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Neuroscience

Atividade semelhante a convulsões de alta qualidade de fatias cerebrais agudas usando um sistema complementar de matriz de microeletrodos de alta densidade com semicondutor de óxido metálico

Published: September 27, 2024
doi:
10.3791/67065
, , , , , , , ,
1Department of Cell Biology and Physiology,Brigham Young University, 2Neuroscience Center,Brigham Young University, 3Department of Statistics,Brigham Young University, 4Department of Biology,Brigham Young University, 5Department of Physics and Astronomy,Brigham Young University

Summary

Aqui, descrevemos um protocolo para o uso de sistemas complementares de matriz de microeletrodos de alta densidade de semicondutores de óxido metálico (CMOS-HD-MEAs) para registrar a atividade semelhante a convulsões de fatias cerebrais ex vivo .

Abstract

Os sistemas complementares de matriz de microeletrodos de alta densidade de óxido metálico-semicondutor (CMOS-HD-MEA) podem registrar a atividade neurofisiológica de culturas de células e fatias cerebrais ex vivo em detalhes eletrofisiológicos sem precedentes. Os CMOS-HD-MEAs foram otimizados pela primeira vez para registrar a atividade da unidade neuronal de alta qualidade a partir de culturas de células, mas também demonstraram produzir dados de qualidade a partir de cortes agudos de retina e cerebelar. Os pesquisadores usaram recentemente CMOS-HD-MEAs para registrar potenciais de campo local (LFPs) de fatias cerebrais agudas de roedores corticais. Um LFP de interesse é a atividade semelhante a convulsões. Embora muitos usuários tenham produzido descargas epileptiformes breves e espontâneas usando CMOS-HD-MEAs, poucos usuários produzem de forma confiável atividade semelhante a convulsões de qualidade. Muitos fatores podem contribuir para essa dificuldade, incluindo ruído elétrico, a natureza inconsistente de produzir atividade semelhante a convulsões ao usar câmaras de gravação submersas e a limitação de que os chips 2D CMOS-MEA registram apenas a partir da superfície da fatia do cérebro. As técnicas detalhadas neste protocolo devem permitir que os usuários induzam e registrem consistentemente atividades semelhantes a convulsões de alta qualidade de fatias cerebrais agudas com um sistema CMOS-HD-MEA. Além disso, este protocolo descreve o tratamento adequado dos chips CMOS-HD-MEA, o gerenciamento de soluções e fatias cerebrais durante a experimentação e a manutenção do equipamento.

Introduction

Os sistemas de matriz de microeletrodos de alta densidade (HD-MEA) disponíveis comercialmente, que incluem um chip MEA com milhares de pontos de gravação 1,2 e uma plataforma MEA para amplificar e digitalizar os dados, são uma ferramenta emergente para a pesquisa eletrofisiológica. Esses sistemas HD-MEA usam tecnologia de semicondutor de óxido metálico complementar (CMOS) para registrar dados eletrofisiológicos com alta sensibilidade de culturas de células e preparações de fatias cerebrais ex vivo. Esses sistemas MEA oferecem resolução espacial e temporal sem precedentes para pesquisas neurofisiológicas por meio de alta densidade de eletrodos e relações sinal-ruídode qualidade 3. Essa tecnologia tem sido usada principalmente para estudar potenciais de ação extracelulares, mas também pode capturar potenciais de campo local (LFPs) de alta qualidade de várias preparações neuronais de fatias cerebrais 4,5,6,7,8,9,10,11,12,13,14,15 . Devido à capacidade de gravação de alta resolução dos sistemas CMOS-HD-MEA mencionada acima, os usuários podem rastrear a atividade eletrofisiológica com grande precisão espacial 16,17,18. Esse recurso é particularmente relevante para rastrear padrões de propagação de LFPs de rede 5,12,15,19,20,21. Portanto, os sistemas CMOS-HD-MEA podem fornecer uma compreensão sem precedentes dos padrões de propagação da atividade fisiológica e patológica de várias culturas de células e preparações de fatias de cérebro. É importante notar que esses recursos dos sistemas CMOS-HD-MEA podem permitir que os pesquisadores contrastem os padrões de convulsões de diferentes regiões do cérebro simultaneamente e testem como vários compostos antiepilépticos afetam esses padrões. Ao fazer isso, fornece um método inovador para estudar a ictogênese e a propagação ictal e para entender como a farmacologia interrompe a atividade patológica da rede 7,10,14. Portanto, essas novas capacidades dos sistemas CMOS-HD-MEA podem contribuir significativamente para a pesquisa de distúrbios neurológicos, bem como auxiliar na pesquisa de descoberta de medicamentos 5,7,11,22. Nosso objetivo é fornecer detalhes sobre o uso de sistemas CMOS-HD-MEA para estudar a atividade semelhante a convulsões.

