik een meerkanaalspipet om de monsters tienvoudig te verdunnen door 20 μl over te brengen van de eerste rij putjes naar de tweede rij putjes en 10 keer te pipetteren om te mengen. Ga door met dit proces tot de laatste rij van de plaat. Label vierkante rasterplaten met NMS-agar of media naar keuze. Spuit met een meerkanaalspipet 5 μl uit een kolom van de plaat met 96 putjes op de agarplaat. Afhankelijk van de grootte van de agarplaat zijn er meerdere kolommen op dezelfde plaat te zien. Incubeer platen onder 40% methaan in de lucht en groei bij 18 °C. Tel bacteriekolonies na 2-3 dagen en bepaal de kolonievormende eenheden per milliliter (CFU/ml). 4. Tests voor biomolecuuldetectie Polysacharide testExtrudeer 1 ml agarosesegmenten in aparte microcentrifugebuisjes van 2 ml en meng met 1 ml van een 1% (m/v) Na2CO3 -oplossing in water. Verwarm de monsters gedurende 30 minuten tot 80 °C met werveling om de 5-10 minuten, gevolgd door centrifugeren bij 4.000 x g bij 4 °C gedurende 20 minuten. Verzamel het supernatans in combinatie met drie volumes 100% ethanol en incubeer bij 20 °C gedurende ten minste 2 uur (of een nacht). Verzamel de met ethanol geprecipiteerde polysacchariden door centrifugatie bij 16.100 x g bij 4 °C gedurende 30 min. Verwijder het supernatans en laat de pellet aan de lucht drogen. Resuspendeer de pellet in 100 μL gedeïoniseerd water. Meet het relatieve polysaccharidegehalte van elk agarosesegment met behulp van een fenol-zwavelzuur colorimetrische test12,13. Combineer 50 μl van het geresuspendeerde extract met 150 μl geconcentreerd zwavelzuur en 30 μl 5% (v/v) fenol in water in een heldere plaat met 96 putjes. Meet de absorptie bij 490 nm met behulp van een microplaatlezer en bereken het relatieve polysaccharidegehalte van elk agarosesegment als percentage van de absorptie van het agarosesegment dat zich het dichtst bij het PTFE-filter bevindt. Eiwit testExtrudeer agarose in afzonderlijke microcentrifugebuisjes van 1,5 ml en breng 100 μl van elk aliquot over in glazen reageerbuisjes. Bepaal de totale eiwitconcentratie met behulp van het reageerbuisprotocol van een BCA-eiwittestkit. Bereid albumine BSA-standaarden voor met agarose geëxtrudeerd uit een steriele spuit als verdunningsmiddel. Extracellulaire DNA-testExtrudeer agarose in afzonderlijke microcentrifugebuisjes van 1,5 ml en breng 20 μl van elk over naar microcentrifugebuisjes van 0,2 ml. Meet DNA-concentraties met behulp van de in de handel verkrijgbare 1x dsDNA-testkit voor hoge gevoeligheid volgens het protocol van de fabrikant. 5. RNA-extractie Bereid de extractiebuffer voor door het volgende te combineren in 800 ml RNasevrij water: 2,0 g CTAB, 2,0 g polyvinylpyrrolidon (PVP 40), 81,8 g NaCl, 100 mM Tris-HCl (pH 8,0) en 20 mM EDTA. Verhoog het volume tot 1 L en autoclaaf; bewaren bij 4 °C. Verdun de bereide extractiebuffer en voeg vlak voor gebruik 1% (v/v) eindconcentratie bèta-mercaptoethanol toe. Verwarm de buffer tot 65 °C met behulp van een waterbad of warmteblok. Verdeel elke gradiëntspuit in secties van 1 ml door agarose te extruderen in afzonderlijke RNasevrije microcentrifugebuisjes van 2 ml volgens de procedure in stap 1.9. Centrifugeer monsters bij 21.000 x g, 4 °C, gedurende 15 minuten en gooi de supernatant weg, terwijl u de monsters op het ijs bewaart. Voeg 600 μL voorverwarmde extractiebuffer toe aan elke gepelleteerde 1 ml geëxtrudeerde agarose. Voeg ongeveer 200 μL zirkoniumoxide/silicakorrels toe en homogeniseer de monsters gedurende 3 minuten bij 30 Hz/s met behulp van een kralenklopper, pauzeer halverwege om de monsters 2 minuten op ijs te leggen. Centrifugeer