Summary

Ensamblaje de organoides de la retina con microglía

Published: July 26, 2024
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Summary

La microglía es una célula inmunitaria residente única en la retina que desempeña un papel crucial en diversas enfermedades degenerativas de la retina. La generación de un modelo de cocultivo de organoides retinianos con microglía puede facilitar una mejor comprensión de la patogénesis y el progreso del desarrollo de las enfermedades de la retina.

Abstract

Debido a la accesibilidad limitada de la retina humana, los organoides retinianos (RO) son el mejor modelo para estudiar la enfermedad de la retina humana, que podría revelar el mecanismo del desarrollo de la retina y la aparición de la enfermedad de la retina. La microglía (MG) son macrófagos residentes únicos en la retina y el sistema nervioso central (SNC), que cumplen funciones inmunitarias cruciales. Sin embargo, los organoides de la retina carecen de microglía ya que su origen de diferenciación es el saco vitelino. La patogenia específica de la microglía en estas enfermedades de la retina sigue sin estar clara; Por lo tanto, resulta necesario el establecimiento de un modelo de organoide retiniano incorporado a la microglía. Aquí, construimos con éxito un modelo de cocultivo de organoides de retina con microglía derivada de células madre humanas. En este artículo, diferenciamos la microglía y luego la cocultivamos en organoides retinianos en la etapa inicial. Como incorporación de células inmunitarias, este modelo proporciona una plataforma optimizada para el modelado de enfermedades de la retina y el cribado de fármacos para facilitar la investigación en profundidad sobre la patogénesis y el tratamiento de las enfermedades relacionadas con la retina y el SNC.

Introduction

Como fuente limitada de la retina humana, la diferenciación de las células madre humanas en organoides retinianos tridimensionales (3D) representa un modelo in vitro prometedor para simular la retina1. Contiene diferentes tipos de células en la retina, incluidos fotorreceptores, células ganglionares de la retina, células bipolares, células de Müller, células horizontales y astrocitos2. Este modelo permite emular y estudiar tanto los mecanismos de desarrollo de la retina como la patogénesis de las enfermedades de la retina. Sin embargo, debido al método de diferenciación direccional, los organoides de la retina se derivaron del neuroectodermo3, careciendo de muchos otros tipos de células que se originan en diferentes capas germinales, como la microglía del saco vitelino y las células perivasculares del mesodermo 4,5,6.

En la actualidad, se ha demostrado que muchas enfermedades de la retina, como la retinosis pigmentaria7, el glaucoma8 y el retinoblastoma9, están estrechamente relacionadas con la microglía dentro de la retina. Sin embargo, debido a la falta de modelos de investigación adecuados, los mecanismos específicos que ilustran la relación entre la microglía y estas enfermedades aún no están claros. Si bien los ratones han servido como un modelo favorable para el estudio de las enfermedades de la retina, estudios recientes han destacado diferencias significativas entre la microglía de ratón y la humana en términos de esperanza de vida, tasa de proliferación y ausencia de genes homólogos humanos10,11. Estos hallazgos sugirieron que las conclusiones extraídas de modelos de ratón pueden no ser del todo fiables, lo que pone de relieve la importancia de construir organoides de retina humana que contengan microglía.

En las últimas décadas, se han desarrollado diversos métodos para la diferenciación 3D de organoides retinianos12,13. Para facilitar la operación de cocultivo de microglía dentro de organoides de retina, hemos seleccionado un método de diferenciación que implica una transición de cultivo adherente a cultivo en suspensión. Este enfoque permite con éxito la incorporación de la microglía a los organoides de la retina, manteniéndolos durante al menos 60 días14.

