В этой статье мы описываем протокол использования комплементарных систем микроэлектродных матриц высокой плотности (CMOS-HD-MEAs) для регистрации судорожной активности из срезов мозга ex vivo .
Комплементарные системы микроэлектродной матрицы высокой плотности металл-оксид-полупроводник (CMOS-HD-MEA) могут регистрировать нейрофизиологическую активность клеточных культур и срезов мозга ex vivo с беспрецедентной электрофизиологической детализацией. КМОП-HD-MEA сначала были оптимизированы для регистрации высококачественной активности нейронных единиц из клеточных культур, но также было показано, что они производят качественные данные из острых срезов сетчатки и мозжечка. Исследователи недавно использовали CMOS-HD-MEA для регистрации локальных полевых потенциалов (LFP) из острых корковых срезов мозга грызунов. Одним из LFP, представляющим интерес, является судорожная активность. В то время как многие пользователи производят кратковременные, спонтанные эпилептиформные разряды с помощью CMOS-HD-MEA, лишь немногие пользователи надежно демонстрируют качественную судорожную активность. Многие факторы могут способствовать этой трудности, в том числе электрический шум, непостоянный характер создания судорожной активности при использовании погружных записывающих камер и ограничение, заключающееся в том, что 2D CMOS-MEA чипы записывают только с поверхности среза мозга. Методы, описанные в этом протоколе, должны позволить пользователям последовательно индуцировать и регистрировать высококачественную судорожную активность из острых срезов мозга с помощью системы CMOS-HD-MEA. Кроме того, в этом протоколе описывается надлежащее обращение с чипами CMOS-HD-MEA, управление растворами и срезами мозга во время экспериментов, а также техническое обслуживание оборудования.
Коммерчески доступные системы микроэлектродных матриц высокой плотности (HD-MEA), которые включают в себя чип MEA с тысячами точек записи 1,2 и платформу MEA для усиления и оцифровки данных, являются новым инструментом для электрофизиологических исследований. В этих системах HD-MEA используется комплементарная технология металл-оксид-полупроводник (CMOS) для записи электрофизиологических данных с высокой чувствительностью от клеточных культур и препаратов среза мозга ex vivo. Эти системы MEA обеспечивают беспрецедентное пространственное и временное разрешение нейрофизиологических исследований благодаря высокой плотности электродов и качественному соотношению сигнал/шум3. Эта технология в основном используется для изучения потенциалов внеклеточного действия, но она также может захватывать высококачественные потенциалы локального поля (LFP) из различных препаратов нейронных срезов мозга 4,5,6,7,8,9,10,11,12,13,14,15 . Благодаря вышеупомянутой возможности записи с высоким разрешением систем CMOS-HD-MEA, пользователи могут отслеживать электрофизиологическую активность с большой пространственной точностью16,17,18. Эта возможность особенно актуальна для отслеживания шаблонов распространения сетевых LFP 5,12,15,19,20,21. Таким образом, системы CMOS-HD-MEA могут обеспечить беспрецедентное понимание закономерностей распространения физиологической и патологической активности из различных клеточных культур и препаратов срезов мозга. Следует особо отметить, что эти возможности систем CMOS-HD-MEA могут позволить исследователям сопоставлять паттерны припадков в разных областях мозга одновременно и анализировать, как различные противоэпилептические соединения влияют на эти паттерны. Таким образом, он предоставляет инновационный метод для изучения иктогенеза и распространения иктала, а также для понимания того, как фармакология нарушает патологическую сетевую активность 7,10,14. Таким образом, эти новые возможности систем CMOS-HD-MEA могут внести значительный вклад в исследование неврологических расстройств, а также помочь в исследованиях по разработке лекарств 5,7,11,22. Мы стремимся предоставить подробную информацию об использовании систем CMOS-HD-MEA для изучения судорожной активности.
При использовании систем CMOS-HD-MEA для изучения LFP, таких как эпилептиформная активность в острых срезах мозга, пользователи могут столкнуться со многими проблемами, включая изнурительный электрический шум, сохранение среза здоровым во время экспериментов и обнаружение качественного сигнала от двумерного (2D) чипа CMOS-MEA, который записывает только с поверхности среза мозга. В этом протоколе описываются основные шаги по правильному заземлению платформы MEA и другого оборудования, используемого в экспериментах, что является важным этапом, который может потребовать индивидуальной настройки для каждой лабораторной установки. Кроме того, мы обсуждаем шаги, которые помогут сохранить срез мозга здоровым во время длительных записей в погружных камерах, используемых с системами CMOS-HD-MEA 23,24,25. Кроме того, в отличие от более распространенных электрофизиологических методов записи, которые записывают из глубины среза мозга, большинство систем CMOS-HD-MEA используют 2D-чипы, которые не проникают в срез. Таким образом, эти системы нуждаются в здоровом внешнем слое нейронов для производства большинства записанных сигналов LFP. Другие проблемы включают в себя визуализацию огромного количества данных, генерируемых тысячами электродов. Чтобы преодолеть эти проблемы, мы рекомендуем простой, но эффективный протокол, который увеличивает вероятность достижения высококачественной сетевой эпилептиформной активности, распространяющейся по всему срезу мозга. Мы также включаем краткое описание общедоступного графического пользовательского интерфейса (GUI), который мы разработали вместе с соответствующими ресурсами для помощи в визуализации данных10.