Ao usar sistemas CMOS-HD-MEA para estudar LFPs, como a atividade epileptiforme em fatias cerebrais agudas, os usuários podem enfrentar muitos desafios, incluindo ruído elétrico debilitante, manter a fatia saudável durante a experimentação e detectar um sinal de qualidade de um chip CMOS-MEA bidimensional (2D) que grava apenas da superfície da fatia cerebral. Este protocolo descreve as etapas básicas para o aterramento adequado da plataforma MEA e outros equipamentos usados na experimentação, uma etapa crucial que pode exigir personalização individual para cada configuração de laboratório. Além disso, discutimos as etapas para ajudar a manter o corte cerebral saudável durante longas gravações nas câmaras submersas usadas com os sistemas CMOS-HD-MEA 23,24,25. Além disso, em contraste com os métodos de gravação eletrofisiológica mais comuns, que registram profundamente a fatia do cérebro, a maioria dos sistemas CMOS-HD-MEA usa chips 2D que não penetram na fatia. Portanto, esses sistemas requerem uma camada externa neuronal saudável para produzir a maioria dos sinais LFP registrados. Outros desafios incluem a visualização da enorme quantidade de dados gerados por milhares de eletrodos. Para superar esses desafios, recomendamos um protocolo simples, mas eficaz, que aumente a probabilidade de alcançar uma atividade epileptiforme de rede de alta qualidade que se propaga pela fatia cerebral. Também incluímos uma breve descrição de uma interface gráfica do usuário (GUI) disponível publicamente que desenvolvemos com recursos associados para auxiliar na visualização de dados10.

Publicações anteriores forneceram protocolos relacionados para o uso de sistemas de registro MEA 26,27,28,29. No entanto, este trabalho visa auxiliar os experimentadores que usam sistemas CMOS-HD-MEA com chips 2D, especificamente aqueles que buscam estudar a atividade epileptiforme de alta qualidade a partir de fatias de cérebro. Além disso, comparamos duas das manipulações de solução mais comuns para indução de atividade semelhante a convulsões, ou seja, os paradigmas 0 Mg2+ e 4-AP, para ajudar os usuários a identificar os meios convulsivantes mais apropriados para sua aplicação específica. Embora o protocolo seja focado principalmente na geração de atividade semelhante a convulsões, ele pode ser modificado para explorar outros fenômenos eletrofisiológicos usando fatias de cérebro.

Protocol

Os procedimentos envolvendo camundongos foram aprovados pelo Comitê Institucional de Cuidados e Uso de Animais (IACUC) da Universidade Brigham Young. Camundongos C57BL/6 machos e fêmeas (n = 8) com idade mínima de P21 foram utilizados nos experimentos a seguir. Figura 1: Figura esquemática da …

Representative Results

Como é padrão ao visualizar a atividade de muitos canais 1,4,5,10, achamos benéfico primeiro gerar um gráfico raster dos dados que adquirimos com o CMOS-HD-MEA (Figura 4A,C,E). Esse gráfico pode criar uma visão panorâmica da atividade em todos os canais de gravação em cada fatia do cérebr…