Protocol

Este estudio fue aprobado por el Comité de Ética Institucional del Hospital Tongren de Pekín, Universidad Médica de la Capital. La línea celular H9 de HESC pertenecía al Instituto de Investigación WiCell. Precalentar el medio de cultivo celular a temperatura ambiente (RT) durante 30 minutos antes del experimento. 1. Generación de microglía humana Cultive las hESC en medio de células madre hasta que la densidad celular alcance el 80%-90%. Siembre al menos 1 x 106 celdas en cada pocillo. Aspire el medio de células madre y enjuague las células con 1x DPBS (1 mL/pocillo de la placa de 6 pocillos). El siguiente paso requiere 2 x 107-1 x 108 celdas. Si no es suficiente, combine celdas de 2 a 5 pocillos para realizar los siguientes pasos. Disocie las colonias de células madre utilizando la solución de EDTA de 0,5 mM durante unos 5 min en una incubadora a 37 °C (1 mL/pocillo de la placa de 6 pocillos). Verifique la morfología de la colonia después de 5 min. Cuando los bordes de las colonias están ligeramente enroscados con espacios sueltos, las células están listas para diferenciarse y aspirar el EDTA. De lo contrario, incube las células a 37 °C durante otros 1-2 minutos. No incubar durante más de 8 min. Enjuague suavemente las células de cada pocillo con 6 mL de medio A (Tabla 1) con 6 μL de solución 10 mM de inhibidor de ROCK Y-27632. Golpea suavemente el fondo del plato para ayudar a enjuagar las células. Establezca el día como día 0.NOTA: No pipetee las células. Las células formarán cuerpos embrioides (EB) al día siguiente. Después de 24 h, observe las células bajo el microscopio para confirmar la formación de EB. Recoja los EB en un tubo centrífugo de 15 mL con una pipeta de 10 mL y espere a que los EB se asienten en el fondo en 5 minutos. Aspire cuidadosamente el sobrenadante y vuelva a suspender los EB con 6 mL de medio A fresco y transfiéralos a un nuevo pocillo de baja adherencia de placa de 6 pocillos. Cultivo en incubadora a 37 °C.NOTA: El propósito de la transferencia del pozo en el día 1 es reducir la influencia de una gran cantidad de células muertas durante el proceso de formación de EB, lo que puede afectar el estado de crecimiento celular. Refresque el Medio A fresco diariamente hasta el día 4 (6 mL/pocillo de placa de 6 pocillos). El día 4, cubra un plato de 10 cm con 3 ml de solución de gelatina de pescado al 0,1% durante al menos 1 h en una incubadora con 5% de CO2 a 37 °C.NOTA: Si el tiempo de recubrimiento es inferior a 1 h, es difícil realizar los siguientes pasos. Recoja cuidadosamente los EB en un tubo centrífugo de 15 ml con una pipeta de 10 ml y espere a que los EB se asienten en el fondo en 5 minutos. Retire la solución de gelatina al 0,1% y enjuague el plato de 10 cm una vez con 5-6 ml de 1x DPBS. Retire el DPBS. Vuelva a suspender suavemente los EB con 15 mL de medio B (Tabla 1) en el tubo centrífugo de 15 mL y transfiéralos a la placa de 10 cm recubierta. Cultivo en incubadora a 37 °C, 5% CO2 durante 1 semana.NOTA: En los primeros 7 días, no mueva el plato. Refresque con medio B fresco una vez a la semana hasta el día 49 (plato de 15 mL/10 cm) y examine las células bajo el microscopio una vez a la semana.NOTA: Después del día 49, se pueden encontrar varias células secretoras en el sobrenadante en la placa de cultivo. Centrifugar las células sobrenadantes a 200 x g durante 5 min a RT. Aspire cuidadosamente el sobrenadante y vuelva a suspender las células con 2 mL de medio B fresco y transfiéralo a un nuevo pocillo de baja adherencia de placa de 6 pocillos. Incubar en una incubadora con 5% de CO2, a 37 °C.NOTA: En los próximos 7 días, no mueva la placa. La microglía podría adherirse al fondo del pozo de baja adherencia. En el día 56, reemplácelo con el medio C (Tabla 1) (2 mL/pocillo de placa de 6 pocillos). La microglía se adhiere a la parte inferior del pocillo de baja adherencia y se verá ramificada bajo el microscopio.NOTA: Al cambiar el medio C cada 3 días (2 mL/pocillo de placa de 6 pocillos), la microglía podría cultivarse en el medio C durante unos 15 días. 2. Generación de ROs humanas y cocultivo de las ROs con microglía Cultivo de las hESCs en medio de células madre hasta que la densidad celular alcanza el 80%-90%. Siembre al menos 1 x 106 celdas en cada pocillo. Agregue Dispasa (1 mL/pocillo de la placa de 6 pocillos) a la celda de cultivo. Incubar a 37 °C durante 5 min. Aspire la solución de Dispasa del pocillo. Agregue el medio D (Tabla 1) (1 mL/pocillo de la placa de 6 pocillos) al pocillo. Cortar la célula en trozos pequeños con una pipeta de 10 μL. Recoja suavemente todas las piezas de células y el medio en un tubo de microcentrífuga de 1,5 ml. Centrifugar a 200 x g durante 5 min y retirar el sobrenadante. Resuspender suavemente las células en 200 μL de una matriz fría. Mueva el tubo de microcentrífuga 1,5 a una incubadora durante 20 minutos. Opere rápido porque la matriz se solidificará a temperatura ambiente (RT). Después de 20 minutos en la incubadora, la matriz se solidificará. Prepare un plato de 10 cm con 15 mL de Medio D. Resuspenda la Matrix con Medio D y agite suavemente la placa de Petri. Luego, coloque el plato en una incubadora durante 5 días. No mueva el plato. Establezca el día como día 0 (RO). Las células se adherirán en 3 días. El día 5 (ROs) y el día 10 (ROs), refresca el medio con el medio D. En el día 12 (ROs), retire el medio y agregue 3 mL de Dispasa a cada plato durante 5 min. Aspirar la Dispasa y añadir 15 mL de Medio E (Tabla 1). Microglía de cosecha: En el día 56 (MGs), aspirar suavemente el medio C, añadir Accutase (1 mL/pocillo de una placa de 6 pocillos) e incubar a 37 °C durante 3 min. Recoja las células de la microglía en un tubo centrífugo de 15 mL con una pipeta de 5 mL. Centrifugar las celdas a 200 x g en RT durante 5 min. Aspire suavemente el sobrenadante y suspenda la microglía con 1 mL de Medio E. Agregue la microglía a las ósmosis inversas digeridas el día 12.NOTA: En el día 12 (ROs), las celdas son adhesivas. En el día 13 (ROs), las células se encuentran suspendidas en el Medio E. Si el medio cambia de amarillo desde el día 12 (ROs) hasta el día 19 (ROs), refresque el medio con Medium E. En el día 19 (ROs), agregue los organoides al centro del plato girando suavemente el plato. Aspire suavemente el medio E y refresque el medio con el medio F. Transfiera los organoides con Medium F a un nuevo plato de suspensión. Cambie el medio una vez a la semana y seleccione organoides para los experimentos.