В предыдущих публикациях были представлены соответствующие протоколы для использования систем регистрации MEA 26,27,28,29. Тем не менее, эта работа направлена на помощь экспериментаторам, использующим системы CMOS-HD-MEA с 2D-чипами, особенно тем, кто стремится изучить высококачественную эпилептиформную активность из срезов мозга. Кроме того, мы сравниваем две наиболее распространенные манипуляции с растворами для индукции судорожной активности, а именно парадигмы 0 мг2+ и 4-AP, чтобы помочь пользователям определить наиболее подходящие конвульсивные среды для их конкретного применения. Хотя протокол ориентирован в первую очередь на генерацию судорожной активности, он может быть модифицирован для изучения других электрофизиологических явлений с использованием срезов мозга.
Этот протокол включает в себя конкретные рекомендации, связанные с лечением острого среза мозга, которые решают общие проблемы, с которыми сталкиваются пользователи CMOS-HD-MEA, а именно развитие шума под срезом мозга и поддержание здоровой среды для среза мозга. Развитие…
The authors have nothing to disclose.
Авторы благодарят бывших и нынешних сотрудников лаборатории Пэрриша за их правки в этой рукописи. Мы также хотели бы поблагодарить Алессандро Маччоне из 3Brain за его отзыв об этой работе. Эта работа была профинансирована премией AES/EF Junior Investigator Award и колледжами естественных наук и физико-математических наук Университета имени Бригама Янга.
2D Workbench | Cloudray | LM04CLLD26B | |
4-Aminopyridine | Sigma-Aldrich | 275875 | |
Accura Chip | 3Brain | Accura HD-MEA | CMOS-HD-MEA chip |
Agarose | Thermo Fisher Scientific | BP160-100 | |
Vibration isolation table | Kinetic Systems | 91010124 | |
Beaker for the slice holding chamber, 270 mL | VWR | 10754-772 | |
BioCam | 3Brain | BioCAM DupleX | CMOS-HD-MEA platform |
Brainwave Software | 3Brain | Version 4 | CMOS-HD-MEA software |
Calcium Chloride | Thermo Fisher Scientific | BP510-500 | |
Carbogen | Airgas | X02OX95C2003102 | |
Carbogen | Airgas | 12005 | |
Carbogen Stones | Supelco | 59277 | |
Compresstome | Precissionary | VF-300-0Z | |
Computer | Dell | Precission3650 | |
Crocodile Clip Grounding Cables | JWQIDI | B06WGZG17W | |
Detergent | Metrex | 10-4100-0000 | |
D-Glucose | Macron Fine Chemicals | 4912-12 | |
Dihydrogen Sodium Phosphate | Thermo Fisher Scientific | BP329-500 | |
DinoCam | Dino-Lite | AM73915MZTL | |
Ethanol | Thermo Fisher Scientific | A407P-4 | |
Forceps | Fine Science Tools | 11980-13 | |
Hot plate | Thermo Fisher Scientific | SP88857200 | |
Ice Machine | Hoshizaki | F801MWH | |
Inflow and outflow needles | Jensen Global | JG 18-3.0X | |
Inline Solution Heater | Warner Instruments | SH-27B | |
Isofluorine | Dechra | 08PB-STE22002-0122 | |
Kim Wipes | Thermo Fisher Scientific | 06-666 | |
Magnesium Chloride | Thermo Fisher Scientific | FLM33500 | |
Micropipets | Gilson | F144069 | |
Mili-Q Water Filter | Mili-Q | ZR0Q008WW | |
Paintbrush | Daler Rowney | AF85 Round: 0 | |
Paper Filter | Whatman | EW-06648-24 | |
Parafilm | American National Can | PM996 | |
Perfusion System | Multi Channel System | PPS2 | |
Pipetor | Thermo Fisher Scientific | FB14955202 | |
Platinum Harp | 3Brain | 3Brain | |
Potassium Chloride | Thermo Fisher Scientific | P330-3 | |
Razor blade | Personna | BP9020 | |
Scale | Metter Toledo | AB204 | |
Scissors | Solingen | 92008 | |
Slice Holding Chamber | Custom | Custom | Custom 3D Printer Design, available upon request |
Sodium Bicarbonate | Macron Fine Chemicals | 7412-06 | |
Sodium Chloride | Thermo Fisher Scientific | S271-3 | |
Temperature Control Box | Warner Instruments | TC344B | |
Transfer Pipettes | Genesee Scientific | 30-200 | |
Tubing | Tygon | B-44-3 TPE | |
Vibratome VZ-300 | Precissionary | VF-00-VM-NC | |
Weigh Boat | Electron Microscopy Sciences | 70040 |