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Environment

Agarose-basiertes Modellökosystem für die Kultivierung von Methanotrophen in einem Methan-Sauerstoff-Gegengradienten

Published: September 06, 2024
doi:
10.3791/67191
,
1Department of Chemistry and the Henry Eyring Center for Cell and Genome Science,University of Utah

Summary

Es wird ein Protokoll zur Erstellung eines einfachen Modellökosystems beschrieben, das den Methan-Sauerstoff-Gegengradienten im natürlichen Lebensraum von aeroben Methan-oxidierenden Bakterien nachbildet und so die Untersuchung ihrer Physiologie in einem räumlich aufgelösten Kontext ermöglicht. Modifikationen an gängigen biochemischen Assays für die Verwendung mit dem Agarose-basierten Modellökosystem werden ebenfalls beschrieben.

Abstract

Aerobe Methan-oxidierende Bakterien, bekannt als Methanotrophe, spielen eine wichtige Rolle im biogeochemischen Kreislauf. Methanotrophe besetzen eine spezifische Umweltnische innerhalb der Methan-Sauerstoff-Gegengradienten, die in Böden und Sedimenten zu finden sind, was ihr Verhalten auf individueller und gemeinschaftlicher Ebene beeinflusst. Herkömmliche Methoden zur Untersuchung der Physiologie dieser Mikroorganismen, die Treibhausgase mindern, verwenden jedoch oft homogene Planktonkulturen, die die räumlichen und chemischen Gradienten in der Umwelt nicht genau abbilden. Dies erschwert das Verständnis der Wissenschaftler, wie sich diese Bakterien in situ verhalten. Hier wird ein einfaches, kostengünstiges Modellökosystem namens Gradientenspritze beschrieben, das halbfeste Agarose verwendet, um die steilen Methan-Sauerstoff-Gegengradienten nachzubilden, die für die natürlichen Lebensräume von Methanotrophen charakteristisch sind. Die Gradientenspritze ermöglicht die Kultivierung methanotropher Stämme und die Anreicherung von gemischten methanoxidierenden Konsortien aus Umweltproben, wodurch Phänotypen sichtbar werden, die nur in diesem räumlich aufgelösten Kontext sichtbar sind. Dieses Protokoll berichtet auch über verschiedene biochemische Assays, die so modifiziert wurden, dass sie mit der halbfesten Agarose-Matrix kompatibel sind, was für Forscher, die Mikroorganismen in anderen Agarose-basierten Systemen kultivieren, wertvoll sein kann.

Introduction

Mikroorganismen, die an einer anoxisch-oxischen Grenzfläche leben, spielen oft eine wichtige ökologische Rolle1. Ein Beispiel sind aerobe Methan-oxidierende Bakterien (Methanotrophe), die in gegenläufigen Gradienten von Methan und Sauerstoff in Böden und Sedimenten vorkommen2. Diese Mikroorganismen verfügen über einzigartige metabolische und physiologische Eigenschaften, die es ihnen ermöglichen, die in ihrer Umgebung vorhandenen Gasgradienten zu nutzen, und sind seit Jahrzehnten Gegenstand laufender Forschung 3,4,5. Derzeit basieren die meisten veröffentlichten Forschungsarbeiten über Methanotrophen und methanoxidierende Gemeinschaften auf der Arbeit mit homogenen Planktonkulturen, die oft nicht in der Lage sind, die räumlichen und chemischen Gradienten zu erfassen, die ihren natürlichen mikrobiellen Lebensräumen inhärent sind. Diese Einschränkung behindert unser Verständnis der mikrobiellen Physiologie und unsere Fähigkeit, genomische Informationen mit phänotypischen Merkmalen zu verknüpfen.

Dieses Protokoll berichtet über ein einfaches, laborbasiertes Modellökosystem, das reproduzierbare Bedingungen für die Untersuchung sowohl spezifischer Methanotrophen wie Methylomonas sp. Stamm LW13 als auch von Methan-oxidierenden Gemeinschaften direkt aus Umweltbodenproben schafft. Wichtig ist, dass die Kultivierung in der Gradientenspritze zu gegengradientenspezifischen Phänotypen führt, die in homogenen Planktonkulturen nicht vorhanden sind6, was die Fähigkeit des Systems unterstreicht, neue Aspekte der methanotrophen Physiologie aufzudecken. Inspiriert von zuvor veröffentlichten Modellökosystemen 7,8,9 ist die Gradientenspritze eine vereinfachte Methode, mit der chemische und molekulare Informationen von Mikroorganismen gesammelt werden können, die mit diesem Ansatz kultiviert wurden.

Die berichteten Verfahren für genetische, chemische und molekulare Analysen wurden so modifiziert, dass sie zuverlässig an mikrobiellen Kulturen funktionieren, die in einer halbfesten Agarose-Matrix gezüchtet wurden. Diese Verfahren können auch für die Analyse von Bakterien nützlich sein, die in anderen halbfesten Agarose-basierten Systemen gezüchtet werden, wie z. B. solchen, die für bakterielle Weichagar-Schwimmassays verwendet werden. Die Anpassung dieser Analysen an räumlich aufgelöste Kontexte könnte neue Wege für die Untersuchung des mikrobiellen Lebens in ökologisch relevanteren Umgebungen eröffnen.