de monsters bij 15.000 x g, 4 °C, gedurende 2 minuten om schuimvorming te verminderen. Monsters extraheren door 600 μl chloroform: isoamylalcohol (24:1) toe te voegen aan de buisjes en gedurende 10 s te vortexen. Centrifugeer de monsters bij 15.000 x g, 4 °C, gedurende 8 min. Breng de bovenste waterige fase voorzichtig over in een nieuwe RNasevrije microcentrifugebuis en voeg 600 μL chloroform: isoamylalcohol (24:1) toe aan de overgebrachte bovenste fase en vortex gedurende 10 s. Centrifugeer de monsters bij 15.000 x g, 4 °C, gedurende 8 minuten en breng de nieuwe bovenste waterige fase over in een nieuwe RNasevrije microcentrifugebuis. Voeg een gelijk volume isopropanol toe aan de overgebrachte bovenste fase en incubeer de monsters gedurende enkele uren bij -20 °C. Optioneel: monsters kunnen een nacht bij -20 °C worden bewaard. Verzamel RNA-bevattende precipitaten door monsters te centrifugeren bij 16.100 x g, 4 °C gedurende 30 minuten. Gooi het supernatans weg en was de pellet met 300 μl koude 75% (v/v) ethanol gemaakt met RNasevrij water en centrifugeer op 16.100 x g, 4 °C, gedurende 5 minuten. Was de pellets opnieuw volgens stap 5.10. Laat de pellets na het verwijderen van het ethanol 15 minuten aan de lucht drogen. Los de pellets op in 100 μL RNasevrij water. Behandel monsters met DNase I bij 37 °C gedurende 30 minuten volgens het protocol van de fabrikant. Inactiveer DNase I door toevoeging van 300 μL zuur fenol: chloroform: IAZ (125:24:1, pH 4,5). Vortex gedurende 10 s en incubeer bij kamertemperatuur gedurende 5 min. Centrifugeer bij 16.100 x g, 4 °C, gedurende 5 minuten en behoud de bovenste waterige fase door deze over te brengen naar een nieuwe RNasevrije microcentrifugebuis. Optioneel: Bundel RNA uit hetzelfde segment over alle gerepliceerde spuiten door de bovenste fasen te combineren tot een conische buis. Voeg 1 volume isopropanol toe dat gelijk is aan het volume van de RNA-bevattende bovenste fase en voeg 7,5 M LiCl toe tot een eindconcentratie van 0,8 M, waarbij u meerdere keren omkeert om te mengen. Incubeer de monsters gedurende enkele uren bij -20 °C. Optioneel: monsters kunnen een nacht bij -20 °C worden bewaard. Centrifugeer de monsters bij 16.100 x g, 4 °C, gedurende 15 minuten en gooi het supernatant voorzichtig weg. Was de RNA-bevattende pellet twee keer door koude 70% (v/v) ethanol toe te voegen aan RNasevrij water, te centrifugeren bij 16.100 x g, 4 °C, gedurende 5 minuten, en het supernatant te verwijderen. Laat de pellets 10 minuten aan de lucht drogen bij kamertemperatuur en resuspendeer in 50 μL RNasevrij water. Bewaar de RNA-monsters bij -80 °C. Optioneel, afhankelijk van de RNA-kwaliteit: Monsters kunnen opnieuw worden gezuiverd met behulp van een RNA-zuiveringskit om kleine (<200 nt) RNA's te verwijderen. Om te bevestigen dat RNA-monsters geen resterend DNA bevatten, gebruikt u 1 μL gezuiverd RNA als sjabloon voor PCR-amplificatie met behulp van universele bacteriële 16S rRNA-genprimers 27F/1492R. Voeg twee extra PCR-reacties toe die 1 μL genoom-DNA (verdund 1:100) of nucleasevrij water bevatten om respectievelijk als positieve en negatieve controles te dienen. Laat de producten op een 1% agarose TBE-gel lopen met behulp van gelelektroforese14.OPMERKING: RNA-monsters zonder DNA-besmetting moeten resulteren in de afwezigheid van een band in de monsterbaan. Als RNA-monsters DNA-contaminatie vertonen, verwerk de monsters dan opnieuw vanaf stap 5.13. RNA is klaar voor stroomafwaartse analyse en kan optioneel worden geanalyseerd om de integriteit ervan te kwantificeren door het RNA-integriteitsnummer (RIN) te meten.

