メタン-酸素カウンターグラジエントにおけるメタン栄養生物の培養のためのアガロースベースモデル生態系

本試験で使用した試薬および機器の詳細は、 資料表に記載されています。 1. グラジエントシリンジの調製と押出し 注:グラジエントシリンジの準備は、滅菌技術を使用して行う必要があります。 プレート上で新たに培養した Methylomonas sp. LW13のコロニーを数コロニー使用し、18 mm x 150 mmのガラス管に6 mLの硝酸塩ミネラル塩(NMS)培地を接種します。チューブをセラムストッパーとアルミクリンプシールでシールし、シリンジを使用してメタンを空気中の50%(v / v)メタンの最終雰囲気に添加します。この浮遊性液体培養物を室温で200rpmで濁るまで振とうします(約1日)。 液体培養物を1:10で新鮮な培地に通過させます。メタン栄養生物の液体培養物を対数期成長(OD600 ~0.5)まで成長させ続け、OD600 = 1.0に調整します。 付属のプランジャーを取り外し、滅菌容器に保管してシリンジを準備します。滅菌PTFEフィルターチップをシリンジに取り付け、先端を下に向けて標準の試験管ラックに置きます。 10 mLシリンジ1個につき、ステップ1.2の細胞1 mLを、5 mLのNMSおよび4 mLの溶融アガロース(0.5% m/v、55°Cに冷却)と滅菌コニカルチューブで十分に混合します。これらの容量は、複数のシリンジを並行して充填するためにスケールアップできます。 ゆっくりと注ぐか、血清学的ピペットを使用して、8 mLのマーキングまで各シリンジに混合物を追加します。.シリンジ内のアガロースを固化させ(~15分)、滅菌済みの20 mmゴムブチルストッパーでキャップします。ラボテープを使用してストッパーをシリンジに固定し、シリンジの内容物でラベルを付けます。 シリンジのヘッドスペースにメタンを追加するには、大型(60 mL)シリンジに100% CH4 を充填し、滅菌針(23 G)に接続されたPTFEフィルターチップ(0.2 μm、25 mm)を取り付けます。大きなシリンジでゴム栓を突き刺し、ストッパーに2本目の滅菌針を刺してガス出口を作ります。 大型シリンジのプランジャーを押し下げて、20mLの100%CH4 がヘッドスペースを洗い流し、大型シリンジに1〜2mLのCH4 が残っている場合は、出口針を取り外すように注意して、出口針を通る酸素の逆流を防ぎます。 シリンジを18°Cでインキュベートし、ステップ1.6と1.7を毎日繰り返してメタンを補充します。 アガロースを押し出すには、PTFEフィルターチップを滅菌済みの23G針に交換し、ゴム栓を付属のシリンジプランジャーに交換します。プランジャーをゆっくりと押し下げて、1 mL刻みを別々の滅菌1.5 mLマイクロ遠心チューブに分注します。 2. カウンターグラジエントガス濃度の決定 溶存酸素勾配の測定かみそりの刃を使用して、PTFEフィルターの近くでアガロースを充填したシリンジ(手順1.1〜1.8に従って調製)の幅をスライスします。開いたシリンジをクラーク型微小電極に向けられたシリンジポンプに固定し、開いた端を電極の先端に向けて固定します。 シリンジポンプの設定を調整して、シリンジを1 mL / min(0.6 cm / min)の速度で微小電極に向かって動かします。シリンジポンプが動き始めたらすぐに、Unisenseロガーソフトウェアで溶存酸素測定値の記録を開始します。 メタン勾配の測定押出しの直前に、シリンジフィルターチップを23G針に接続された一方向ストップコックと交換し、ゴム栓をシリンジプランジャーにすばやく交換します。8 mL の 1 mL アガロースアリコートを分離した 12 mL 気密バイアルに添加し、サンプルを室温で 1 時間平衡化します。 サンプルバイアルを大気圧に平衡化するには、バイアルを割ってすぐに再密封するか、針に穴を開けてすばやく取り外します。気密シリンジを使用して、水素炎イオン化検出(GC-FID)を備えたガスクロマトグラフに500μLのバイアルヘッドスペースを注入します。CH4 標準試料から導出された検量線を作成し、ピーク面積(pA*min)を μmol/L に変換します。 3. グラジエントシリンジでの細胞のカウント フローサイトメトリーステップ1.9で概説したように、野生型または変異型LW13を接種したグラジエントシリンジから1 mLのアガロースセグメントを押し出します。また、ネガティブコントロールとして、無細胞の滅菌シリンジからアガロースを調製し、押し出します。 0.75 mLの0.85%(m/v)NaClを水に溶かし、すべての押出アガロースサンプルに添加し、ボルテックスにより均質化します。