Hier schetsen we een protocol voor het gebruik van complementaire metaaloxide-halfgeleider high-density micro-elektrode array-systemen (CMOS-HD-MEA’s) om aanvalsachtige activiteit van ex vivo hersenplakjes vast te leggen.
Complementaire metaaloxide-halfgeleider high-density micro-electrode array (CMOS-HD-MEA)-systemen kunnen neurofysiologische activiteit van celculturen en ex vivo hersenplakjes registreren in ongekend elektrofysiologisch detail. CMOS-HD-MEA’s werden voor het eerst geoptimaliseerd om hoogwaardige neuronale eenheidsactiviteit van celculturen vast te leggen, maar er is ook aangetoond dat ze kwaliteitsgegevens produceren van acute retinale en cerebellaire plakjes. Onderzoekers hebben onlangs CMOS-HD-MEA’s gebruikt om lokale veldpotentialen (LFP’s) van acute, corticale hersenplakjes van knaagdieren vast te leggen. Een LFP van belang is epileptische activiteit. Hoewel veel gebruikers korte, spontane epileptiforme ontladingen hebben geproduceerd met behulp van CMOS-HD-MEA’s, produceren maar weinig gebruikers op betrouwbare wijze hoogwaardige aanvalsachtige activiteit. Veel factoren kunnen bijdragen aan deze moeilijkheid, waaronder elektrische ruis, de inconsistente aard van het produceren van epileptische activiteit bij het gebruik van ondergedompelde opnamekamers en de beperking dat 2D CMOS-MEA-chips alleen opnemen vanaf het oppervlak van de hersenschijf. De technieken die in dit protocol worden beschreven, moeten gebruikers in staat stellen om met een CMOS-HD-MEA-systeem consequent hoogwaardige aanvalsachtige activiteit van acute hersenplakjes te induceren en vast te leggen. Daarnaast schetst dit protocol de juiste behandeling van CMOS-HD-MEA-chips, het beheer van oplossingen en brain slices tijdens experimenten en het onderhoud van apparatuur.
In de handel verkrijgbare high-density micro-electrode array (HD-MEA)-systemen, waaronder een MEA-chip met duizenden registratiepunten 1,2 en een MEA-platform om de gegevens te versterken en te digitaliseren, zijn een opkomend hulpmiddel voor elektrofysiologisch onderzoek. Deze HD-MEA-systemen maken gebruik van complementaire metaaloxide-halfgeleidertechnologie (CMOS) om elektrofysiologische gegevens met hoge gevoeligheid vast te leggen van celculturen en ex vivo hersenschijfpreparaten. Deze MEA-systemen bieden een ongekende ruimtelijke en temporele resolutie voor neurofysiologisch onderzoek via hoge elektrodedichtheid en hoogwaardige signaal-ruisverhoudingen3. Deze technologie is meestal gebruikt om extracellulaire actiepotentialen te bestuderen, maar het kan ook hoogwaardige lokale veldpotentialen (LFP’s) van verschillende neuronale hersenschijfpreparaten vastleggen 4,5,6,7,8,9,10,11,12,13,14,15 . Dankzij de bovengenoemde opnamemogelijkheid met hoge resolutie van CMOS-HD-MEA-systemen kunnen gebruikers elektrofysiologische activiteit met grote ruimtelijke nauwkeurigheid volgen 16,17,18. Deze mogelijkheid is met name relevant voor het volgen van propagatiepatronen van netwerk-LFP’s 5,12,15,19,20,21. Daarom kunnen CMOS-HD-MEA-systemen een ongekend inzicht bieden in de voortplantingspatronen van fysiologische en pathologische activiteit van verschillende celkweek- en hersenplakpreparaten. Van bijzonder belang is dat deze mogelijkheden van CMOS-HD-MEA-systemen onderzoekers in staat kunnen stellen om aanvalspatronen van verschillende hersengebieden tegelijkertijd te contrasteren en te testen hoe verschillende anti-epileptische stoffen deze patronen beïnvloeden. Door dit te doen, biedt het een innovatieve methode voor het bestuderen van ictogenese en ictale propagatie en om te begrijpen hoe farmacologie pathologische netwerkactiviteit verstoort 7,10,14. Daarom kunnen deze nieuwe capaciteiten van CMOS-HD-MEA-systemen een belangrijke bijdrage leveren aan het onderzoek naar neurologische aandoeningen, en ook helpen bij het onderzoek naar de ontdekking van geneesmiddelen 5,7,11,22. We streven ernaar om details te verstrekken over het gebruik van CMOS-HD-MEA-systemen om aanvalsachtige activiteit te bestuderen.
