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Neuroscience

Actividad similar a las convulsiones de alta calidad a partir de cortes agudos de cerebro utilizando un sistema complementario de matriz de microelectrodos de alta densidad de semiconductores de óxido metálico

Published: September 27, 2024
doi:
10.3791/67065
, , , , , , , ,
1Department of Cell Biology and Physiology,Brigham Young University, 2Neuroscience Center,Brigham Young University, 3Department of Statistics,Brigham Young University, 4Department of Biology,Brigham Young University, 5Department of Physics and Astronomy,Brigham Young University

Summary

Aquí, describimos un protocolo para el uso de sistemas complementarios de matriz de microelectrodos de alta densidad de semiconductores de óxido metálico (CMOS-HD-MEA) para registrar la actividad similar a las convulsiones de cortes de cerebro ex vivo .

Abstract

Los sistemas complementarios de microelectrodos de alta densidad de semiconductores de óxido metálico (CMOS-HD-MEA) pueden registrar la actividad neurofisiológica de cultivos celulares y cortes de cerebro ex vivo con un detalle electrofisiológico sin precedentes. Los CMOS-HD-MEA se optimizaron por primera vez para registrar la actividad de las unidades neuronales de alta calidad a partir de cultivos celulares, pero también se ha demostrado que producen datos de calidad a partir de cortes agudos de retina y cerebelos. Los investigadores han utilizado recientemente CMOS-HD-MEAs para registrar potenciales de campo local (LFP) a partir de cortes agudos de cerebro de roedores corticales. Un LFP de interés es la actividad similar a las convulsiones. Si bien muchos usuarios han producido descargas epileptiformes breves y espontáneas utilizando CMOS-HD-MEA, pocos usuarios producen de manera confiable una actividad similar a las convulsiones de calidad. Muchos factores pueden contribuir a esta dificultad, incluido el ruido eléctrico, la naturaleza inconsistente de producir actividad similar a las convulsiones cuando se usan cámaras de grabación sumergidas y la limitación de que los chips 2D CMOS-MEA solo graban desde la superficie del corte del cerebro. Las técnicas detalladas en este protocolo deberían permitir a los usuarios inducir y registrar de manera consistente una actividad similar a las convulsiones de alta calidad a partir de cortes agudos de cerebro con un sistema CMOS-HD-MEA. Además, este protocolo describe el tratamiento adecuado de los chips CMOS-HD-MEA, la gestión de soluciones y cortes de cerebro durante la experimentación y el mantenimiento del equipo.

Introduction

Los sistemas de matriz de microelectrodos de alta densidad (HD-MEA) disponibles en el mercado, que incluyen un chip MEA con miles de puntos de registro 1,2 y una plataforma MEA para amplificar y digitalizar los datos, son una herramienta emergente para la investigación electrofisiológica. Estos sistemas HD-MEA utilizan tecnología complementaria de semiconductores de óxido metálico (CMOS) para registrar datos electrofisiológicos con alta sensibilidad de cultivos celulares y preparaciones de cortes de cerebro ex vivo. Estos sistemas MEA ofrecen una resolución espacial y temporal sin precedentes para la investigación neurofisiológica a través de una alta densidad de electrodos y relaciones señal-ruido de calidad3. Esta tecnología se ha utilizado principalmente para estudiar los potenciales de acción extracelular, pero también puede capturar potenciales de campo local (LFP) de alta calidad de varias preparaciones de cortes de cerebro neuronales 4,5,6,7,8,9,10,11,12,13,14,15 . Debido a la capacidad de grabación de alta resolución mencionada anteriormente de los sistemas CMOS-HD-MEA, los usuarios pueden rastrear la actividad electrofisiológica con gran precisión espacial 16,17,18. Esta capacidad es particularmente relevante para el seguimiento de los patrones de propagación de los LFPde red 5,12,15,19,20,21. Por lo tanto, los sistemas CMOS-HD-MEA pueden proporcionar una comprensión sin precedentes de los patrones de propagación de la actividad fisiológica y patológica a partir de diversos cultivos celulares y preparaciones de cortes de cerebro. Cabe destacar que estas capacidades de los sistemas CMOS-HD-MEA pueden permitir a los investigadores contrastar los patrones de convulsiones de diferentes regiones del cerebro simultáneamente y analizar cómo varios compuestos antiepilépticos afectan estos patrones. De este modo, proporciona un método innovador para estudiar la ictogénesis y la propagación ictal y para comprender cómo la farmacología interrumpe la actividad patológica de la red 7,10,14. Por lo tanto, estas nuevas capacidades de los sistemas CMOS-HD-MEA pueden contribuir significativamente a la investigación de trastornos neurológicos, así como ayudar en la investigación de descubrimientos de fármacos 5,7,11,22. Nuestro objetivo es proporcionar detalles sobre el uso de los sistemas CMOS-HD-MEA para estudiar la actividad similar a las convulsiones.

