Assemblage d’organoïdes rétiniens avec la microglie

Cette étude a été approuvée par le Comité d’éthique institutionnelle de l’hôpital Tongren de Pékin, Université de médecine de la capitale. La lignée cellulaire H9 des HESC provient de l’Institut de recherche WiCell. Préchauffez le milieu de culture cellulaire à température ambiante (RT) pendant 30 minutes avant l’expérience. 1. Génération de la microglie humaine Cultivez les CSEh dans un milieu de cellules souches jusqu’à ce que la densité cellulaire atteigne 80 % à 90 %. Ensemencez au moins 1 x 106 cellules dans chaque puits. Aspirer le milieu de cellules souches et rincer les cellules avec 1 DPBS (1 ml/puits de plaque à 6 puits). L’étape suivante nécessite 2 x 107-1 x 108 cellules. Si ce n’est pas assez, combinez des cellules de 2 à 5 puits pour effectuer les étapes suivantes. Dissocier les colonies de cellules souches à l’aide de la solution d’EDTA à 0,5 mM pendant environ 5 min dans un incubateur à 37 °C (1 mL/puits de plaque à 6 puits). Vérifiez la morphologie de la colonie après 5 min. Lorsque les bords de la colonie sont légèrement recroquevillés avec des espaces lâches, les cellules sont prêtes à être différenciées et à aspirer l’EDTA. Sinon, incubez les cellules à 37 °C pendant 1 à 2 minutes supplémentaires. Ne pas incuber plus de 8 min. Rincer doucement les cellules de chaque puits à l’aide de 6 mL de milieu A (tableau 1) avec 6 μL de solution Y-27632 d’inhibiteur de ROCK à 10 mM. Tapotez doucement le fond du plat pour aider à rincer les cellules. Définissez le jour comme jour 0.REMARQUE : Ne pipetez pas les cellules. Les cellules formeront des corps embryoïdes (EB) le lendemain. Après 24 h, observez les cellules au microscope pour confirmer la formation d’EB. Recueillir les EB dans un tube centrifuge de 15 mL avec une pipette de 10 mL et attendre qu’ils se déposent au fond en 5 min. Aspirez soigneusement le surnageant et remettez en suspension les EB avec 6 mL de milieu A frais et transférez-les dans un nouveau puits à faible adhérence ou une plaque à 6 puits. Culture dans un incubateur à 37 °C.REMARQUE : Le but du transfert de puits le jour 1 est de réduire l’influence d’un grand nombre de cellules mortes pendant le processus de formation de l’EB, ce qui peut affecter l’état de croissance cellulaire. Rafraîchir le Medium A frais tous les jours jusqu’au jour 4 (6 ml/puits d’une assiette à 6 puits). Le jour 4, enduire un plat de 10 cm de 3 ml de solution de gélatine de poisson à 0,1 % pendant au moins 1 h dans un incubateur à 5 % de CO2 à 37 °C.REMARQUE : Si le temps de revêtement est inférieur à 1 h, il est difficile d’effectuer les étapes suivantes. Recueillir soigneusement les EB dans un tube centrifuge de 15 mL avec une pipette de 10 mL et attendre que les EB se déposent au fond en 5 min. Retirer la solution de gélatine à 0,1 % et rincer une fois le plat de 10 cm avec 5 à 6 ml de 1 DPBS. Retirez le DPBS. Remettez doucement les EB en suspension avec 15 mL de Medium B (Tableau 1) dans le tube centrifuge de 15 mL et transférez-les dans le plat enduit de 10 cm. Culture dans un incubateur à 37 °C, 5% de CO2 pendant 1 semaine.REMARQUE : Au cours des 7 premiers jours, ne déplacez pas le plat. Rafraîchissez avec du Medium B frais une fois par semaine jusqu’au jour 49 (boîte de 15 ml/10 cm) et examinez les cellules au microscope une fois par semaine.REMARQUE : Après le 49e jour, plusieurs cellules sécrétoires