Bij het gebruik van CMOS-HD-MEA-systemen om LFP’s te bestuderen, zoals epileptiforme activiteit in acute hersenplakjes, kunnen gebruikers voor veel uitdagingen komen te staan, waaronder slopende elektrische ruis, het gezond houden van het plakje tijdens experimenten en het detecteren van een kwaliteitssignaal van een tweedimensionale (2D) CMOS-MEA-chip die alleen opneemt vanaf het oppervlak van het hersenplakje. Dit protocol beschrijft de basisstappen voor het correct aarden van het MEA-platform en andere apparatuur die bij experimenten wordt gebruikt, een cruciale stap die mogelijk individuele aanpassing vereist voor elke laboratoriumopstelling. Daarnaast bespreken we stappen om te helpen bij het gezond houden van de hersenplak tijdens lange opnames in de ondergedompelde kamers die worden gebruikt met CMOS-HD-MEA-systemen 23,24,25. Bovendien gebruiken de meeste CMOS-HD-MEA-systemen, in tegenstelling tot meer gebruikelijke elektrofysiologische opnamemethoden, die diep in het hersensegment opnemen, 2D-chips die niet in het plakje doordringen. Daarom hebben deze systemen een gezonde neuronale buitenlaag nodig om het merendeel van de geregistreerde LFP-signalen te produceren. Andere uitdagingen zijn onder meer het visualiseren van de enorme hoeveelheid gegevens die door duizenden elektroden worden gegenereerd. Om deze uitdagingen te overwinnen, raden we een eenvoudig maar effectief protocol aan dat de kans vergroot op het bereiken van hoogwaardige netwerkepileptiforme activiteit die zich over het hersensegment verspreidt. We voegen ook een korte beschrijving toe van een openbaar beschikbare grafische gebruikersinterface (GUI) die we hebben ontwikkeld met bijbehorende bronnen om te helpen bij gegevensvisualisatie10.
Eerdere publicaties hebben gerelateerde protocollen verstrekt voor het gebruik van MEA-registratiesystemen 26,27,28,29. Dit werk is echter bedoeld om onderzoekers te helpen die CMOS-HD-MEA-systemen met 2D-chips gebruiken, met name degenen die hoogwaardige epileptiforme activiteit van hersenplakjes willen bestuderen. Daarnaast vergelijken we twee van de meest voorkomende oplossingsmanipulaties voor inductie van aanvalsachtige activiteit, namelijk de paradigma’s van 0 Mg2+ en 4-AP, om gebruikers te helpen de meest geschikte convulsieve media voor hun specifieke toepassing te identificeren. Hoewel het protocol in de eerste plaats gericht is op het genereren van aanvalsachtige activiteit, kan het worden aangepast om andere elektrofysiologische verschijnselen te onderzoeken met behulp van hersenplakjes.
Dit protocol bevat specifieke richtlijnen met betrekking tot acuut beheer van hersenplakjes die veelvoorkomende problemen aanpakken waarmee CMOS-HD-MEA-gebruikers worden geconfronteerd, namelijk geluidsontwikkeling onder de hersenplak en het handhaven van een gezonde omgeving voor de hersenschijf. Ruisontwikkeling onder de slice treedt op wanneer de slice niet goed aan de array is gehecht; Als de hersenplak niet voldoende wordt gehecht, kunnen er luchtbellen onder de plak ontstaan, wat r…
The authors have nothing to disclose.