Protocol

Die Einzelheiten zu den Reagenzien und der in der Studie verwendeten Ausrüstung sind in der Materialtabelle aufgeführt. 1. Vorbereitung und Extrusion von Gradientenspritzen HINWEIS: Die Vorbereitung der Gradientenspritze sollte mit steriler Technik durchgeführt werden. Verwenden Sie mehrere Kolonien von Methylomonas sp. LW13, die frisch auf einer Platte gezüchtet wurden, um 6 mL Nitrat-Mineralsalze (NMS)-Medium in einem 18 mm x 150 mm großen Glasröhrchen zu inokulieren. Verschließen Sie das Röhrchen mit einem Serumstopfen und einem Aluminium-Bördelverschluss und fügen Sie Methan mit einer Spritze einer Endatmosphäre von 50 % (v/v) Methan in Luft hinzu. Schütteln Sie diese planktonische Flüssigkultur bei 200 U/min bei Raumtemperatur, bis sie trüb ist (ca. einen Tag). Flüssigkulturen 1:10 in frische Medien überführen. Züchten Sie die Flüssigkulturen von Methanotrophen weiter bis zum Wachstum in logarithmischer Phase (OD600 von ~0,5) und stellen Sie sie auf einen OD600 = 1,0 ein. Bereiten Sie die Spritzen vor, indem Sie den zugehörigen Kolben entfernen und in einem sterilen Behälter aufbewahren. Befestigen Sie eine sterile PTFE-Filterspitze an der Spritze und legen Sie sie mit der Spitze nach unten in ein Standard-Reagenzglasgestell. Mischen Sie für jede 10-ml-Spritze gründlich 1 ml Zellen aus Schritt 1.2 mit 5 ml NMS und 4 ml geschmolzener Agarose (0,5 % m/v, abgekühlt auf 55 °C) in einem sterilen konischen Röhrchen. Diese Volumina können skaliert werden, um mehrere Spritzen parallel zu füllen. Gießen Sie langsam ein oder verwenden Sie eine serologische Pipette, um die Mischung bis zur Markierung von 8 ml in jede Spritze zu geben. Lassen Sie die Agarose in den Spritzen fest werden (~15 min) und verschließen Sie sie dann mit einem sterilen 20-mm-Gummi-Butylstopfen. Befestigen Sie den Stopfen mit Laborklebeband an der Spritze und beschriften Sie ihn mit dem Spritzeninhalt. Um Methan in den Kopfraum der Spritze zu geben, füllen Sie eine große Spritze (60 mL) mit 100 % CH4 und befestigen Sie eine PTFE-Filterspitze (0,2 μm, 25 mm), die mit einer sterilen Nadel (23 G) verbunden ist. Stechen Sie mit der großen Spritze in den Gummistopfen und stechen Sie eine zweite sterile Nadel durch den Stopfen, um einen Gasaustritt zu schaffen. Drücken Sie den Kolben an der großen Spritze, damit 20 ml 100 % CH4 durch den Kopfraum gespült werden können, und achten Sie darauf, die Auslassnadel zu entfernen, wenn noch 1-2 ml CH4 in der großen Spritze verbleibt, um einen Sauerstoffrückfluss durch die Auslassnadel zu verhindern. Die Spritzen werden bei 18 °C inkubiert und die Schritte 1.6 und 1.7 täglich wiederholt, um das Methan wieder aufzufüllen. Um Agarose zu extrudieren, ersetzen Sie die PTFE-Filterspitze durch eine sterile 23-G-Nadel und ersetzen Sie den Gummistopfen durch den mitgelieferten Spritzenkolben. Drücken Sie langsam auf den Kolben, um 1-ml-Schritte in separate sterile 1,5-ml-Mikrozentrifugenröhrchen zu dosieren. 2. Bestimmung der Gaskonzentrationen gegen den Gradienten Messung des Gradienten des gelösten SauerstoffsSchneiden Sie mit einer Rasierklinge durch die Breite einer mit Agarose gefüllten Spritze (hergestellt nach den Schritten 1.1-1.8) in der Nähe des PTFE-Filters. Befestigen Sie die geöffnete Spritze an einer Spritzenpumpe, die auf eine Clark-Mikroelektrode ausgerichtet ist, wobei das offene Ende zur Spitze der Elektrode zeigt. Passen Sie die Einstellungen der Spritzenpumpe so an, dass die Spritze mit einer Geschwindigkeit von 1 ml/min (0,6 cm/min) in Richtung der Mikroelektrode bewegt wird. Beginnen Sie mit der Aufzeichnung der Messungen des gelösten Sauerstoffs in der Unisense Logger-Software, sobald sich die Spritzenpumpe in Bewegung setzt. Messung des MethangradientenErsetzen Sie unmittelbar vor der Extrusion die Spritzenfilterspitze durch einen Einweg-Absperrhahn, der mit einer 23-G-Nadel verbunden ist, und tauschen Sie den Gummistopfen schnell gegen einen Spritzenkolben aus. Fügen Sie acht 1-ml-Agarose-Aliquote hinzu, um evakuierte gasdichte 12-ml-Fläschchen zu trennen, und lassen Sie die Proben 1 h lang bei Raumtemperatur äquilibrieren. Äquilibrieren Sie Probenfläschchen auf Atmosphärendruck, indem Sie Fläschchen aufbrechen und sofort wieder verschließen oder eine Nadel durchstechen und schnell entfernen. Injizieren Sie 500 μl Headspace des Fläschchens mit einer gasdichten Spritze in einen Gaschromatographen mit Flammenionisationsdetektion (GC-FID). Erstellen Sie eine Kalibrierungskurve, die von CH4-Standards abgeleitet ist, um die Peakfläche (pA*min) in μmol/L umzurechnen. 