Representative Results

El procedimiento para la generación de organoides retinianos se describe en nuestro estudio previo15. Aquí, mostramos los resultados representativos de la microglía y el cocultivo de microglía y organoides de retina. Aquí, demostramos cada etapa de la diferenciación de la microglía (Figura 1A). El día 0 representa la etapa de cultivo de células madre. Luego, las células madre fueron digeridas y cultivadas para la formación de EB….

Discussion

Debido a la disponibilidad restringida de la retina humana, nuestra comprensión actual de las respuestas inflamatorias de la retina casi proviene de modelos animales. Para superar esta limitación, se diferenciaron los organoides de la retina. El desarrollo de modelos de organoides retinianos ha sido un área activa de investigación, con el objetivo de recapitular la complejidad de la retina humana para el modelado de enfermedades y el desarrollo terapéutico. Varios estudios han reportado la generación exitosa de org…

Divulgaciones

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Este estudio cuenta con el apoyo de la Fundación Nacional de Ciencias Naturales de China (82101145) y la Fundación de Ciencias Naturales de Pekín (Z200014).

Materials

Acctuase Stemcell Technologies 07920
Advanced DMEM/F12 Thermo 12634-010
Anti-CRX(M02) abnova H00001406-M02 Antibody; dilution as per the manufacturer's instructions
Anti-IBA1 Abcam ab5076 Antibody; dilution as per the manufacturer's instructions
B27 Life Technologies 17105-041
Dispase (1U/mL) Stemcell Technologies 07923
DMEM basic Gibco 10566-016
DMEM/F12 Gibco 10565-042
DPBS Gibco C141905005BT
EDTA Thermo 15575020
F12 Gibco 11765-054
FBS Biological Industry 04-002-1A
Gelatin Sigma G7041-100G Solid
Glutamax Gibco 35050-061
H9 cell line WiCell Research Institute
IL-3 RD Systems  203-IL-050
IL-34 PeproTech 200-34-50UG
KSR Gibco 10828028
Matrix Corning 356231
M-CSF RD Systems  216-MC-500 
MEM Non-essential Amino Acid Solution Sigma M7145
N2 Life Technologies 17502-048
Neurobasal Gibco 21103-049
Pen/strep Gibco 15140-122
Stem cell medium  Stemcell Technologies 5990
Taurine Sigma T-8691-25G
X-ViVO LONZA 04-418Q
Y27632 Selleck S1049
β-mercaptoethanol Life Technologies 21985-023

Referencias

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Citar este artículo
Xu, J., Yu, S., Jin, Z. Assembling Retinal Organoids with Microglia. J. Vis. Exp. (209), e67016, doi:10.3791/67016 (2024).

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