Al utilizar sistemas CMOS-HD-MEA para estudiar los LFP, como la actividad epileptiforme en cortes agudos de cerebro, los usuarios pueden enfrentar muchos desafíos, incluido el ruido eléctrico debilitante, mantener el corte saludable durante la experimentación y detectar una señal de calidad de un chip CMOS-MEA BIDIMENSIONAL (2D) que registra solo desde la superficie del corte de cerebro. Este protocolo describe los pasos básicos para conectar a tierra correctamente la plataforma MEA y otros equipos utilizados en la experimentación, un paso crucial que puede requerir una personalización individual para cada configuración de laboratorio. Además, discutimos los pasos para ayudar a mantener el corte de cerebro saludable durante las grabaciones largas en las cámaras sumergidas utilizadas con los sistemas CMOS-HD-MEA 23,24,25. Además, a diferencia de los métodos de registro electrofisiológico más comunes, que registran desde lo profundo del corte cerebral, la mayoría de los sistemas CMOS-HD-MEA utilizan chips 2D que no penetran en el corte. Por lo tanto, estos sistemas requieren una capa externa neuronal saludable para producir la mayoría de las señales LFP registradas. Otros desafíos incluyen la visualización de la enorme cantidad de datos generados por miles de electrodos. Para superar estos desafíos, recomendamos un protocolo simple pero efectivo que aumente la probabilidad de lograr una actividad epileptiforme de red de alta calidad que se propague a través del corte del cerebro. También incluimos una breve descripción de una interfaz gráfica de usuario (GUI) disponible públicamente que desarrollamos con recursos asociados para ayudar en la visualización de datos10.

Publicaciones anteriores han proporcionado protocolos relacionados para el uso de sistemas de registro MEA 26,27,28,29. Sin embargo, este trabajo tiene como objetivo ayudar a los experimentadores que utilizan sistemas CMOS-HD-MEA con chips 2D, específicamente a aquellos que buscan estudiar la actividad epileptiforme de alta calidad a partir de cortes de cerebro. Además, comparamos dos de las manipulaciones de soluciones más comunes para la inducción de actividad similar a las convulsiones, a saber, los paradigmas 0 Mg2+ y 4-AP, para ayudar a los usuarios a identificar los medios convulsivos más apropiados para su aplicación específica. Aunque el protocolo se centra principalmente en la generación de actividad similar a las convulsiones, puede modificarse para explorar otros fenómenos electrofisiológicos utilizando cortes de cerebro.