3. Zellzählung in der Gradientenspritze DurchflusszytometrieExtrudieren Sie 1 ml Agarosesegmente aus Gradientenspritzen, die entweder mit Wildtyp- oder mutiertem LW13 inokuliert wurden, wie in Schritt 1.9 beschrieben. Bereiten Sie außerdem Agarose aus einer zellfreien, sterilen Spritze als Negativkontrolle vor und extrudieren Sie es. 0,75 mL 0,85 % (m/v) NaCl in Wasser zu allen extrudierten Agaroseproben geben und durch Vortexen homogenisieren. Verdünnen Sie die Proben im Verhältnis 1:10, indem Sie 100 μl in ein neues Mikrozentrifugenröhrchen überführen und 900 μl der Salzlösung hinzufügen. Fügen Sie 3 μl einer 1:1-Mischung aus SYTO9- und Propidiumiodid-Färbungen hinzu und inkubieren Sie dann 15 Minuten lang im Dunkeln bei Raumtemperatur. Um die Zellen pro ml Agarose zu bestimmen, beschallen Sie die Mikrosphären-Zählbead-Suspension in einem Wasserbad für 5 min. Geben Sie dann 10 μl der Suspension zu jeder Probe, bevor Sie die Durchflusszytometrie analysieren. Analysieren Sie Proben mit einem Durchflusszytometer 10,11 mit folgenden Parametern: Triggerung bei grüner Fluoreszenz, Flussrate von 10 μL/s und Partikelanalyserate unter 1.000 Partikeln/s.Vergleichen Sie SSC vs. FITC erstellt Dotplots zwischen zellfreien Kontrollproben und inokulierten Agaroseproben, um “bakterielle Ereignis”-Spannungsgatter zu zeichnen, die Hintergrund-Agarosepartikel ausschließen. Zeichnen Sie außerdem Spannungsgates für die Mikrosphären-Zählperlen, die zwischen den Proben konsistent sein sollten. Um die Konzentration der Zellen in jedem Agarosesegment innerhalb der Gradientenspritze zu bestimmen, verwenden Sie die folgende Gleichung, wobei zu beachten ist, dass der Verdünnungsfaktor für das obige Protokoll 17,7275 beträgt und dass 10-6 ml das Volumen einer Mikrosphärenkugel ist. Zählung von koloniebildenden Einheiten innerhalb der GradientenspritzeExtrudieren Sie 1 ml Agarosesegmente in separate, sterile 2-ml-Mikrozentrifugenröhrchen, fügen Sie 800 μl NMS hinzu und wirbeln Sie es 10 s lang auf, um das Pipettieren zu unterstützen. Bereiten Sie eine sterile 96-Well-Platte vor, indem Sie 180 μl NMS in jede Vertiefung geben. 20 μl verdünnte Agaroseproben in jede Vertiefung in der ersten Säule geben und zum Mischen pipettieren. Verdünnen Sie die Proben mit einer Mehrkanalpipette seriell verzehnfachen, indem Sie 20 μl aus der ersten Well-Reihe in die zweite Well-Reihe überführen und 10 Mal pipettieren, um sie zu mischen. Diesen Vorgang bis zur letzten Reihe der Platte fortsetzen. Beschriften Sie quadratische Gitterplatten, die NMS-Agar oder ein Medium Ihrer Wahl enthalten. Mit einer Mehrkanalpipette 5 μl aus einer Säule der 96-Well-Platte auf die Agarplatte sprühen. Abhängig von der Größe der Agarplatte können mehrere Säulen auf derselben Platte entdeckt werden. Inkubieren Sie Platten unter 40 % Methan an der Luft und wachsen Sie bei 18 °C. Zählen Sie die Bakterienkolonien nach 2-3 Tagen und bestimmen Sie die koloniebildenden Einheiten pro Milliliter (KBE/ml). 4. Assays zum Nachweis von Biomolekülen Polysaccharid-Assay1 ml Agarosesegmente in separate 2 ml-Mikrozentrifugenröhrchen extrudieren und mit 1 ml einer 1%igen Na2CO3 -Lösung in Wasser mischen. Die Proben werden 30 Minuten lang auf 80 °C erhitzt, alle 5-10 Minuten vortexiert, gefolgt von einer Zentrifugation bei 4.000 x g bei 4 °C für 20 Minuten. Der Überstand wird in Kombination mit drei Volumina 100 % Ethanol aufgefangen und mindestens 2 Stunden (oder über Nacht) bei 20 °C inkubiert. Die ethanolgefällten Polysaccharide werden durch Zentrifugation bei 16.100 x g bei 4 °C für 30 min aufgefangen. Entfernen Sie den Überstand und trocknen Sie das Pellet an der Luft. Resuspendieren Sie das Pellet in 100 μl entionisiertem Wasser. Der relative Polysaccharidgehalt jedes Agarosesegments wird mit einem kolorimetrischen Phenol-Schwefelsäure-Assay12,13 gemessen. Kombinieren Sie 50 μl des resuspendierten Extrakts mit 150 μl konzentrierter Schwefelsäure und 30 μl 5 % (v/v) Phenol in Wasser in einer durchsichtigen 96-Well-Platte. Messen Sie die Extinktion bei 490 nm mit einem Mikroplatten-Reader und berechnen Sie den relativen Polysaccharidgehalt jedes Agarosesegments als Prozentsatz der Extinktion des Agarosesegments, das dem PTFE-Filter am nächsten liegt. Protein-AssayExtrudieren Sie Agarose in separate 1,5-ml-Mikrozentrifugenröhrchen und überführen Sie 100 μl jedes Aliquots in Glasreagenzgläser. Bestimmen Sie die Gesamtproteinkonzentration mit dem Reagenzglasprotokoll eines BCA-Protein-Assay-Kits. Bereiten Sie Albumin-BSA-Standards mit Agarose vor, die aus einer sterilen Spritze extrudiert wird, als Verdünnungsmittel. Extrazellulärer DNA-AssayExtrudieren Sie Agarose in separate 1,5-ml-Mikrozentrifugenröhrchen und übertragen Sie jeweils 20 μl in 0,2 ml-Mikrozentrifugenröhrchen. Messen Sie die DNA-Konzentrationen mit dem kommerziell erhältlichen hochempfindlichen 1x dsDNA-Assay-Kit gemäß dem Protokoll des Herstellers. 