De auteurs bedanken voormalige en huidige Parrish-lableden voor hun bewerkingen aan dit manuscript. We willen ook Alessandro Maccione van 3Brain bedanken voor zijn feedback op dit werk. Dit werk werd gefinancierd door een AES/EF Junior Investigator Award en door de Brigham Young University Colleges of Life Sciences and of Physical and Mathematical Sciences.
2D Workbench | Cloudray | LM04CLLD26B | |
4-Aminopyridine | Sigma-Aldrich | 275875 | |
Accura Chip | 3Brain | Accura HD-MEA | CMOS-HD-MEA chip |
Agarose | Thermo Fisher Scientific | BP160-100 | |
Vibration isolation table | Kinetic Systems | 91010124 | |
Beaker for the slice holding chamber, 270 mL | VWR | 10754-772 | |
BioCam | 3Brain | BioCAM DupleX | CMOS-HD-MEA platform |
Brainwave Software | 3Brain | Version 4 | CMOS-HD-MEA software |
Calcium Chloride | Thermo Fisher Scientific | BP510-500 | |
Carbogen | Airgas | X02OX95C2003102 | |
Carbogen | Airgas | 12005 | |
Carbogen Stones | Supelco | 59277 | |
Compresstome | Precissionary | VF-300-0Z | |
Computer | Dell | Precission3650 | |
Crocodile Clip Grounding Cables | JWQIDI | B06WGZG17W | |
Detergent | Metrex | 10-4100-0000 | |
D-Glucose | Macron Fine Chemicals | 4912-12 | |
Dihydrogen Sodium Phosphate | Thermo Fisher Scientific | BP329-500 | |
DinoCam | Dino-Lite | AM73915MZTL | |
Ethanol | Thermo Fisher Scientific | A407P-4 | |
Forceps | Fine Science Tools | 11980-13 | |
Hot plate | Thermo Fisher Scientific | SP88857200 | |
Ice Machine | Hoshizaki | F801MWH | |
Inflow and outflow needles | Jensen Global | JG 18-3.0X | |
Inline Solution Heater | Warner Instruments | SH-27B | |
Isofluorine | Dechra | 08PB-STE22002-0122 | |
Kim Wipes | Thermo Fisher Scientific | 06-666 | |
Magnesium Chloride | Thermo Fisher Scientific | FLM33500 | |
Micropipets | Gilson | F144069 | |
Mili-Q Water Filter | Mili-Q | ZR0Q008WW | |
Paintbrush | Daler Rowney | AF85 Round: 0 | |
Paper Filter | Whatman | EW-06648-24 | |
Parafilm | American National Can | PM996 | |
Perfusion System | Multi Channel System | PPS2 | |
Pipetor | Thermo Fisher Scientific | FB14955202 | |
Platinum Harp | 3Brain | 3Brain | |
Potassium Chloride | Thermo Fisher Scientific | P330-3 | |
Razor blade | Personna | BP9020 | |
Scale | Metter Toledo | AB204 | |
Scissors | Solingen | 92008 | |
Slice Holding Chamber | Custom | Custom | Custom 3D Printer Design, available upon request |
Sodium Bicarbonate | Macron Fine Chemicals | 7412-06 | |
Sodium Chloride | Thermo Fisher Scientific | S271-3 | |
Temperature Control Box | Warner Instruments | TC344B | |
Transfer Pipettes | Genesee Scientific | 30-200 | |
Tubing | Tygon | B-44-3 TPE | |
Vibratome VZ-300 | Precissionary | VF-00-VM-NC | |
Weigh Boat | Electron Microscopy Sciences | 70040 |