Protocol

Los procedimientos con ratones fueron aprobados por el Comité Institucional de Cuidado y Uso de Animales (IACUC) de la Universidad Brigham Young. En los siguientes experimentos se utilizaron ratones machos y hembras (n = 8) C57BL/6 de al menos P21. Figura 1: Figura esquemática de la experimentac…

Representative Results

Como es habitual cuando se visualiza la actividad de muchos canales 1,4,5,10, nos parece beneficioso generar primero un gráfico ráster de los datos que adquirimos con el CMOS-HD-MEA (figura 4A,C,E). Este gráfico puede crear una vista panorámica de la actividad en todos los canales de grabación…

Discussion

Este protocolo incluye pautas específicas relacionadas con el manejo agudo del corte de cerebro que abordan los problemas comunes que enfrentan los usuarios de CMOS-HD-MEA, a saber, el desarrollo de ruido debajo del corte de cerebro y el mantenimiento de un entorno saludable para el corte de cerebro. El desarrollo de ruido debajo del corte ocurre cuando el corte no se adhiere correctamente a la matriz; Si la rebanada de cerebro no se adhiere adecuadamente, se pueden formar bolsas de air…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Los autores agradecen a los miembros anteriores y actuales del laboratorio Parrish por sus ediciones en este manuscrito. También nos gustaría agradecer a Alessandro Maccione de 3Brain por sus comentarios sobre este trabajo. Este trabajo fue financiado por un premio AES/EF Junior Investigator Award y por los Colegios de Ciencias de la Vida y de Ciencias Físicas y Matemáticas de la Universidad Brigham Young.

Materials

2D Workbench Cloudray LM04CLLD26B
4-Aminopyridine Sigma-Aldrich 275875
Accura Chip 3Brain Accura HD-MEA CMOS-HD-MEA chip
Agarose Thermo Fisher Scientific BP160-100
Vibration isolation table Kinetic Systems 91010124
Beaker for the slice holding chamber, 270 mL VWR 10754-772
BioCam 3Brain BioCAM DupleX CMOS-HD-MEA platform
Brainwave Software 3Brain Version 4 CMOS-HD-MEA software
Calcium Chloride Thermo Fisher Scientific BP510-500
Carbogen Airgas X02OX95C2003102
Carbogen Airgas 12005
Carbogen Stones Supelco 59277
Compresstome Precissionary VF-300-0Z
Computer Dell Precission3650
Crocodile Clip Grounding Cables JWQIDI B06WGZG17W
Detergent Metrex 10-4100-0000
D-Glucose Macron Fine Chemicals 4912-12
Dihydrogen Sodium Phosphate Thermo Fisher Scientific BP329-500
DinoCam Dino-Lite AM73915MZTL
Ethanol Thermo Fisher Scientific A407P-4
Forceps Fine Science Tools 11980-13
Hot plate Thermo Fisher Scientific SP88857200
Ice Machine Hoshizaki F801MWH
Inflow and outflow needles Jensen Global JG 18-3.0X
Inline Solution Heater Warner Instruments SH-27B
Isofluorine Dechra 08PB-STE22002-0122
Kim Wipes Thermo Fisher Scientific 06-666
Magnesium Chloride Thermo Fisher Scientific FLM33500
Micropipets Gilson F144069
Mili-Q Water Filter Mili-Q ZR0Q008WW
Paintbrush Daler Rowney AF85 Round: 0
Paper Filter Whatman EW-06648-24
Parafilm American National Can PM996
Perfusion System Multi Channel System PPS2
Pipetor Thermo Fisher Scientific FB14955202
Platinum Harp 3Brain 3Brain
Potassium Chloride Thermo Fisher Scientific P330-3
Razor blade Personna BP9020
Scale Metter Toledo AB204
Scissors Solingen 92008
Slice Holding Chamber Custom Custom Custom 3D Printer Design, available upon request
Sodium Bicarbonate Macron Fine Chemicals 7412-06
Sodium Chloride Thermo Fisher Scientific S271-3
Temperature Control Box Warner Instruments TC344B
Transfer Pipettes Genesee Scientific 30-200
Tubing Tygon B-44-3 TPE
Vibratome VZ-300 Precissionary VF-00-VM-NC
Weigh Boat Electron Microscopy Sciences 70040
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