5. RNA-Extraktion Bereiten Sie den Extraktionspuffer vor, indem Sie Folgendes in 800 ml RNase-freiem Wasser kombinieren: 2,0 g CTAB, 2,0 g Polyvinylpyrrolidon (PVP 40), 81,8 g NaCl, 100 mM Tris-HCl (pH 8,0) und 20 mM EDTA. Erhöhen Sie das Volumen auf 1 l und autoklavieren Sie es; Bei 4 °C lagern. Aliquotieren Sie den vorbereiteten Extraktionspuffer und fügen Sie kurz vor der Verwendung 1 % (v/v) Endkonzentration Beta-Mercaptoethanol hinzu. Erwärmen Sie den Puffer mit einem Wasserbad oder einem Wärmeblock auf 65 °C. Teilen Sie jede Gradientenspritze in 1-ml-Abschnitte auf, indem Sie Agarose in separate RNase-freie 2-ml-Mikrozentrifugenröhrchen extrudieren, indem Sie das Verfahren in Schritt 1.9 befolgen. Die Proben werden bei 21.000 x g, 4 °C 15 Minuten lang zentrifugiert, der Überstand wird entsorgt, wobei die Proben auf Eis gehalten werden. Fügen Sie 600 μl vorgewärmten Extraktionspuffer zu jedem pelletierten 1 ml extrudierter Agarose hinzu. Fügen Sie ca. 200 μl Zirkonoxid/Siliziumdioxid-Kügelchen hinzu und homogenisieren Sie die Proben 3 Minuten lang bei 30 Hz/s mit einem Rührbesen und halten Sie auf halbem Weg an, um die Proben für 2 Minuten auf Eis zu legen. Die Proben werden 2 Minuten lang bei 15.000 x g, 4 °C zentrifugiert, um die Schaumbildung zu reduzieren. Extrahieren Sie die Proben, indem Sie 600 μl Chloroform: Isoamylalkohol (24:1) in die Röhrchen geben und 10 s lang vortexen. Zentrifugieren Sie die Proben bei 15.000 x g, 4 °C für 8 min. Die obere wässrige Phase vorsichtig in ein neues RNase-freies Mikrozentrifugenröhrchen überführen und 600 μl Chloroform: Isoamylalkohol (24:1) in die übertragene obere Phase geben und 10 s lang vortexen. Zentrifugieren Sie die Proben 8 Minuten lang bei 15.000 x g, 4 °C und überführen Sie die neue obere wässrige Phase in ein neues RNase-freies Mikrozentrifugenröhrchen. Geben Sie ein gleiches Volumen Isopropanol in die übertragene obere Phase und inkubieren Sie die Proben mehrere Stunden lang bei -20 °C. Optional: Die Proben können über Nacht bei -20 °C belassen werden. Sammeln Sie RNA-haltige Ausfällungen durch Zentrifugieren von Proben bei 16.100 x g, 4 °C für 30 Minuten. Entsorgen Sie den Überstand und waschen Sie das Pellet mit 300 μl kaltem 75 % (v/v) Ethanol, das mit RNase-freiem Wasser hergestellt wurde, und zentrifugieren Sie es 5 Minuten lang bei 16.100 x g, 4 °C. Waschen Sie die Pellets erneut nach Schritt 5.10. Lassen Sie die Pellets nach dem Entfernen des Ethanolüberstands 15 Minuten lang an der Luft trocknen. Pellets in 100 μl RNasefreiem Wasser auflösen. Behandeln Sie die Proben 30 Minuten lang mit DNase I bei 37 °C gemäß dem Protokoll des Herstellers. DNase I durch Zugabe von 300 μl saurem Phenol inaktivieren: Chloroform: IAA (125:24:1, pH 4,5). 10 s Vortex ziehen und 5 min bei Raumtemperatur inkubieren. Zentrifugieren Sie 5 Minuten lang bei 16.100 x g, 4 °C und behalten Sie die obere wässrige Phase bei, indem Sie sie in ein neues RNase-freies Mikrozentrifugenröhrchen übertragen. Optional: Bündeln Sie RNA aus demselben Segment über alle Replikationsspritzen, indem Sie die oberen Phasen zu einem konischen Röhrchen kombinieren. Es wird 1 Volumen Isopropanol zugegeben, das dem Volumen der RNA-haltigen oberen Phase entspricht, und 7,5 M LiCl bis zu einer Endkonzentration von 0,8 M zugeben, wobei es mehrmals invertiert wird, um sich zu mischen. Inkubieren Sie die Proben für mehrere Stunden bei -20 °C. Optional: Die Proben können über Nacht bei -20 °C belassen werden. Die Proben werden bei 16.100 x g, 4 °C, 15 Minuten lang zentrifugiert und der Überstand vorsichtig entsorgt. Waschen Sie das RNA-haltige Pellet zweimal, indem Sie kaltes 70 % (v/v) Ethanol in RNase-freiem Wasser hinzufügen, 5 Minuten lang bei 16.100 x g, 4 °C zentrifugieren und den Überstand entfernen. Lassen Sie die Pellets 10 Minuten lang bei Raumtemperatur an der Luft trocknen und resuspendieren Sie sie in 50 μl RNase-freiem Wasser. Lagern Sie die RNA-Proben bei -80 °C. Optional, abhängig von der RNA-Qualität: Proben können mit einem RNA-Aufreinigungskit aufgereinigt werden, um kleine (<200 nt) RNAs zu entfernen. Um zu bestätigen, dass RNA-Proben keine Rest-DNA enthalten, verwenden Sie 1 μl gereinigte RNA als Vorlage für die PCR-Amplifikation unter Verwendung der universellen bakteriellen 16S rRNA-Genprimer 27F/1492R. Fügen Sie zwei zusätzliche PCR-Reaktionen hinzu, die entweder 1 μl genomische DNA (verdünnt 1:100) oder nukleasefreies Wasser enthalten, um als Positiv- bzw. Negativkontrolle zu dienen. Führen Sie die Produkte auf einem 1%igen Agarose-FSME-Gel mit Gelelektrophorese14 durch.HINWEIS: RNA-Proben ohne DNA-Kontamination sollten dazu führen, dass keine Bande in der Probenspur vorhanden ist. Wenn RNA-Proben eine DNA-Kontamination aufweisen, sind die Proben ab Schritt 5.13 erneut zu verarbeiten. Die RNA ist bereit für die nachgelagerte Analyse und kann optional analysiert werden, um ihre Integrität durch Messung der RNA-Integritätszahl (RIN) zu quantifizieren.