さらに、100 μLを新しい微量遠心チューブに移し、900 μLの塩溶液を加えて、サンプルを1:10に希釈します。 SYTO9とヨウ化プロピジウムの1:1混合物を3 μL加え、暗所で室温で15分間インキュベートします。アガロースのmLあたりの細胞数を決定するには、マイクロスフェア計数ビーズ懸濁液を水浴中で5分間超音波処理します。次に、フローサイトメトリー分析の前に、各サンプルに10 μLの懸濁液を添加します。 フローサイトメーター10,11を用いて、緑色蛍光でのトリガー、10 μL/sの流速、1,000 particles/s未満の粒子分析速度でサンプルを解析します。SSC との比較FITCは、無細胞コントロールサンプルと接種アガロースサンプルとの間にドットプロットを行い、バックグラウンドのアガロース粒子を除外する「細菌イベント」電圧ゲートを描画します。さらに、マイクロスフィアカウンティングビーズの電圧ゲートを描画し、サンプル間で一貫性を保つ必要があります。 グラジエントシリンジ内の各アガロースセグメント中の細胞の濃度を決定するには、上記のプロトコルの希釈係数が17.7275であり、10〜6mL が1つのマイクロスフェアビーズの容量であることに注意して、次の式を使用します。 グラジエントシリンジ内のコロニー形成ユニットのカウント1 mLのアガロースセグメントを別々の滅菌済み2 mL微量遠心チューブに押し出し、800 μLのNMSを加え、ピペッティングを支援するために10秒間ボルテックスします。 各ウェルに180 μLのNMSを添加して、滅菌済みの96ウェルプレートを調製します。希釈したアガロースサンプル20 μLをファーストカラムの各ウェルに加え、ピペットで混合します。 マルチチャンネルピペットを使用して、1列目のウェルから20μLを2列目のウェルに移し、10回ピペッティングして混合することにより、サンプルを10倍に段階希釈します。このプロセスをプレートの最後の行まで続けます。 NMS寒天培地または選択した培地を含む正方形のグリッドプレートにラベルを付けます。マルチチャンネルピペットを使用して、96ウェルプレートのカラムから5 μLを寒天プレートにスポットします。寒天プレートのサイズによっては、同じプレート上に複数のカラムを見つけることができます。 プレートを40%メタン未満で空気中でインキュベートし、18°Cで増殖します。 2〜3日後に細菌のコロニーをカウントし、ミリリットルあたりのコロニー形成単位(CFU / mL)を決定します。 4. 生体分子検出アッセイ 多糖類アッセイ1 mLのアガロースセグメントを別々の2 mL微量遠心チューブに押し出し、1 mLの1%(m/v)Na2CO3 溶液と水で混合します。サンプルを80°Cで30分間加熱し、5〜10分ごとにボルテックスした後、4,000 x g 、4°Cで20分間遠心分離します。 上清を3容量の100%エタノールと組み合わせて収集し、20°Cで少なくとも2時間(または一晩)インキュベートします。 エタノール沈殿した多糖類を、16,100 x g 、4°C、30分間遠心分離して回収します。上清を取り除き、ペレットを風乾します。ペレットを100 μLの脱イオン水に再懸濁します。 フェノール-硫酸比色アッセイ12,13を使用して、各アガロースセグメントの相対的な多糖類含有量を測定します。再懸濁した抽出物50 μLを、150 μLの濃硫酸および30 μLの5%(v/v)フェノール水溶液と、透明な96ウェルプレートに混ぜ合わせます。 マイクロプレートリーダーを使用して490 nmでの吸光度を測定し、各アガロースセグメントの相対的な多糖類含有量を、PTFEフィルターに最も近いアガロースセグメントの吸光度の割合として計算します。 タンパク質アッセイアガロースを別々の1.5 mL微量遠心チューブに押し出し、各アリコート100 μLをガラス試験管に移します。 BCAタンパク質アッセイキットの試験管プロトコルを使用して、総タンパク質濃度を測定します。滅菌シリンジから押し出したアガロースを希釈剤としてアルブミンBSA標準液を調製します。 細胞外DNAアッセイアガロースを別々の1.5 mL微量遠心チューブに押し出し、各20 μLを0.2 mL微量遠心チューブに移します。 市販の1x dsDNA高感度アッセイキットを使用して、メーカーのプロトコルに従ってDNA濃度を測定します。 5. RNA抽出 800 mLのRNaseフリー水に、CTAB2.0 g、ポリビニルピロリドン2.0 g(PVP 40)、NaCl 81.8 g、Tris-HCl(pH 8.0)100 mM、EDTA20 mMを混ぜ合わせて、抽出バッファーを調製します。