Metan-oksijen karşı gradyanında metanotrof yetiştirmek için agaroz tabanlı model ekosistem

Çalışmada kullanılan reaktiflerin ve ekipmanların detayları Malzeme Tablosunda listelenmiştir. 1. Degrade şırıngaların hazırlanması ve ekstrüzyonu NOT: Gradyan şırınga hazırlığı steril teknik kullanılarak yapılmalıdır. 18 mm x 150 mm’lik bir cam tüpte 6 mL nitrat mineral tuzları (NMS) ortamını aşılamak için bir plaka üzerinde taze yetiştirilmiş birkaç Methylomonas sp. LW13 kolonisi kullanın. Tüpü bir serum tıpa ve alüminyum kıvrımlı conta ile kapatın ve havadaki (h/h) metanın nihai atmosferine bir şırınga kullanarak metan ekleyin. Bu planktonik sıvı kültürü oda sıcaklığında 200 rpm’de bulanıklaşana kadar (yaklaşık bir gün) çalkalayın. Sıvı kültürleri 1:10 oranında taze ortama geçirin. Metanotrofların sıvı kültürlerini log faz büyümesine (OD600 / ~ 0.5) büyütmeye devam edin ve bir OD600 = 1.0’a ayarlayın. Beraberindeki pistonu çıkararak ve steril bir kapta tutarak şırıngaları hazırlayın. Şırıngaya steril bir PTFE filtre ucu takın ve ucu aşağı bakacak şekilde standart bir test tüpü rafına yerleştirin. Her 10 mL şırınga için, steril bir konik tüpte 5 mL NMS ve 4 mL erimiş agaroz (% 0.5 m / v, 55 ° C’ye soğutulmuş) ile adım 1.2’den 1 mL hücreleri iyice karıştırın. Bu hacimler, birden fazla şırıngayı paralel olarak doldurmak için ölçeklendirilebilir. Karışımı her bir şırıngaya 8 mL işaretine kadar eklemek için yavaşça dökün veya serolojik bir pipet kullanın. Şırıngaların içindeki agarozun katılaşmasına izin verin (~ 15 dakika), ardından steril 20 mm kauçuk bütil tıpa ile kapatın. Laboratuvar bandı kullanarak tıpayı şırıngaya sabitleyin ve şırınga içeriği ile etiketleyin. Şırınga kafa boşluğuna metan eklemek için, büyük (60 mL) bir şırıngayı 0CH4 ile doldurun ve steril bir iğneye (0.2 G) bağlı bir PTFE filtre ucu (25 μm, 23 mm) takın. Lastik tıpayı büyük şırınga ile delin ve bir gaz çıkışı oluşturmak için durdurucudan ikinci bir steril iğneyi delin. 20 mL 0 CH4’ün baş boşluğundan akmasına izin vermek için büyük şırınga üzerindeki pistona bastırın, büyük şırıngada 1-2 mL CH4 kaldığında çıkış iğnesini çıkarmaya dikkat edin çıkış iğnesinden oksijen geri akışını önlemek için. Şırıngaları 18 °C’de inkübe edin, metanı yenilemek için her gün 1.6 ve 1.7 adımlarını tekrarlayın. Agarozu çıkarmak için, PTFE filtre ucunu steril bir 23 G iğne ile değiştirin ve lastik tıpayı verilen şırınga pistonu ile değiştirin. 1 mL’lik artışları ayrı steril 1.5 mL mikrosantrifüj tüplerine dağıtmak için pistonu yavaşça bastırın. 2. Karşı gradyan gaz konsantrasyonlarının belirlenmesi Çözünmüş oksijen gradyanının ölçülmesiPTFE filtresine yakın agaroz dolgulu bir şırınganın (1.1-1.8 adımları izlenerek hazırlanmıştır) genişliğini kesmek için bir tıraş bıçağı kullanın. Açılan şırıngayı, açık ucu elektrotun ucuna bakacak şekilde Clark tipi bir mikroelektroda yönlendirilmiş bir şırınga pompasına sabitleyin. Şırıngayı mikroelektroda doğru 1 mL/dk (0,6 cm/dk) hızında hareket ettirmek için şırınga pompasının ayarlarını yapın; şırınga pompası hareket etmeye başlar başlamaz çözünmüş oksijen ölçümlerini Unisense Logger yazılımına kaydetmeye başlayın. Metan gradyanının