peuvent être trouvées dans le surnageant de la boîte de culture. Centrifuger les cellules surnageantes à 200 x g pendant 5 min à RT. Aspirez soigneusement le surnageant et remettez les cellules en suspension avec 2 mL de milieu B frais et transférez-les dans un nouveau puits à faible adhérence de plaque à 6 puits. Incuber dans un incubateur à 5 % de CO2, 37 °C.REMARQUE : Dans les 7 prochains jours, ne déplacez pas la plaque. La microglie pourrait adhérer au fond du puits à faible adhérence. Le 56e jour, remplacer par du C moyen (tableau 1) (2 ml/puits de plaque à 6 puits). Les microglies adhèrent au fond du puits à faible adhérence et auront l’air ramifiées au microscope.REMARQUE : En changeant le milieu C tous les 3 jours (2 ml/puits de plaque à 6 puits), la microglie peut être cultivée dans le milieu C pendant environ 15 jours. 2. Génération d’OI humaines et co-culture des OI avec la microglie Cultivez les CSEh dans un milieu de cellules souches jusqu’à ce que la densité cellulaire atteigne 80 % à 90 %. Ensemencez au moins 1 x 106 cellules dans chaque puits. Ajouter Dispase (1 ml/puits de la plaque à 6 puits) dans la cellule de culture. Incuber à 37 °C pendant 5 min. Aspirez la solution de Dispase du puits. Ajouter le milieu D (tableau 1) (1 ml/puits d’une plaque à 6 puits) dans le puits. Coupez la cellule en petits morceaux à l’aide d’une pipette de 10 μL. Prélevez délicatement tous les morceaux de cellules et le milieu dans un tube de microcentrifugation de 1,5 ml. Centrifuger à 200 x g pendant 5 min et retirer le surnageant. Remettre doucement les cellules en suspension dans 200 μL d’une matrice froide. Placez le tube de microcentrifugation de 1,5 cylindre dans un incubateur pendant 20 min. Fonctionne rapidement car la matrice se solidifiera à température ambiante (RT). Après 20 minutes dans l’incubateur, la matrice se solidifiera. Préparez un plat de 10 cm avec 15 ml de Medium D. Remettez la Matrix en suspension avec du Medium D et secouez doucement la boîte de Pétri. Ensuite, mettez le plat dans un incubateur pendant 5 jours. Ne déplacez pas la plaque. Définissez le jour comme jour 0 (RO). Les cellules adhéreront en 3 jours. Le jour 5 (RO) et le jour 10 (RO), rafraîchissez le support avec le support D. Le jour 12 (RO), retirer le milieu et ajouter 3 mL de Dispase dans chaque plat pendant 5 min. Aspirez le dispase et ajoutez 15 mL de Medium E (tableau 1). Récolte de la microglie : Le jour 56 (MG), aspirer doucement le Medium C, ajouter l’Accutase (1 mL/puits d’une plaque à 6 puits) et incuber à 37 °C pendant 3 min. Prélever les cellules microgliales dans un tube centrifuge de 15 mL à l’aide d’une pipette de 5 mL. Cellules de centrifugation à 200 x g à RT pendant 5 min. Aspirez doucement le surnageant et suspendez la microglie avec 1 mL de Medium E. Ajoutez la microglie aux OI digérées le 12e jour.REMARQUE : Le jour 12 (RO), les cellules sont adhésives. Le jour 13 (RO), les cellules se retrouvent en suspension dans le milieu E. Si le milieu passe au jaune entre le jour 12 (RO) et le jour 19 (RO), rafraîchissez le milieu avec le milieu E. Le jour 19 (RO), agrégez les organoïdes au centre du plat en remuant doucement l’assiette. Aspirez doucement le médium E et rafraîchissez le médium avec le médium F. Transférez les organoïdes avec le Medium F dans un nouveau plat de suspension. Changez de milieu une fois par semaine et choisissez des organoïdes pour les expériences.