Representative Results

Hier werd het ecosysteem van het gradiëntspuitmodel gebruikt om een enkele stam te kweken (de methanotrofe Methylomonas sp. stam LW13) (Figuur 1A)6, maar het kan ook worden gebruikt om te verrijken voor een methaanoxiderende microbiële gemeenschap door directe bodeminoculatie (Figuur 1B). De aanwezigheid van een methaan-zuurstof-tegengradiënt werd gevalideerd door de concentratie van methaan en zuurstof te meten in celvrije en geïnoculeerde spuiten (figuur 1C). Voor LW13-geënte gradiëntspuiten vormde zich binnen één dag na het spoelen van de spuit een tegengradiënt, die gedurende drie dagen incubatie steiler werd. In dezelfde periode vormde zich op dezelfde diepte een horizontale band waarop beide gassubstraten hun laagste concentraties bereikten (figuur 1A). De steile gasgradiënt en uitputting van methaan en zuurstof voorbij de diepte van de horizontale band toonden aan dat LW13 aeroob methaan metaboliseerde en een fenotype produceerde dat niet werd waargenomen in homogene planktoncultuur. Dit fenotype wordt ook geproduceerd door andere methanotrofe bacteriën geïsoleerd uit hetzelfde milieumonster als LW136. Stamafhankelijke variatie in de timing en diepte van de ontwikkeling van de horizontale band tussen verschillende methanotrofe stammen suggereerde dat de horizontale band werd beïnvloed door het specifieke gedrag van elke microbe wanneer deze werd gekweekt in een ruimtelijk opgeloste context6. Het aantal cellen in de gehele agaroseprop werd gemeten met behulp van flowcytometrie en kolonietellingen (CFU/ml) (Figuur 2A). Deze methode werd gebruikt om de celdistributie en overleving van wildtype LW13 te vergelijken met een mutante stam van LW13 die een deletie bevat in het fucose 4-O-acetyltransferase (OAT)-gen, waarvan eerder was aangetoond dat het de ontwikkeling van horizontale banden beïnvloedt6. De ΔOAT-mutant van LW13 had een lagere totale groei in de gradiëntspuit gedurende 6 dagen in vergelijking met het wildtype, een effect dat niet werd waargenomen in homogene planktonculturen van dezelfde stammen6. De gemuteerde stam vormde niet dezelfde duidelijke horizontale band als het LW13-wildtype wanneer het in de gradiëntspuit werd gekweekt (figuur 2B). Het aantal cellen en het uiterlijk van de horizontale band werden hersteld tot niveaus die vergelijkbaar waren met het wildtype na gencomplementatie in de mutante stam. Deze resultaten tonen aan dat de gradiëntspuit kan worden gebruikt om genen te koppelen aan specifieke fenotypes die alleen aanwezig zijn in de methaan-zuurstof-tegengradiënt. Een verscheidenheid aan genetische, chemische en moleculaire technieken werd aangepast voor gebruik met bacteriën die werden gekweekt in een halfvaste agarosematrix. Het ecosysteem van het gradiëntspuitmodel kan gemakkelijk worden gebruikt voor standaard biomoleculaire kwantificeringstests met de opname van niet-geïnoculeerde agarose als negatieve controle. De concentratie van drie verschillende biomoleculen die vaak worden aangetroffen in extracellulaire polymere stoffen en biofilms werd gemeten: polysachariden, eiwit en extracellulair DNA15 (figuur 3). In LW13-geïnoculeerde spuitsegmenten had de horizontale band significant meer polysacchariden dan andere segmenten, zonder significante toename van eiwit of extracellulair DNA. RNA-seq werd gebruikt om transcriptionele verschillen te meten in LW13 die op verschillende diepten van de spuit groeide. Robuuste RNA-extractie werd bereikt met behulp van een op CTAB gebaseerde extractiebuffer, gevolgd door conventionele fenol: chloroform-extractie en precipitatiestappen. De resultaten van de RNA-seq-analyse werden later gebruikt om genen te identificeren die betrokken zijn bij de productie van de horizontale polysaccharideband. Deze resultaten geven aan dat de halfvaste agarose die essentieel is voor de creatie van een ruimtelijk opgelost modelecosysteem verdere biochemische analyses niet verhindert die over het algemeen zijn voorbehouden aan plankton- en plaatgebaseerde culturen. Figuur 1: Het ecosysteem van het gradiëntspuitmodel. (A) De gradiëntspuit geënt met de methanotroop Methylomonas sp. LW13. Binnen twee dagen na het spoelen van de spuit met 100% methaan ontwikkelt zich een duidelijke horizontale band (pijlpunt). (B) Close-upfoto’s van gradiëntspuiten die zijn geïnoculeerd met 10-1 en 10-4 verdunde grond en gedurende twee weken zijn geïncubeerd. Gradiëntspuiten die meer verdunde grond bevatten, resulteerden in bolvormige kolonies door de hele agarose, terwijl meer geconcentreerde grondinocula resulteerden in een duidelijke band. (C) Karakterisering van de methaan-zuurstof-tegengradiënt in LW13-geënte en steriele gradiëntspuiten na drie dagen incubatie. De grijze balk geeft het dieptebereik aan waarop de polysaccharideband zich bevond; gegevens tonen de gemiddelde ± SD van drie onafhankelijke experimenten met elk drie technische replicaten. Panelen (A) en (C) zijn aangepast van Beals et al.6. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken. Figuur 2: Kwantificering van LW13 wildtype en mutant na incubatie in de gradiëntspuit. (A) Het totale aantal LW13-cellen per ml geëxtrudeerde agarose dat op dag 0 en dag 7 uit gradiëntspuiten is teruggevonden, gemeten met flowcytometrie. ΔOAT bevat een deletie van het fucose 4-O-acetyltransferase-gen, dat sterk tot expressie bleek te komen in cellen die zich op de diepte van de polysaccharideband bevinden. ΔOAT+OAT bevat het OAT-gen dat op een distale locatie van het ΔOAT-genoom is ingebracht. *significant verschillend (tweezijdige heteroscedastische t-toets, α = 0,05); N.S., niet significant anders. Gegevens tonen de gemiddelde ± SD van drie onafhankelijke experimenten met elk twee technische replicaten. (B) Horizontale bandontwikkeling in gradiëntspuiten die zijn geïnoculeerd met LW13 wildtype, ΔOAT of ΔOAT+OAT na zeven dagen incubatie. Dit cijfer is aangepast van Beals et al.6. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken. Figuur 3: Kwantificering van biomoleculen op toenemende diepte van de gradiëntspuit. Relatief polysaccharidegehalte (%), eiwitconcentratie (μg/ml) en DNA-concentratie (ng/μL) in acht secties LW13-geïnoculeerde gradiëntspuiten die gedurende zeven dagen zijn geïncubeerd (gevulde cirkels; open cirkels tonen waarden van steriele gradiëntspuiten). Gegevens tonen de gemiddelde ± SD van drie onafhankelijke experimenten met elk drie technische replicaten. Voor het relatieve polysaccharidegehalte geeft * een significant verschil aan met steriele controle op equivalente diepte (tweezijdige heteroscedastische t-toets, α = 0,05). Voor eiwit- en DNA-concentraties geeft * een significant verschil aan met het gedeelte dat de horizontale band bevat (eenrichtings-ANOVA met Tukey-Kramer post-hocanalyse); N.S., niet significant. De figuur is aangepast van Beals et al.6. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Discussion