Representative Results

Hier wurde das Gradientenspritzenmodell-Ökosystem verwendet, um einen einzelnen Stamm (den methanotrophen Methylomonas sp. Stamm LW13) zu kultivieren (Abbildung 1A)6, aber es kann auch zur Anreicherung für eine Methan-oxidierende mikrobielle Gemeinschaft durch direkte Bodeninokulation verwendet werden (Abbildung 1B). Das Vorhandensein eines Methan-Sauerstoff-Gegengradienten wurde durch Messung der Konzentration von Methan und Sauerstoff in zellfreien und inokulierten Spritzen validiert (Abbildung 1C). Bei LW13-geimpften Gradientenspritzen bildete sich innerhalb eines Tages nach dem Spülen der Spritze ein Gegengradient, der über drei Tage Inkubation steiler wurde. Im gleichen Zeitraum bildete sich ein horizontales Band in der gleichen Tiefe, in der beide Gassubstrate ihre niedrigsten Konzentrationen erreichten (Abbildung 1A). Der steile Gasgradient und die Verarmung von Methan und Sauerstoff über die Tiefe des horizontalen Bandes hinaus zeigten, dass LW13 Methan aerob metabolisierte und einen Phänotyp erzeugte, der in homogenen Planktonkulturen nicht beobachtet wurde. Dieser Phänotyp wird auch von anderen methanotrophen Bakterien produziert, die aus derselben Umweltprobe wie LW136 isoliert wurden. Stammabhängige Variationen im Zeitpunkt und in der Tiefe der horizontalen Bandenentwicklung zwischen verschiedenen methanotrophen Stämmen deuteten darauf hin, dass die horizontale Bande durch das spezifische Verhalten jeder Mikrobe beeinflusst wurde, wenn sie in einem räumlich aufgelösten Kontext kultiviert wurde6. Die Anzahl der Zellen im gesamten Agarose-Pfropfen wurde mittels Durchflusszytometrie und Koloniezahlen (KBE/ml) gemessen (Abbildung 2A). Diese Methode wurde verwendet, um die Zellverteilung und das Überleben von Wildtyp-LW13 mit einem mutierten Stamm von LW13 zu vergleichen, der eine Deletion im Fucose-4-O-Acetyltransferase (OAT)-Gen enthielt, von dem zuvor gezeigt wurde, dass es die horizontale Bandenentwicklung beeinflusst6. Die ΔOAT-Mutante von LW13 wies im Vergleich zum Wildtyp über 6 Tage ein geringeres Gesamtwachstum in der Gradientenspritze auf, ein Effekt, der in homogenen Planktonkulturen der gleichen Stämme nicht beobachtet wurde6. Der mutierte Stamm bildete nicht die gleiche ausgeprägte horizontale Bande wie der LW13-Wildtyp, wenn er in der Gradientenspritze kultiviert wurde (Abbildung 2B). Die Zellzahl und das Erscheinungsbild der horizontalen Banden wurden nach der Genkomplementation im mutierten Stamm auf ein ähnliches Niveau wie beim Wildtyp gebracht. Diese Ergebnisse zeigen, dass die Gradientenspritze verwendet werden kann, um Gene mit bestimmten Phänotypen zu verknüpfen, die nur im Methan-Sauerstoff-Gegengradienten vorhanden sind. Eine Vielzahl von genetischen, chemischen und molekularen Techniken wurde für den Einsatz mit Bakterien angepasst, die in einer halbfesten Agarose-Matrix gezüchtet wurden. Das Ökosystem des Gradientenspritzenmodells kann problemlos für biomolekulare Standard-Quantifizierungsassays verwendet werden, wobei nicht inokulierte Agarose als Negativkontrolle einbezogen wird. Es wurde die Konzentration von drei verschiedenen Biomolekülen gemessen, die häufig in extrazellulären polymeren Substanzen und Biofilmen vorkommen: Polysaccharide, Proteine und extrazelluläre DNA15 (Abbildung 3). In LW13-geimpften Spritzensegmenten wies die horizontale Bande signifikant mehr Polysaccharide auf als andere Segmente, ohne dass das Protein oder die extrazelluläre DNA signifikant zunahmen. RNA-seq wurde verwendet, um transkriptionelle Unterschiede in LW13 zu messen, das in verschiedenen Tiefen der Spritze wächst. Die robuste RNA-Extraktion wurde unter Verwendung eines CTAB-basierten Extraktionspuffers erreicht, gefolgt von herkömmlichen Phenol-Chloroform-Extraktions- und Fällungsschritten. Die Ergebnisse der RNA-seq-Analyse wurden später verwendet, um Gene zu identifizieren, die an der Produktion der horizontalen Polysaccharidbande beteiligt sind. Diese Ergebnisse deuten darauf hin, dass die für die Schaffung eines ortsaufgelösten Modellökosystems essentielle halbfeste Agarose weitere biochemische Analysen nicht verhindert, die in der Regel planktonischen und plattenbasierten Kulturen vorbehalten sind. Abbildung 1: Das Ökosystem des Modellmodells der Gradientenspritze. (A) Die Gradientenspritze, die mit dem methanotrophen Methylomonas sp. LW13 beimpft wurde. Innerhalb von zwei Tagen nach dem Spülen der Spritze mit 100 % Methan bildet sich ein deutliches horizontales Band (Pfeilspitze). (B) Nahaufnahmen von Gradientenspritzen, die mit 10-1 und 10-4 verdünnter Erde beimpft und zwei Wochen lang inkubiert wurden. Gradientenspritzen mit stärker verdünntem Boden führten zu kugelförmigen Kolonien in der gesamten Agarose, während konzentriertere Bodeninokula zu einer deutlichen Bande führten. (C) Charakterisierung des Methan-Sauerstoff-Gegengradienten in LW13-inokulierten und sterilen Gradientenspritzen nach dreitägiger Inkubation. Der graue Balken zeigt den Tiefenbereich an, in dem sich das Polysaccharidband befand. Die Daten zeigen die mittlere ± SD von drei unabhängigen Experimenten mit jeweils drei technischen Replikaten. Die Panels (A) und (C) wurden von Beals et al.6 modifiziert. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen. Abbildung 2: Quantifizierung des LW13-Wildtyps und der LW13-Mutante nach Inkubation in der Gradientenspritze. (A) Die Gesamtzahl der LW13-Zellen pro ml extrudierter Agarose, die an Tag 0 und Tag 7 aus Gradientenspritzen gewonnen wurden, gemessen mittels Durchflusszytometrie. ΔOAT enthält eine Deletion des Fucose-4-O-Acetyltransferase-Gens, das in Zellen, die sich in der Tiefe der Polysaccharidbande befinden, stark exprimiert wird. ΔOAT+OAT enthält das OAT-Gen, das an einer distalen Stelle des ΔOAT-Genoms eingefügt ist. *, signifikant unterschiedlich (zweiseitiger heteroszedastischer t-Test, α = 0,05); n.s., nicht signifikant anders. Die Daten zeigen die mittlere ± SD von drei unabhängigen Experimenten mit jeweils zwei technischen Replikaten. (B) Horizontale Bandenentwicklung in Gradientenspritzen, die mit LW13-Wildtyp, ΔOAT oder ΔOAT+OAT nach siebentägiger Inkubation inokuliert wurden. Diese Abbildung wurde von Beals et al.6 modifiziert. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen. Abbildung 3: Quantifizierung von Biomolekülen in zunehmender Tiefe der Gradientenspritze. Relativer Polysaccharidgehalt (%), Proteinkonzentration (μg/ml) und DNA-Konzentration (ng/μl) in acht Abschnitten von LW13-inokulierten Gradientenspritzen, die sieben Tage lang inkubiert wurden (gefüllte Kreise; offene Kreise zeigen Werte von sterilen Gradientenspritzen). Die Daten zeigen die mittlere ± SD von drei unabhängigen Experimenten mit jeweils drei technischen Replikaten. Für den relativen Polysaccharidgehalt zeigt * einen signifikanten Unterschied zur sterilen Kontrolle in äquivalenter Tiefe an (zweiseitiger heteroszedastischer t-Test, α = 0,05). Für Protein- und DNA-Konzentrationen zeigt * eine signifikante Differenz zu dem Schnitt an, der die horizontale Bande enthält (unidirektionale ANOVA mit Tukey-Kramer-Post-hoc-Analyse); n.s., nicht signifikant. Die Abbildung wurde von Beals et al.6 modifiziert. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

