Montagem de organoides retinianos com microglia
Summary
A microglia é uma célula imune residente única na retina, desempenhando papéis cruciais em várias doenças degenerativas da retina. A geração de um modelo de co-cultura de organoides retinianos com microglia pode facilitar uma melhor compreensão da patogênese e do progresso do desenvolvimento das doenças retinianas.
Abstract
Devido à acessibilidade limitada da retina humana, os organoides retinianos (ROs) são o melhor modelo para estudar doenças retinianas humanas, o que pode revelar o mecanismo de desenvolvimento da retina e a ocorrência de doenças retinianas. A microglia (MG) são macrófagos residentes únicos na retina e no sistema nervoso central (SNC), servindo a funções imunitárias cruciais. No entanto, os organoides retinianos carecem de micróglia, pois sua origem de diferenciação é o saco vitelino. A patogênese específica da microglia nessas doenças da retina permanece obscura; Portanto, o estabelecimento de um modelo organoide retiniano incorporado à microglia revela-se necessário. Aqui, construímos com sucesso um modelo co-cultivado de organoides retinianos com microglia derivada de células-tronco humanas. Neste artigo, diferenciamos a microglia e, em seguida, co-cultivamos em organoides retinianos no estágio inicial. Como incorporação de células imunes, este modelo fornece uma plataforma otimizada para modelagem de doenças da retina e triagem de medicamentos para facilitar pesquisas aprofundadas sobre a patogênese e o tratamento de doenças relacionadas à retina e ao SNC.
Introduction
Como fonte limitada da retina humana, a diferenciação de células-tronco humanas em organoides retinianos tridimensionais (3D) representa um modelo in vitro promissor para simular a retina1. Ele contém diferentes tipos de células na retina, incluindo fotorreceptores, células ganglionares da retina, células bipolares, células de Müller, células horizontais e astrócitos2. Este modelo permite a emulação e o estudo dos mecanismos de desenvolvimento da retina e da patogênese das doenças da retina. No entanto, devido ao método de diferenciação direcional, os organoides retinianos foram derivados do neuroectoderma3, faltando muitos outros tipos de células originárias de diferentes camadas germinativas, como a microglia do saco vitelino e as células perivasculares do mesoderma 4,5,6.
Atualmente, muitas doenças da retina, como retinite pigmentosa7, glaucoma8 e retinoblastoma9, provaram estar intimamente relacionadas à microglia dentro da retina. No entanto, devido à falta de modelos de pesquisa adequados, mecanismos específicos que ilustram a relação entre a microglia e essas doenças ainda permanecem obscuros. Embora os camundongos tenham servido como um modelo favorável para o estudo de doenças da retina, estudos recentes destacaram diferenças significativas entre a microglia de camundongos e humanos em termos de expectativa de vida, taxa de proliferação e ausência de genes homólogos humanos10,11. Essas descobertas sugeriram que as conclusões tiradas de modelos de camundongos podem não ser totalmente confiáveis, enfatizando a importância da construção de organoides retinianos humanos contendo microglia.
Nas últimas décadas, vários métodos para a diferenciação 3D de organoides retinianos foram desenvolvidos12,13. Para facilitar a operação de co-cultura da microglia dentro dos organoides da retina, selecionamos um método de diferenciação envolvendo uma transição da cultura aderente para a cultura em suspensão. Essa abordagem permite que a microglia seja incorporada aos organoides da retina, mantendo-os por pelo menos 60 dias14.
Protocol
Representative Results
Discussion
Devido à disponibilidade restrita da retina humana, nossa compreensão atual das respostas inflamatórias da retina vem quase de modelos animais. Para superar essa limitação, os organoides retinianos foram diferenciados. O desenvolvimento de modelos organoides retinianos tem sido uma área ativa de pesquisa, com o objetivo de recapitular a complexidade da retina humana para modelagem de doenças e desenvolvimento terapêutico. Vários estudos relataram a geração bem-sucedida de organoides retinianos a partir de cél…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Este estudo é apoiado pela Fundação Nacional de Ciências Naturais da China (82101145) e pela Fundação de Ciências Naturais de Pequim (Z200014).
Materials
| Acctuase | Stemcell Technologies | 07920 | |
| Advanced DMEM/F12 | Thermo | 12634-010 | |
| Anti-CRX(M02) | abnova | H00001406-M02 | Antibody; dilution as per the manufacturer's instructions |
| Anti-IBA1 | Abcam | ab5076 | Antibody; dilution as per the manufacturer's instructions |
| B27 | Life Technologies | 17105-041 | |
| Dispase (1U/mL) | Stemcell Technologies | 07923 | |
| DMEM basic | Gibco | 10566-016 | |
| DMEM/F12 | Gibco | 10565-042 | |
| DPBS | Gibco | C141905005BT | |
| EDTA | Thermo | 15575020 | |
| F12 | Gibco | 11765-054 | |
| FBS | Biological Industry | 04-002-1A | |
| Gelatin | Sigma | G7041-100G | Solid |
| Glutamax | Gibco | 35050-061 | |
| H9 cell line | WiCell Research Institute | ||
| IL-3 | RD Systems | 203-IL-050 | |
| IL-34 | PeproTech | 200-34-50UG | |
| KSR | Gibco | 10828028 | |
| Matrix | Corning | 356231 | |
| M-CSF | RD Systems | 216-MC-500 | |
| MEM Non-essential Amino Acid Solution | Sigma | M7145 | |
| N2 | Life Technologies | 17502-048 | |
| Neurobasal | Gibco | 21103-049 | |
| Pen/strep | Gibco | 15140-122 | |
| Stem cell medium | Stemcell Technologies | 5990 | |
| Taurine | Sigma | T-8691-25G | |
| X-ViVO | LONZA | 04-418Q | |
| Y27632 | Selleck | S1049 | |
| β-mercaptoethanol | Life Technologies | 21985-023 |
References
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