Methoden voor methanotrope teelt
Methanotrofen worden al tientallen jaren bestudeerd om inzicht te krijgen in hun fysiologie, hun individuele en gemeenschapsgedrag in de natuurlijke omgeving en hun potentieel voor methaanbeperking in industriële toepassingen. Tijdens deze studies is veel van het uitgevoerde onderzoek uitgevoerd met behulp van homogene planktonculturen waarbij de ruimtelijke context verloren is gegaan. Het ecosysteem van het gradiëntspuitmodel is ontwikkeld om de methaan-zuurstof-tegengradiënt die kenmerkend is voor natuurlijke methanotrofe habitats in het laboratorium na te bootsen, waardoor onderzoekers methanotrofen kunnen bestuderen die groeien in een omgeving die meer lijkt op waar deze organismen zijn geëvolueerd.

In de afgelopen 30 jaar hebben onderzoekers de methaan-zuurstof-tegengradiënt in het laboratorium nagebootst met behulp van verschillende methoden, vaak met als primair doel het isoleren en classificeren van methanotrofen van gemengde methaanoxiderende consortia. Deze methoden kunnen worden onderverdeeld in twee benaderingen, beide met behulp van tegengestelde kamers van methaan en zuurstof: het opschorten van relatief ongestoorde grond op een membraan 16,17,18, of het inoculeren van kleine hoeveelheden grond of pure bacteriecultuur in een minimaal medium in agarose 7,8,19. De gradiëntspuitmethode die hier wordt beschreven, combineert de op spuiten gebaseerde aanpak van Dedysh en collega’s9 met de teelt van methanotrofen uit eerder werk van Amaral en Knowles8, en Schink en collega’s7. De laatste van deze methoden legde de basis voor het kweken van methanotrofen in een methaan-zuurstof-tegengradiënt en gebruikte een continue stroom van methaan en zuurstof aan weerszijden van de agaroseplug. Hoewel dit zorgt voor een constantere omgeving, voegt deze aanpak complexiteit toe aan de experimentele opstelling en zijn speciale gasbronnen nodig.