Discussion

Methoden zur Kultivierung von Methanotrophen
Methanotrophen werden seit Jahrzehnten untersucht, um ihre Physiologie, ihr individuelles und gemeinschaftliches Verhalten in der natürlichen Umwelt und ihr Potenzial zur Methanminderung in industriellen Anwendungen zu verstehen. Während dieser Studien wurde ein Großteil der durchgeführten Forschung mit homogenen Planktonkulturen durchgeführt, bei denen der räumliche Kontext verloren geht. Das Ökosystem des Gradientenspritzenmodells wurde entwickelt, um den für natürliche methanotrophe Lebensräume charakteristischen Methan-Sauerstoff-Gegengradienten im Labor nachzubilden, was es den Forschern ermöglicht, Methanotrophe zu untersuchen, die in einer Umgebung wachsen, die der Evolution dieser Organismen ähnlicher ist.

In den letzten 30 Jahren haben Forscher den Methan-Sauerstoff-Gegengradienten im Labor mit einer Vielzahl von Methoden nachgebildet, oft mit dem primären Ziel, Methanotrophe aus gemischten methanoxidierenden Konsortien zu isolieren und zu klassifizieren. Diese Verfahren können in zwei Ansätze unterteilt werden, die beide die Verwendung gegenüberliegender Kammern aus Methan und Sauerstoff beinhalten: das Suspendieren von relativ ungestörtem Boden auf einer Membran 16,17,18 oder das Impfen kleiner Mengen von Erde oder reiner Bakterienkultur in ein minimales Medium in Agarose 7,8,19. Die hier beschriebene Gradientenspritzenmethode kombiniert den spritzenbasierten Ansatz von Dedysh und Mitarbeitern9 mit der Kultivierung von Methanotrophen aus früheren Arbeiten von Amaral und Knowles8 sowie Schink und Mitarbeitern7. Letztere Methode legte den Grundstein für die Kultivierung von Methanotrophen in einem Methan-Sauerstoff-Gegengradienten und nutzte einen kontinuierlichen Fluss von Methan und Sauerstoff auf beiden Seiten des Agarose-Pfropfens. Dies sorgt zwar für eine konstantere Umgebung, erhöht jedoch die Komplexität des Versuchsaufbaus und erfordert spezielle Gasquellen.

Im Gegensatz dazu beruht die hier beschriebene Gradientenspritze auf einer täglichen Spülung der Spritze, um frisches Methan bereitzustellen, ein Prozess, der weniger als eine Minute pro Spritze dauert, während sie einen kontinuierlichen Zugang zu Luftsauerstoff durch eine sterile PTFE-Filterspitze ermöglicht. Diese einfachere Methode könnte eine breitere Akzeptanz dieses Modellökosystems für die Untersuchung von Methanotrophen in einem räumlich aufgelösten Kontext ermöglichen. Das beschriebene Protokoll beschreibt auch chemische und molekulare Analysen, die direkt an Bakterien durchgeführt werden können, die in der halbfesten Agarose inkubiert sind. Infolgedessen müssen Bakterien vor der Analyse nicht außerhalb der Agarosematrix herausgeschnitten und kultiviert werden, wodurch die Gasgradientenbedingungen zum Zeitpunkt der Probenahme erhalten bleiben.