Discussion

Este protocolo inclui diretrizes específicas relacionadas ao gerenciamento de fatias cerebrais agudas que abordam problemas comuns enfrentados pelos usuários de CMOS-HD-MEA, ou seja, desenvolvimento de ruído sob a fatia cerebral e manutenção de um ambiente saudável para a fatia cerebral. O desenvolvimento de ruído sob a fatia ocorre quando a fatia não está devidamente aderida à matriz; Se a fatia do cérebro não estiver adequadamente aderida, bolsas de ar podem se formar embai…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Os autores agradecem aos antigos e atuais membros do laboratório Parrish por suas edições neste manuscrito. Também gostaríamos de agradecer a Alessandro Maccione, da 3Brain, por seu feedback sobre este trabalho. Este trabalho foi financiado por um Prêmio de Investigador Júnior AES / EF e pelas Faculdades de Ciências da Vida e de Ciências Físicas e Matemáticas da Universidade Brigham Young.

Materials

2D Workbench Cloudray LM04CLLD26B
4-Aminopyridine Sigma-Aldrich 275875
Accura Chip 3Brain Accura HD-MEA CMOS-HD-MEA chip
Agarose Thermo Fisher Scientific BP160-100
Vibration isolation table Kinetic Systems 91010124
Beaker for the slice holding chamber, 270 mL VWR 10754-772
BioCam 3Brain BioCAM DupleX CMOS-HD-MEA platform
Brainwave Software 3Brain Version 4 CMOS-HD-MEA software
Calcium Chloride Thermo Fisher Scientific BP510-500
Carbogen Airgas X02OX95C2003102
Carbogen Airgas 12005
Carbogen Stones Supelco 59277
Compresstome Precissionary VF-300-0Z
Computer Dell Precission3650
Crocodile Clip Grounding Cables JWQIDI B06WGZG17W
Detergent Metrex 10-4100-0000
D-Glucose Macron Fine Chemicals 4912-12
Dihydrogen Sodium Phosphate Thermo Fisher Scientific BP329-500
DinoCam Dino-Lite AM73915MZTL
Ethanol Thermo Fisher Scientific A407P-4
Forceps Fine Science Tools 11980-13
Hot plate Thermo Fisher Scientific SP88857200
Ice Machine Hoshizaki F801MWH
Inflow and outflow needles Jensen Global JG 18-3.0X
Inline Solution Heater Warner Instruments SH-27B
Isofluorine Dechra 08PB-STE22002-0122
Kim Wipes Thermo Fisher Scientific 06-666
Magnesium Chloride Thermo Fisher Scientific FLM33500
Micropipets Gilson F144069
Mili-Q Water Filter Mili-Q ZR0Q008WW
Paintbrush Daler Rowney AF85 Round: 0
Paper Filter Whatman EW-06648-24
Parafilm American National Can PM996
Perfusion System Multi Channel System PPS2
Pipetor Thermo Fisher Scientific FB14955202
Platinum Harp 3Brain 3Brain
Potassium Chloride Thermo Fisher Scientific P330-3
Razor blade Personna BP9020
Scale Metter Toledo AB204
Scissors Solingen 92008
Slice Holding Chamber Custom Custom Custom 3D Printer Design, available upon request
Sodium Bicarbonate Macron Fine Chemicals 7412-06
Sodium Chloride Thermo Fisher Scientific S271-3
Temperature Control Box Warner Instruments TC344B
Transfer Pipettes Genesee Scientific 30-200
Tubing Tygon B-44-3 TPE
Vibratome VZ-300 Precissionary VF-00-VM-NC
Weigh Boat Electron Microscopy Sciences 70040
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Blotter, M. L., Stubbs, I. W., Norby, J. H., Holmes, M., Kearsley, B., Given, A., Hine, K., Shepherd, M. R., Parrish, R. R. High-Quality Seizure-Like Activity from Acute Brain Slices Using a Complementary Metal-Oxide-Semiconductor High-Density Microelectrode Array System. J. Vis. Exp. (211), e67065, doi:10.3791/67065 (2024).
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