De hier beschreven gradiëntspuit daarentegen is afhankelijk van dagelijks spoelen van de spuit om vers methaan te leveren, een proces dat minder dan een minuut per spuit duurt, terwijl het continue toegang biedt tot zuurstof uit de atmosfeer via een steriele PTFE-filtertip. Deze eenvoudigere methode kan een bredere acceptatie van dit modelecosysteem mogelijk maken voor het bestuderen van methanotrofen in een ruimtelijk opgeloste context. Het beschreven protocol beschrijft ook analyses op chemisch en moleculair niveau die rechtstreeks kunnen worden uitgevoerd op bacteriën die in de halfvaste agarose zijn geïncubeerd. Als gevolg hiervan hoeven bacteriën vóór analyse niet buiten de agarosematrix te worden weggesneden en gekweekt, waardoor de gasgradiëntomstandigheden op het moment van bemonstering behouden blijven.

Opmerkingen over het protocol
Omdat de bacteriën worden gekweekt in een volumetrische spuit van polypropyleen, kunnen onderzoekers de bijbehorende zuiger van de spuit gebruiken om de agaroseplug nauwkeurig en reproduceerbaar te segmenteren, terwijl de ruimtelijke integriteit van de agarosematrix die nog in de spuitcilinder zit, behouden blijft. Zonder het luchtdichte ontwerp dat inherent is aan de spuit, zouden agarosepluggen uit de cilinder van de spuit moeten worden verwijderd en in plakjes moeten worden gesneden, waardoor onzekerheid ontstaat in het volume van de agarosesegmenten en niet-kwantificeerbare hoeveelheden methaan en opgeloste zuurstof in de atmosfeer vrijkomen. Agarose-extrusie via een steriele naald vereenvoudigt de monstervoorbereiding en helpt geëxtrudeerde segmenten te homogeniseren zonder bacteriële cellen te beschadigen. Deze methode stelt onderzoekers in staat om elke geënte gradiëntspuit in ten minste acht agarosesegmenten te verdelen en parallelle experimenten uit te voeren op methanotrofen die groeien in een reeks zuurstof- en methaanconcentraties.

Bij het optimaliseren van RNA-extractie uit agarose met een hoog polysaccharidegehalte, werd ontdekt dat gewone reagentia zoals guanidiumthiocyanaat en TRIzol leidden tot agarosegelering, die de zuiveringskolommen belemmerde en bestand was tegen pelletvorming door centrifugatie. Lage RNA-opbrengsten en -kwaliteit waren ook een punt van zorg, aangezien grote polysaccharidemoleculen nucleïnezuren kunnen vangen, terwijl kleine polysacchariden samen met RNA20 kunnen neerslaan. In plaats daarvan werd een extractiebuffer gebruikt die de kationische oppervlakteactieve stof CTAB bevatte, die lipidemembranen oplost20; en NaCl, dat de vorming van CTAB-nucleïnezuurcomplexen voorkomt en nucleïnezuren laat neerslaan, maar polysacchariden in oplossing21 houdt. RNases werden gedenatureerd door de opname van β-mercaptoethanol in de CTAB-buffer. Voor het RNA-seq-experiment werd een optionele kolomgebaseerde zuiveringsstap opgenomen om kleine (<200 nucleotiden) RNA's uit te sluiten voordat de bibliotheek werd voorbereid.

Beperkingen en overwegingen
Terwijl het MNS en agarose een minimale mediummatrix bieden voor het kweken van methanotrofe bacteriën, bootst de gradiëntspuit zoals hier beschreven alleen de gasgradiënten van methanotrofe habitats na, maar geen andere gradiënten die in die omgevingen aanwezig zijn, zoals sporenmetalen22, zoutgehalte23 of andere voedingsstoffen24. Het is mogelijk dat deze gradiënten in de toekomst aan een soortgelijk systeem kunnen worden toegevoegd. Bovendien beperkt het volume van de spuit (8 ml agarose) de totale biomassa per spuit, waardoor het nodig is om meerdere spuiten samen te voegen voor sommige analyses (zoals beschreven in stap 5.16). Hoewel de handspuit de agarose handig segmenteert in aliquots van 1 ml, beperkt de grootte ook de hoofdruimte tot ongeveer 4 ml, waardoor de hoeveelheid methaan in bulk die kan worden opgeslagen voor de gekweekte microben wordt beperkt. Aangezien de oxidatiesnelheid van methaan evenredig is met de groeisnelheid van aërobe methanotrofen25, wordt aanbevolen om dagelijks methaan in de hoofdruimte aan te vullen. Hoewel dit nog steeds kan resulteren in perioden van methaanbeperking, zijn deze perioden reproduceerbaar in het laboratorium en bootsen ze waarschijnlijk situaties na die in natuurlijke omgevingen worden aangetroffen.