Bemerkungen zum Protokoll
Da die Bakterien in einer volumetrischen Polypropylen-Spritze kultiviert werden, können die Forscher den zugehörigen Spritzenkolben verwenden, um den Agarose-Stopfen genau und reproduzierbar zu segmentieren, während die räumliche Integrität der Agarose-Matrix, die noch im Spritzenzylinder verbleibt, erhalten bleibt. Ohne das luftdichte Design, das der Spritze eigen ist, müssten die Agarose-Stopfen aus dem Spritzenzylinder entfernt und in Scheiben geschnitten werden, was zu einer Unsicherheit im Volumen der Agarosesegmente führt und nicht quantifizierbare Mengen an Methan und gelöstem Sauerstoff in die Atmosphäre freisetzt. Die Agarose-Extrusion durch eine sterile Nadel vereinfacht die Probenvorbereitung und hilft, extrudierte Segmente zu homogenisieren, ohne Bakterienzellen zu scheren. Diese Methode ermöglicht es den Forschern, jede inokulierte Gradientenspritze in mindestens acht Agarosesegmente zu unterteilen und parallele Experimente an Methanotrophen durchzuführen, die in einer Reihe von Sauerstoff- und Methankonzentrationen wachsen.

Bei der Optimierung der RNA-Extraktion aus Agarose mit hohem Polysaccharidgehalt wurde festgestellt, dass gängige Reagenzien wie Guanidiumthiocyanat und TRIzol zu einer Agarosegelierung führten, die die Reinigungskolonnen verstopfte und der Pelletierung durch Zentrifugation widerstand. Geringe RNA-Ausbeuten und -Qualität waren ebenfalls ein Problem, da große Polysaccharidmoleküle Nukleinsäuren einfangen können, während kleine Polysaccharide mit RNA20 co-präzipitieren können. Stattdessen wurde ein Extraktionspuffer verwendet, der das kationische Tensid CTAB enthält, das die Lipidmembranenauflöst 20; und NaCl, das die Bildung von CTAB-Nukleinsäurekomplexen verhindert und die Ausfällung von Nukleinsäuren ermöglicht, aber Polysaccharide in Lösung21 hält. RNasen wurden durch die Aufnahme von β-Mercaptoethanol in den CTAB-Puffer denaturiert. Für das RNA-seq-Experiment wurde ein optionaler säulenbasierter Aufreinigungsschritt integriert, um kleine RNAs (<200 Nukleotide) vor der Bibliotheksvorbereitung auszuschließen.

Einschränkungen und Überlegungen
Während das NMS und die Agarose eine minimale Mediumsmatrix für die Kultivierung methanotropher Bakterien darstellen, bildet die Gradientenspritze, wie sie hier beschrieben wird, nur die Gasgradienten methanotropher Lebensräume nach, nicht aber andere Gradienten, die in diesen Umgebungen vorhanden sind, wie z. B. Spurenmetalle22, Salzgehalt23 oder andere Nährstoffe24. Es ist möglich, dass diese Gradienten in Zukunft zu einem ähnlichen System hinzugefügt werden können. Darüber hinaus begrenzt das Volumen der Spritze (8 mL Agarose) die Gesamtbiomasse pro Spritze, so dass für einige Analysen mehrere Spritzen zusammengefasst werden müssen (wie in Schritt 5.16 beschrieben). Obwohl die Handspritze die Agarose bequem in 1-ml-Aliquots segmentiert, begrenzt ihre Größe auch den Kopfraum auf etwa 4 ml, wodurch die Menge an Methan, die für die kultivierten Mikroben gelagert werden kann, begrenzt wird. Da die Methanoxidationsraten proportional zur Wachstumsrate von aeroben Methanotrophen25 sind, wird eine tägliche Auffüllung von Headspace-Methan empfohlen. Dies kann zwar immer noch zu Perioden mit Methanbegrenzung führen, aber diese Zeiträume sind im Labor reproduzierbar und ahmen wahrscheinlich Situationen nach, die in natürlichen Umgebungen zu finden sind.

Bei der Verwendung der Gradientenspritze erfordert das Vorhandensein der Agarose-Polysaccharide einige Anpassungen an den Assays, die zur Analyse von Methanotrophen verwendet werden, die in diesem System gezüchtet werden. Protokolle, die den Transfer kleiner Volumina extrudierter Agarose erfordern, erfordern beispielsweise mehrere Verdünnungsschritte mit gründlicher Homogenisierung zwischen den einzelnen Verdünnungen, um ein genaues Pipettieren zu gewährleisten. Darüber hinaus ist in Fällen wie dem Polysaccharid-Assay, in denen die der Agarosematrix inhärenten Polysaccharide mit dem Schwefelsäure-Phenol-Reagenz reagieren, die Einbeziehung einer sterilen, zellfreien Agarose-Negativkontrolle unerlässlich. Frühe Versuche, diese Probleme durch die Einbeziehung des Agarose-hydrolysierenden Enzyms β-Agarase zu mildern, waren erfolglos und führten eine unbekannte Variable in die biologischen Experimente ein. Die Verwendung mehrerer technischer Replikate, eine gründliche Verdünnung, Homogenisierung und die Einbeziehung von Kontrollen können verwendet werden, um die meisten der der Agarosematrix inhärenten Herausforderungen zu mildern.

Anträge
Zusätzlich zu Studien mit einem einzelnen Stamm kann die Gradientenspritze die Co-Kultur mehrerer Stämme unterstützen, und Erde kann anstelle einer reinen Bakterienkultur als Inokulum verwendet werden. Das einfache Design des Ökosystems des Gradientenspritzenmodells ist für die Kultivierung anderer Arten von Mikroorganismen geeignet, die an der Grenzfläche zwischen anoxischen und oxischen Umgebungen existieren, indem anstelle von Methan ein anderes Gassubstrat wie H2 oder CO verwendet wird. Zusammenfassend lässt sich sagen, dass die Verwendung eines einfachen, räumlich aufgelösten Modellökosystems es den Forschern ermöglicht, die einzigartige Physiologie und metabolische Anpassungen von anoxisch-oxischen Mikroorganismen zu untersuchen und Gene mit organismischen Phänotypen zu verknüpfen.