ölçülmesiEkstrüzyondan hemen önce, şırınga filtre ucunu 23 G’lik bir iğneye bağlı tek yönlü bir muslukla değiştirin ve lastik tıpayı bir şırınga pistonu ile hızlı bir şekilde değiştirin. Boşaltılmış 12 mL gaz geçirmez şişeleri ayırmak için sekiz adet 1 mL agaroz alikotu ekleyin ve numunelerin oda sıcaklığında 1 saat dengelenmesine izin verin. Numune şişelerini kırarak ve hemen yeniden kapatarak veya bir iğneyi delerek ve hızlı bir şekilde çıkararak numune şişelerini atmosferik basınca dengeleyin. Gaz geçirmez bir şırınga kullanarak alev iyonizasyon algılamalı (GC-FID) bir gaz kromatografına 500 μL flakon üst boşluğu enjekte edin. Tepe alanını (pA*dk) μmol/L’ye dönüştürmek için CH4 standartlarından türetilen bir kalibrasyon eğrisi oluşturun. 3. Degrade şırıngadaki hücreleri sayma Akış sitometrisiAdım 1.9’da belirtildiği gibi vahşi tip veya mutant LW13 ile aşılanmış gradyan şırıngalardan 1 mL agaroz segmentini ekstrüde edin. Ayrıca, negatif kontrol olarak hücre içermeyen, steril bir şırıngadan agaroz hazırlayın ve ekstrüde edin. Tüm ekstrüde agaroz örneklerine suya 0.75 mL %0.85 (m/h) NaCl ekleyin ve girdaplama ile homojenize edin. Ayrıca, 100 μL’yi yeni bir mikrosantrifüj tüpüne aktararak ve 900 μL tuz çözeltisi ekleyerek numuneleri 1:10 oranında seyreltin. 3 μL 1: 1 SYTO9 ve propidyum iyodür boyaları karışımı ekleyin, ardından karanlıkta oda sıcaklığında 15 dakika inkübe edin. Agarozun mL başına hücrelerini belirlemek için, mikroküre sayma boncuğu süspansiyonunu bir su banyosunda 5 dakika boyunca sonikleştirin. Ardından, akış sitometrisi analizinden önce her numuneye 10 μL süspansiyon ekleyin. Numuneleri bir akış sitometresi10,11 ile aşağıdaki parametrelerle analiz edin: yeşil floresan üzerinde tetikleme, 10 μL/s akış hızı ve 1.000 partikül/s’nin altında partikül analiz hızı.SSC ile karşılaştırın. FITC nokta çizimleri, arka plan agaroz parçacıklarını dışlayan “bakteriyel olay” voltaj kapıları çizmek için hücresiz kontrol numuneleri ile aşılanmış agaroz numuneleri arasındadır. Ek olarak, mikroküre sayma boncukları için numuneler arasında tutarlı olması gereken voltaj kapıları çizin. Degrade şırınga içindeki her bir agaroz segmentindeki hücrelerin konsantrasyonunu belirlemek için, yukarıdaki protokol için seyreltme faktörünün 17.7275 olduğunu ve 10-6 mL’nin bir mikroküre boncuğunun hacmi olduğunu belirterek aşağıdaki denklemi kullanın. Gradyan şırınga içinde koloni oluşturan birimlerin sayımı1 mL agaroz segmentini ayrı, steril 2 mL mikrosantrifüj tüplerine ekstrüde edin, 800 μL NMS ekleyin ve pipetlemeye yardımcı olmak için 10 saniye boyunca vorteksleyin. Her oyuğa 180 μL NMS ekleyerek steril bir 96 oyuklu plaka hazırlayın. İlk kolondaki her bir oyuğa 20 μL seyreltilmiş agaroz numunesi ekleyin ve karıştırmak için pipetleyin. Çok kanallı bir pipet kullanarak, ilk kuyucuk sırasından 20 μL’yi ikinci kuyucuk sırasına aktararak ve karıştırmak için 10 kez pipetleyerek numuneleri on kat seri olarak seyreltin. Plakanın son sırasına kadar bu işleme devam edin. NMS agar veya tercih edilen ortamı içeren kare ızgara plakalarını etiketleyin. Çok kanallı bir pipet kullanarak, 96 oyuklu plakanın bir kolonundan agar plakasına 5 μL’yi noktalayın. Agar plakasının boyutuna bağlı olarak, aynı plaka üzerinde birden fazla sütun tespit edilebilir. Plakaları havada% 40 metanın altında inkübe edin ve 18 ° C’de büyütün. 