Tijdens het gebruik van de gradiëntspuit vereist de aanwezigheid van de agarose-polysacchariden enkele aanpassingen aan de tests die worden gebruikt om methanotrofen die in dit systeem worden gekweekt te analyseren. Protocollen die bijvoorbeeld de overdracht van kleine hoeveelheden geëxtrudeerde agarose vereisen, vereisen meerdere verdunningsstappen met een grondige homogenisatie tussen elke verdunning voor nauwkeurig pipetteren. Bovendien is in gevallen zoals de polysaccharide-test waarbij de polysacchariden die inherent zijn aan de agarosematrix zullen reageren met het zwavelzuur-fenolreagens, de opname van een steriele, celvrije agarose-negatieve controle essentieel. Vroege pogingen om deze problemen te verminderen door het agarose-hydrolyserende enzym β-agarase op te nemen, waren niet succesvol en introduceerden een onbekende variabele in de biologische experimenten. Het gebruik van meerdere technische replicaten, grondige verdunning, homogenisatie en het opnemen van controles kan worden gebruikt om de meeste uitdagingen die inherent zijn aan de agarosematrix te verminderen.

Toepassingen
Naast studies met één stam kan de gradiëntspuit de co-cultuur van meerdere stammen ondersteunen en kan aarde worden gebruikt als inoculum in plaats van pure bacteriecultuur. Het eenvoudige ontwerp van het ecosysteem van het gradiëntspuitmodel is geschikt voor de cultuur van andere soorten micro-organismen die bestaan op het grensvlak tussen anoxische en oxische omgevingen door een ander gassubstraat te gebruiken, zoalsH2 of CO, in plaats van methaan. Samenvattend stelt het gebruik van een eenvoudig, ruimtelijk opgelost modelecosysteem onderzoekers in staat om de unieke fysiologie en metabole aanpassingen van zuurstofloze micro-organismen te bestuderen en kan het worden gebruikt om genen te koppelen aan fenotypes van organismen.

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Dit werk werd ondersteund door startfinanciering van het Department of Chemistry van de Universiteit van Utah en NSF CAREER Award #2339190. We danken de leden van het Puri Lab voor de nuttige discussies. We danken Rachel Hurrell (University of Utah) voor de eerste begeleiding bij het flowcytometrie-experiment.