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Diese Arbeit wurde durch eine Startfinanzierung des Department of Chemistry der University of Utah und den NSF CAREER Award #2339190 unterstützt. Wir danken den Mitgliedern des Puri Labs für hilfreiche Gespräche. Wir danken Rachel Hurrell (University of Utah) für die anfängliche Anleitung zum Durchflusszytometrie-Experiment.

Materials

1% Gas mix analytical standard Supelco 22561 1% each component in nitrogen: carbon monoxide, carbon dioxide, hydrogen, methane and oxygen
100% Methane Airgas ME CP300 chemically pure grade
15 ppm Gas mix analytical standard Supelco 23470-U 15 ppm each component in nitrogen: methane, ethane, ethylene, acetylene, propane, propylene, propyne, and n-butane
1x Nitrate mineral salts  see CAS numbers below Dissolve the following in Mili-Q water and autoclave:  0.2 g/L MgSO4·7H2O, 0.2 g/L CaCl2·6H2O, 1 g/L KNO3, and 30 μM LaCl3. Before use, add trace elements to a 1X final concentration and phosphate buffer (pH 6.8) to a final concentration of 5.8 mM.
23 G needle BD Biosciences 305194 sterile, Luer-Lok
500x Trace elements see CAS numbers below Dissolve the following in Milli-Q water: 1.0 g/L Na2-EDTA, 2.0 g/L FeSO4·7H2O, 0.8 g/L ZnSO4·7H2O, 0.03 g/L MnCl2·4H2O, 0.03 g/L H3BO3, 0.2 g/L CoCl2·6H2O, 0.6 g/L CuCl2·2H2O, 0.02 g/L NiCl2·6H2O, and 0.05 g/L Na2MoO·2H2O.
96 Well plate CELLTREAT 229596 sterile
Acid phenol:chloroform:IAA (125:24:1) Invitrogen AM9720  pH 4.5
Agarose Fisher Scientific BP160 molecular biology grade, CAS 9012-36-6
Aluminum crimp seals VWR 30618-460 20 mm
Bead beater Qiagen 9003240 TissueLyser III
Butyl rubber stopper Chemglass Life Science 50-143-854 20 mm, blue
Chloroform:isoamyl alcohol (24:1) Millipore Sigma 25666 BioUltra, for molecular biology
Clark-type O2 microelectrode Unisense OX-500
DEPC-treated water Thermo Scientific R0601
DNase I (Ambion) Invitrogen AM2222
Flow cytometer Beckman Coulter CytoFLEX
Gas chromatograph (flame ionization detection) Agilent 6890N
Gastight analytical syringe Hamilton 81220 1750 TLL
Gastight analytical syringe needle Hamilton 7729-07 22 G, metal hub needle, 2 in, point style 5
Gas-tight vials Labco 938W Exetainer vial: 12 mL, round bottom
Glass culture tubes Bellco Glass 2048-00150 18 x 150 mm
LiCl precipitation solution (7.5 M) Invitrogen AM9480
One-way stopcock VWR MFLX30600-00 inlet port: female luer, outlet port: male luer lock
Petri dish, square Fisher Scientific FB0875711A 100 x 100 mm
Phosphate buffer, 0.2 M (pH 6.8) see CAS numbers below Dissolve the following in Milli-Q water and autoclave: 12.24 g/L KH2PO4, 26.29 g/L Na2HPO4 · 7H2O
Pierce BCA Protein Assay Kit  Thermo Scientific 23225
PTFE syringe filter tip Thermo Scientific 03-050-469 hydrophobic, pore size: 0.2 µm, diameter: 4 mm
Qubit 1x dsDNA High Sensitivity Assay Kit  Invitrogen Q33230
Qubit 4 Fluorometer Invitrogen Q33238
RNA Clean & Concentrator-5 Zymo Research R1013
Serum stopper Fisher Scientific 03-340-302 20 mm
Syringe BD Biosciences 302995 Luer-Lock, 10 mL, single use, sterile
Syringe pump New Era Pump Systems Inc. 1000-US NE-1000 one channel programmable
SYTO9, propidium iodide, microspheres Invitrogen L34856 LIVE/DEAD BacLight Bacterial Viability Kit
Zirconia/silica beads BioSpec Products 11079101z 0.1 mm diameter
Chemical reagents CAS number
CaCl2·6H2O 7774-34-7
CoCl2·6H2O 7791-13-1
Concentrated sulfuric acid 7664-93-9
CTAB, cetrimonium bromide 57-09-0
CuCl2·2H2O 10125-13-0
Ethanol 64-17-5   
FeSO4·7H2O 7782-63-0
H3BO3 10043-35-3
Isopropanol 69-63-0
KH2PO4 7778-77-0
KNO3 7757-79-1
LaCl3 10099-58-8
MgSO4·7H2O 10034-99-8
MnCl2·4H2O 13446-34-9
Na2CO3, sodium carbonate 497-19-8
Na2-EDTA 139-33-3
Na2HPO4 · 7H2O 7782-85-6
Na2MoO·2H2O 10102-40-6
NaCl, sodium chloride 7647-14-5
NiCl2·6H2O 7791-20-0
Phenol (90% solution in water) 108-95-2
PVP40, polyvinylpyrrolidone 9003-39-8
Tris-HCl 1185-53-1
ZnSO4·7H2O 7446-20-0
β-Mercaptoethanol 60-24-2
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References

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Beals, D. G., Puri, A. W. Agarose-Based Model Ecosystem for Cultivating Methanotrophs in a Methane-Oxygen Counter Gradient. J. Vis. Exp. (211), e67191, doi:10.3791/67191 (2024).
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