2-3 gün sonra bakteri kolonilerini sayın ve mililitre başına koloni oluşturan birimleri (CFU/mL) belirleyin. 4. Biyomolekül tespit testleri Polisakkarit testi1 mL agaroz segmentini ayrı 2 mL mikrosantrifüj tüplerine ekstrüde edin ve su içinde 1 mL %1 (m/h)Na2CO3çözeltisi ile karıştırın. Numuneleri her 5-10 dakikada bir girdaplama ile 30 dakika boyunca 80 ° C’ye ısıtın, ardından 20 dakika boyunca 4 ° C’de 4.000 x g’da santrifüjleyin. Üç hacim% 100 etanol ile birleştirilmiş süpernatanı toplayın ve en az 2 saat (veya gece boyunca) 20 ° C’de inkübe edin. Etanol ile çökeltilmiş polisakkaritleri, 30 dakika boyunca 4 ° C’de 16.100 x g’da santrifüjleme yoluyla toplayın. Süpernatanı çıkarın ve peleti havayla kurutun. Peleti 100 μL deiyonize suda tekrar süspanse edin. Bir fenol-sülfürik asit kolorimetrik test12,13 kullanarak her bir agaroz segmentinin nispi polisakkarit içeriğini ölçün. 50 μL yeniden süspanse edilmiş ekstraktı 150 μL konsantre sülfürik asit ve 30 μL %5 (h/h) fenol ile 96 oyuklu berrak bir plakada suda birleştirin. Bir mikroplaka okuyucu kullanarak 490 nm’de absorbansı ölçün ve her bir agaroz segmentinin nispi polisakkarit içeriğini, PTFE filtresine en yakın agaroz segmentinin absorbansının yüzdesi olarak hesaplayın. Protein tahliliAgarozu ayrı 1.5 mL mikrosantrifüj tüplerine ekstrüde edin ve her bir alikotun 100 μL’sini cam test tüplerine aktarın. Bir BCA protein tahlil kitinin test tüpü protokolünü kullanarak toplam protein konsantrasyonunu belirleyin. Seyreltici olarak steril bir şırıngadan ekstrüde edilmiş agaroz ile albümin BSA standartlarını hazırlayın. Hücre dışı DNA tahliliAgarozu ayrı 1.5 mL mikrosantrifüj tüplerine ekstrüde edin ve her birinin 20 μL’sini 0.2 mL mikrosantrifüj tüplerine aktarın. Üreticinin protokolünü takip ederek ticari olarak temin edilebilen 1x dsDNA yüksek hassasiyetli tahlil kitini kullanarak DNA konsantrasyonlarını ölçün. 5. RNA ekstraksiyonu Aşağıdakileri 800 mL RNaz içermeyen suda birleştirerek ekstraksiyon tamponunu hazırlayın: 2.0 g CTAB, 2.0 g polivinilpirolidon (PVP 40), 81.8 g NaCl, 100 mM Tris-HCl (pH 8.0) ve 20 mM EDTA. Hacmi 1 L’ye getirin ve otoklavlayın; 4 °C’de saklayın. Hazırlanan ekstraksiyon tamponunu ayırın ve kullanımdan hemen önce %1 (h/h) nihai beta-merkaptoetanol konsantrasyonu ekleyin. Bir su banyosu veya ısı bloğu kullanarak tamponu 65 °C’ye ısıtın. Adım 1.9’daki prosedürü izleyerek agarozu ayrı RNaz içermeyen 2 mL mikrosantrifüj tüplerine ekstrüde ederek her gradyan şırıngayı 1 mL’lik bölümlere bölün. Numuneleri 21.000 x g, 4 °C’de 15 dakika santrifüjleyin ve numuneleri buz üzerinde tutarak süpernatanı atın. Her peletlenmiş 1 mL ekstrüde agaroza 600 μL önceden ısıtılmış ekstraksiyon tamponu ekleyin. Yaklaşık 200 μL zirkonya/silika boncuk ekleyin ve bir boncuk çırpıcı kullanarak numuneleri 30 Hz/s’de 3 dakika boyunca homojenize edin, numuneleri 2 dakika boyunca buz üzerine yerleştirmek için yarıya kadar duraklatın. Köpürmeyi azaltmak için numuneleri 15.000 x g, 4 °C’de 2 dakika