Materials

1% Gas mix analytical standard Supelco 22561 1% each component in nitrogen: carbon monoxide, carbon dioxide, hydrogen, methane and oxygen
100% Methane Airgas ME CP300 chemically pure grade
15 ppm Gas mix analytical standard Supelco 23470-U 15 ppm each component in nitrogen: methane, ethane, ethylene, acetylene, propane, propylene, propyne, and n-butane
1x Nitrate mineral salts  see CAS numbers below Dissolve the following in Mili-Q water and autoclave:  0.2 g/L MgSO4·7H2O, 0.2 g/L CaCl2·6H2O, 1 g/L KNO3, and 30 μM LaCl3. Before use, add trace elements to a 1X final concentration and phosphate buffer (pH 6.8) to a final concentration of 5.8 mM.
23 G needle BD Biosciences 305194 sterile, Luer-Lok
500x Trace elements see CAS numbers below Dissolve the following in Milli-Q water: 1.0 g/L Na2-EDTA, 2.0 g/L FeSO4·7H2O, 0.8 g/L ZnSO4·7H2O, 0.03 g/L MnCl2·4H2O, 0.03 g/L H3BO3, 0.2 g/L CoCl2·6H2O, 0.6 g/L CuCl2·2H2O, 0.02 g/L NiCl2·6H2O, and 0.05 g/L Na2MoO·2H2O.
96 Well plate CELLTREAT 229596 sterile
Acid phenol:chloroform:IAA (125:24:1) Invitrogen AM9720  pH 4.5
Agarose Fisher Scientific BP160 molecular biology grade, CAS 9012-36-6
Aluminum crimp seals VWR 30618-460 20 mm
Bead beater Qiagen 9003240 TissueLyser III
Butyl rubber stopper Chemglass Life Science 50-143-854 20 mm, blue
Chloroform:isoamyl alcohol (24:1) Millipore Sigma 25666 BioUltra, for molecular biology
Clark-type O2 microelectrode Unisense OX-500
DEPC-treated water Thermo Scientific R0601
DNase I (Ambion) Invitrogen AM2222
Flow cytometer Beckman Coulter CytoFLEX
Gas chromatograph (flame ionization detection) Agilent 6890N
Gastight analytical syringe Hamilton 81220 1750 TLL
Gastight analytical syringe needle Hamilton 7729-07 22 G, metal hub needle, 2 in, point style 5
Gas-tight vials Labco 938W Exetainer vial: 12 mL, round bottom
Glass culture tubes Bellco Glass 2048-00150 18 x 150 mm
LiCl precipitation solution (7.5 M) Invitrogen AM9480
One-way stopcock VWR MFLX30600-00 inlet port: female luer, outlet port: male luer lock
Petri dish, square Fisher Scientific FB0875711A 100 x 100 mm
Phosphate buffer, 0.2 M (pH 6.8) see CAS numbers below Dissolve the following in Milli-Q water and autoclave: 12.24 g/L KH2PO4, 26.29 g/L Na2HPO4 · 7H2O
Pierce BCA Protein Assay Kit  Thermo Scientific 23225
PTFE syringe filter tip Thermo Scientific 03-050-469 hydrophobic, pore size: 0.2 µm, diameter: 4 mm
Qubit 1x dsDNA High Sensitivity Assay Kit  Invitrogen Q33230
Qubit 4 Fluorometer Invitrogen Q33238
RNA Clean & Concentrator-5 Zymo Research R1013
Serum stopper Fisher Scientific 03-340-302 20 mm
Syringe BD Biosciences 302995 Luer-Lock, 10 mL, single use, sterile
Syringe pump New Era Pump Systems Inc. 1000-US NE-1000 one channel programmable
SYTO9, propidium iodide, microspheres Invitrogen L34856 LIVE/DEAD BacLight Bacterial Viability Kit
Zirconia/silica beads BioSpec Products 11079101z 0.1 mm diameter
Chemical reagents CAS number
CaCl2·6H2O 7774-34-7
CoCl2·6H2O 7791-13-1
Concentrated sulfuric acid 7664-93-9
CTAB, cetrimonium bromide 57-09-0
CuCl2·2H2O 10125-13-0
Ethanol 64-17-5   
FeSO4·7H2O 7782-63-0
H3BO3 10043-35-3
Isopropanol 69-63-0
KH2PO4 7778-77-0
KNO3 7757-79-1
LaCl3 10099-58-8
MgSO4·7H2O 10034-99-8
MnCl2·4H2O 13446-34-9
Na2CO3, sodium carbonate 497-19-8
Na2-EDTA 139-33-3
Na2HPO4 · 7H2O 7782-85-6
Na2MoO·2H2O 10102-40-6
NaCl, sodium chloride 7647-14-5
NiCl2·6H2O 7791-20-0
Phenol (90% solution in water) 108-95-2
PVP40, polyvinylpyrrolidone 9003-39-8
Tris-HCl 1185-53-1
ZnSO4·7H2O 7446-20-0
β-Mercaptoethanol 60-24-2
DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Brune, A., Frenzel, P., Cypionka, H. Life at the oxic-anoxic interface: microbial activities and adaptations. FEMS Microbiol Rev. 24 (5), 691-710 (2000).
  2. Auman, A. J., Stolyar, S., Costello, A. M., Lidstrom, M. E. Molecular characterization of methanotrophic isolates from freshwater lake sediment. Appl Environ Microbiol. 66 (12), 5259-5266 (2000).
  3. Whittenbury, R., Phillips, K. C., Wilkinson, J. F. Enrichment, isolation and some properties of methane-utilizing bacteria. J Gen Microbiol. 61 (2), 205-218 (1970).
  4. Koo, C., Rosenzweig, A. Biochemistry of aerobic biological methane oxidation. Chem Soc Rev. 50 (5), 3424-3436 (2021).