容量を1 Lに上げ、オートクレーブします。4°Cで保存します。 調製した抽出バッファーを分注し、使用直前に最終濃度のβ-メルカプトエタノールを1%(v / v)加えます。ウォーターバスまたはヒートブロックを使用してバッファーを65°Cに温めます。 ステップ1.9の手順に従って、アガロースを別々のRNaseフリー2 mL微量遠心チューブに押し出すことにより、各グラジエントシリンジを1 mLセクションに分割します。 サンプルを21,000 x g、4°Cで15分間遠心分離し、上清を捨ててサンプルを氷上に保持します。 600 μLの予め加温した抽出バッファーを、ペレット状にした押出アガロース1 mLごとに加えます。約200 μLのジルコニア/シリカビーズを加え、ビーズビーターを使用して30 Hz/sで3分間サンプルを均質化し、途中で一時停止してサンプルを氷上に2分間置きます。 サンプルを15,000 x g、4°Cで2分間遠心分離し、泡立ちを抑えます。600 μLのクロロホルム:イソアミルアルコール(24:1)をチューブに加え、10秒間ボルテックスしてサンプルを抽出します。 サンプルを15,000 x g、4°Cで8分間遠心分離します。上水相を新しいRNaseフリー微量遠心チューブに慎重に移し、600μLのクロロホルム:イソアミルアルコール(24:1)を移した上相とボルテックスに10秒間加えます。 サンプルを15,000 x g、4°Cで8分間遠心分離し、新しい上部水相を新しいRNaseフリーの微量遠心チューブに移します。転写した上相に等量のイソプロパノールを添加し、サンプルを-20°Cで数時間インキュベートします。 オプション:サンプルは-20°Cで一晩放置できます。 サンプルを16,100 x g、4°Cで30分間遠心分離することにより、RNA含有沈殿物を収集します。 上清を捨て、ペレットをRNaseフリー水で作った300μLの冷たい75%(v / v)エタノールで洗浄し、16,100 x g、4°Cで5分間遠心分離します。 手順5.10に従ってペレットを再度洗浄します。 エタノール上清を取り除いた後、ペレットを15分間自然乾燥させます。ペレットを100 μLのRNaseフリー水に溶解します。 サンプルをDNase Iで37°Cで30分間、メーカーのプロトコルに従って処理します。 300 μLの酸性フェノール:クロロホルム:IAA(125:24:1、pH 4.5)を添加してDNase Iを不活性化します。ボルテックスを10秒間ボルテックスし、室温で5分間インキュベートします。 16,100 x g、4°Cで5分間遠心分離し、新しいRNaseフリーの微量遠心チューブに移して上部水相を保持します。 オプション:上層を円錐形のチューブに組み合わせることにより、すべての複製シリンジで同じセグメントからのRNAをプールします。 RNA含有上相の容量に等しい1容量のイソプロパノールを添加し、最終濃度0.8 Mまで7.5 MのLiClを添加し、数回反転させて混合します。 サンプルを-20°Cで数時間インキュベートします。 オプション:サンプルは-20°Cで一晩放置できます。 サンプルを16,100 x g、4°Cで15分間遠心分離し、上清を慎重に廃棄します。RNaseフリー水に冷たい70%(v / v)エタノールを加え、16,100 x g、4°Cで5分間遠心分離し、上清を除去して、RNA含有ペレットを2回洗浄します。 ペレットを室温で10分間風乾させ、50 μLのRNaseフリー水に再懸濁します。RNAサンプルは-80°Cで保存します。 RNAの品質に応じてオプション:RNA精製キットを使用してサンプルを再精製し、低分子(<200 nt)のRNAを除去できます。 RNAサンプルに残留DNAが含まれていないことを確認するには、ユニバーサルバクテリア16S rRNA遺伝子プライマー27F/1492Rを使用してPCR増幅するためのテンプレートとして精製されたRNA1μLを使用します。1 μLのゲノムDNA(1:100に希釈)またはヌクレアーゼフリー水を含む2つのPCR反応を追加で含め、それぞれポジティブコントロールとネガティブコントロールとして使用します。 ゲル電気泳動14を用いて、1%アガロースTBEゲル上で製品を実行します。注:DNAコンタミネーションのないRNAサンプルでは、サンプルレーンにバンドが存在しないはずです。RNAサンプルにDNAコンタミネーションが見られる場合は、ステップ5.13からサンプルを再処理します。RNAはダウンストリーム分析の準備ができており、オプションでRNAインテグリティナンバー(RIN)を測定することにより、その完全性を定量化するために分析することができます。