santrifüjleyin. Tüplere 600 μL kloroform: izoamil alkol (24:1) ekleyerek ve 10 saniye boyunca girdaplayarak numuneleri çıkarın. Numuneleri 15.000 x g, 4 °C’de 8 dakika santrifüjleyin. Üst sulu fazı dikkatlice yeni bir RNaz içermeyen mikrosantrifüj tüpüne aktarın ve aktarılan üst faza 600 μL kloroform: izoamil alkol (24: 1) ekleyin ve 10 saniye boyunca girdap yapın. Numuneleri 15.000 x g, 4 ° C’de 8 dakika santrifüjleyin ve yeni üst sulu fazı yeni bir RNaz içermeyen mikrosantrifüj tüpüne aktarın. Aktarılan üst faza eşit hacimde izopropanol ekleyin ve numuneleri -20 °C’de birkaç saat inkübe edin. İsteğe bağlı: numuneler gece boyunca -20 °C’de bırakılabilir. Numuneleri 16.100 x g, 4 °C’de 30 dakika santrifüjleyerek RNA içeren çökeltileri toplayın. Süpernatanı atın ve peleti RNaz içermeyen su ile yapılan 300 μL soğuk (h/h) etanol ile yıkayın ve 16.100 x g, 4 °C’de 5 dakika santrifüjleyin. Adım 5.10’u izleyerek peletleri tekrar yıkayın. Etanol süpernatantını çıkardıktan sonra, peletlerin 15 dakika kurumasını bekleyin. Peletleri 100 μL RNaz içermeyen suda çözün. Numuneleri, üreticinin protokolünü izleyerek 30 dakika boyunca 37 ° C’de DNaz I ile muamele edin. 300 μL asit fenol ekleyerek DNaz I’i inaktive edin: kloroform: IAA (125: 24: 1, pH 4.5). 10 saniye vorteksleyin ve oda sıcaklığında 5 dakika inkübe edin. 16.100 x g, 4 ° C’de 5 dakika santrifüjleyin ve üst sulu fazı yeni bir RNaz içermeyen mikrosantrifüj tüpüne aktararak tutun. İsteğe bağlı: Üst fazları konik bir tüpte birleştirerek tüm replike şırıngalarda aynı segmentten RNA’yı havuzlayın. RNA içeren üst fazın hacmine eşit 1 hacim izopropanol ekleyin ve karıştırmak için birkaç kez ters çevirerek 0,8 M’lik bir nihai konsantrasyona 7,5 M LiCl ekleyin. Numuneleri -20 °C’de birkaç saat inkübe edin. İsteğe bağlı: numuneler gece boyunca -20 °C’de bırakılabilir. Numuneleri 16.100 x g, 4 °C’de 15 dakika santrifüjleyin ve süpernatanı dikkatlice atın. RNA içeren peleti, RNaz içermeyen suya soğuk (h/h) etanol ekleyerek, 16.100 x g, 4 °C’de 5 dakika santrifüjleyerek ve süpernatanı çıkararak iki kez yıkayın. Peletlerin oda sıcaklığında 10 dakika kurumasına izin verin ve 50 μL RNaz içermeyen suda tekrar süspanse edin. RNA örneklerini -80 °C’de saklayın. RNA kalitesine bağlı olarak isteğe bağlı: Numuneler, küçük (<200 nt) RNA'ları çıkarmak için bir RNA saflaştırma kiti kullanılarak yeniden saflaştırılabilir. RNA örneklerinin artık DNA içermediğini doğrulamak için, evrensel bakteriyel 16S rRNA gen primerleri 27F/1492R kullanılarak PCR amplifikasyonu için şablon olarak 1 μL saflaştırılmış RNA kullanın. Sırasıyla pozitif ve negatif kontroller olarak hizmet etmek için 1 μL genomik DNA (1:100 seyreltilmiş) veya nükleaz içermeyen su içeren iki ek PCR reaksiyonu ekleyin. Ürünleri, jel elektroforezi14 kullanarak% 1 agaroz TBE jeli üzerinde çalıştırın.NOT: DNA kontaminasyonu olmayan RNA örnekleri, numune şeridinde bir bant olmamasına neden olmalıdır. RNA örnekleri DNA kontaminasyonu gösteriyorsa, adım 5.13’ten başlayarak örnekleri yeniden işleyin. RNA, aşağı akış analizi için hazırdır ve isteğe bağlı olarak, RNA Bütünlük Numarasını (RIN) ölçerek bütünlüğünü ölçmek için analiz edilebilir.