  5. Strong, P. J., Xie, S., Clarke, W. P. Methane as a resource: Can the methanotrophs add value. Environ Sci Technol. 49 (7), 4001-4018 (2015).
  6. Beals, D. G., Puri, A. W. Linking methanotroph phenotypes to genotypes using a simple spatially resolved model ecosystem. ISME J. 18 (1), wrae060 (2024).
  7. Bussmann, I., Rahalkar, M., Schink, B. Cultivation of methanotrophic bacteria in opposing gradients of methane and oxygen. FEMS Microbiol. Ecol. 56 (3), 331-344 (2006).
  8. Amaral, J. A., Knowles, R. Growth of methanotrophs in methane and oxygen counter gradients. FEMS Microbiol Lett. 126 (3), 215-220 (1995).
  9. Danilova, O. V., et al. A new cell morphotype among methane oxidizers: a spiral-shaped obligately microaerophilic methanotroph from northern low-oxygen environments. ISME J. 10 (11), 2734-2743 (2016).
  10. Ou, F., McGoverin, C., Swift, S., Vanholsbeeck, F. Absolute bacterial cell enumeration using flow cytometry. J Appl Microbiol. 123 (2), 464-477 (2017).
  11. Krause, S. M. B., et al. Lanthanide-dependent cross-feeding of methane-derived carbon is linked by microbial community interactions. Proc Natl Acad Sci USA. 114 (2), 358-363 (2017).
  12. Masuko, T., et al. Carbohydrate analysis by a phenol-sulfuric acid method in microplate format. Anal Biochem. 339 (1), 69-72 (2005).
  13. Felz, S., Al-Zuhairy, S., Aarstad, O. A., van Loosdrecht, M. C. M., Lin, Y. M. Extraction of structural extracellular polymeric substances from aerobic granular sludge. J Vis Exp. (115), e54534 (2016).
  14. Lee, P. Y., Costumbrado, J., Hsu, C. Y., Kim, Y. H. Agarose gel electrophoresis for the separation of DNA fragments. J Vis Exp. (62), e3923 (2012).
  15. Costa, O. Y. A., Raaijmakers, J. M., Kuramae, E. E. Microbial extracellular polymeric substances: Ecological function and impact on soil aggregation. Front Microbiol. 9, 1636 (2018).
  16. Sinke, A. J. C., Cottaar, F. H. M., Buis, K., Keizer, P. Methane oxidation by methanotrophs and its effects on the phosphate flux over the sediment-water interface in a eutrophic lake. Microb Ecol. 24 (3), 259-269 (1992).
  17. Murase, J., Frenzel, P. A methane-driven microbial food web in a wetland rice soil. Environ Microbiol. 9 (12), 3025-3034 (2007).
  18. Reim, A., Lüke, C., Krause, S., Pratscher, J., Frenzel, P. One millimetre makes the difference: High-resolution analysis of methane-oxidizing bacteria and their specific activity at the oxic-anoxic interface in a flooded paddy soil. ISME J. 6 (11), 2128-2139 (2012).
  19. Rahalkar, M., Bussmann, I., Schink, B. Methylosoma difficile gen. nov., sp. nov., a novel methanotroph enriched by gradient cultivation from littoral sediment of Lake Constance. Int J Syst Evol Microbiol. 57 (5), 1073-1080 (2007).
  20. Wang, L., Stegemann, J. P. Extraction of high-quality RNA from polysaccharide matrices using cetlytrimethylammonium bromide. Biomaterials. 31 (7), 1612 (2010).
  21. Liyanage, N. M. N., Chandrasekara, B. C. H. W. M., Bandaranayake, P. C. G. A CTAB protocol for obtaining high-quality total RNA from cinnamon (Cinnamomum zeylanicum Blume). 3 Biotech. 11 (4), 201 (2021).
  22. Semrau, J. D., DiSpirito, A. A., Gu, W., Yoon, S. Metals and methanotrophy. Appl Environ Microbiol. 84 (6), e02289-e02317 (2018).
  23. Zhang, S., et al. Salinity significantly affects methane oxidation and methanotrophic community in Inner Mongolia lake sediments. Front Microbiol. 13, 1067017 (2023).
  24. Fox, A. L., Trefry, J. H. Nutrient fluxes from recent deposits of fine-grained, organic-rich sediments in a Florida estuary. Front Mar Sci. , (2023).
  25. He, L., et al. A methanotrophic bacterium to enable methane removal for climate mitigation. Proc Natl Acad Sci. 120 (35), e2310046120 (2023).

Tags

Environmental Sciences
This article has been published
Video Coming Soon
Keep me updated:

.

PDF
DOI
DOWNLOAD MATERIALS LIST
Cite This Article
Beals, D. G., Puri, A. W. Agarose-Based Model Ecosystem for Cultivating Methanotrophs in a Methane-Oxygen Counter Gradient. J. Vis. Exp. (211), e67191, doi:10.3791/67191 (2024).
Download Citation
Reprints and Permissions

View Video

✖

To prove you're not a robot, please enter the text in the image below

CAPTCHA Image
Play CAPTCHA Audio
Refresh Image