Assemblage d’organoïdes rétiniens avec la microglie
Summary
Les microglies sont des cellules immunitaires résidentes uniques dans la rétine, jouant un rôle crucial dans diverses maladies dégénératives de la rétine. La génération d’un modèle de co-culture d’organoïdes rétiniens avec des microglies peut faciliter une meilleure compréhension de la pathogenèse et de la progression du développement des maladies rétiniennes.
Abstract
En raison de l’accessibilité limitée de la rétine humaine, les organoïdes rétiniens (OI) sont le meilleur modèle pour étudier les maladies rétiniennes humaines, ce qui pourrait révéler le mécanisme du développement rétinien et l’apparition de maladies rétiniennes. Les microglies (MG) sont des macrophages résidents uniques dans la rétine et le système nerveux central (SNC), remplissant des fonctions immunitaires cruciales. Cependant, les organoïdes rétiniens sont dépourvus de microglie puisque leur origine de différenciation est le sac vitellin. La pathogenèse spécifique de la microglie dans ces maladies rétiniennes reste incertaine ; Par conséquent, l’établissement d’un modèle d’organoïde rétinien incorporé à la microglie s’avère nécessaire. Ici, nous avons réussi à construire un modèle co-cultivé d’organoïdes rétiniens avec des microglies dérivées de cellules souches humaines. Dans cet article, nous avons différencié la microglie, puis co-cultivé à des organoïdes rétiniens à un stade précoce. En tant qu’incorporation de cellules immunitaires, ce modèle fournit une plate-forme optimisée pour la modélisation des maladies rétiniennes et le criblage de médicaments afin de faciliter la recherche approfondie sur la pathogenèse et le traitement des maladies liées à la rétine et au SNC.
Introduction
En tant que source limitée de la rétine humaine, la différenciation des cellules souches humaines en organoïdes rétiniens tridimensionnels (3D) représente un modèle in vitro prometteur pour simuler la rétine1. Il contient différents types de cellules dans la rétine, notamment des photorécepteurs, des cellules ganglionnaires rétiniennes, des cellules bipolaires, des cellules de Müller, des cellules horizontales et des astrocytes2. Ce modèle permet d’émuler et d’étudier à la fois les mécanismes de développement rétinien et la pathogenèse des maladies rétiniennes. Cependant, en raison de la méthode de différenciation directionnelle, les organoïdes rétiniens ont été dérivés du neuroectoderme3, manquant de nombreux autres types de cellules provenant de différentes couches germinales, telles que la microglie du sac vitellin et les cellules périvasculaires du mésoderme 4,5,6.
À l’heure actuelle, il a été prouvé que de nombreuses maladies de la rétine, telles que la rétinite pigmentaire7, le glaucome8 et le rétinoblastome9, sont étroitement liées à la microglie de la rétine. Cependant, en raison du manque de modèles de recherche appropriés, les mécanismes spécifiques illustrant la relation entre la microglie et ces maladies restent encore flous. Alors que les souris ont servi de modèle favorable pour l’étude des maladies rétiniennes, des études récentes ont mis en évidence des différences significatives entre la microglie de la souris et de l’homme en termes de durée de vie, de taux de prolifération et d’absence de gènes homologues humains10,11. Ces résultats suggèrent que les conclusions tirées de modèles murins peuvent ne pas être entièrement fiables, soulignant l’importance de construire des organoïdes rétiniens humains contenant des microglies.
Au cours des dernières décennies, diverses méthodes de différenciation 3D des organoïdes rétiniens ont été développées12,13. Pour faciliter l’opération de co-culture de la microglie au sein d’organoïdes rétiniens, nous avons sélectionné une méthode de différenciation impliquant une transition de la culture adhérente à la culture en suspension. Cette approche permet d’incorporer la microglie dans les organoïdes rétiniens, en les maintenant pendant au moins 60 jours14.
Protocol
Representative Results
Discussion
En raison de la disponibilité limitée de la rétine humaine, notre compréhension actuelle des réponses inflammatoires rétiniennes provient presque de modèles animaux. Pour surmonter cette limitation, les organoïdes rétiniens ont été différenciés. Le développement de modèles d’organoïdes rétiniens a été un domaine de recherche actif, visant à récapituler la complexité de la rétine humaine pour la modélisation des maladies et le développement thérapeutique. Plusieurs études ont rapporté avoir r…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Cette étude est soutenue par la Fondation nationale des sciences naturelles de Chine (82101145) et la Fondation des sciences naturelles de Pékin (Z200014).
Materials
| Acctuase | Stemcell Technologies | 07920 | |
| Advanced DMEM/F12 | Thermo | 12634-010 | |
| Anti-CRX(M02) | abnova | H00001406-M02 | Antibody; dilution as per the manufacturer's instructions |
| Anti-IBA1 | Abcam | ab5076 | Antibody; dilution as per the manufacturer's instructions |
| B27 | Life Technologies | 17105-041 | |
| Dispase (1U/mL) | Stemcell Technologies | 07923 | |
| DMEM basic | Gibco | 10566-016 | |
| DMEM/F12 | Gibco | 10565-042 | |
| DPBS | Gibco | C141905005BT | |
| EDTA | Thermo | 15575020 | |
| F12 | Gibco | 11765-054 | |
| FBS | Biological Industry | 04-002-1A | |
| Gelatin | Sigma | G7041-100G | Solid |
| Glutamax | Gibco | 35050-061 | |
| H9 cell line | WiCell Research Institute | ||
| IL-3 | RD Systems | 203-IL-050 | |
| IL-34 | PeproTech | 200-34-50UG | |
| KSR | Gibco | 10828028 | |
| Matrix | Corning | 356231 | |
| M-CSF | RD Systems | 216-MC-500 | |
| MEM Non-essential Amino Acid Solution | Sigma | M7145 | |
| N2 | Life Technologies | 17502-048 | |
| Neurobasal | Gibco | 21103-049 | |
| Pen/strep | Gibco | 15140-122 | |
| Stem cell medium | Stemcell Technologies | 5990 | |
| Taurine | Sigma | T-8691-25G | |
| X-ViVO | LONZA | 04-418Q | |
| Y27632 | Selleck | S1049 | |
| β-mercaptoethanol | Life Technologies | 21985-023 |
References
- Cowan, C. S., et al. Cell types of the human retina and its organoids at single-cell resolution. Cell. 182 (6), 1623-1640.e34 (2020).
- Zhang, X., Jin, Z. B. Directed induction of retinal organoids from human pluripotent stem cells. J Vis Exp. (170), e62298 (2021).
- Eiraku, M., et al. Self-organizing optic-cup morphogenesis in three-dimensional culture. Nature. 472 (7341), 51-56 (2011).
- Ginhoux, F., et al. Fate mapping analysis reveals that adult microglia derive from primitive macrophages. Science. 330 (6005), 841-845 (2010).
- Kierdorf, K., et al. Microglia emerge from erythromyeloid precursors via pu.1- and irf8-dependent pathways. Nat Neurosci. 16 (3), 273-280 (2013).
- Schulz, C., et al. A lineage of myeloid cells independent of myb and hematopoietic stem cells. Science. 336 (6077), 86-90 (2012).
- O’koren, E. G., et al. Microglial function is distinct in different anatomical locations during retinal homeostasis and degeneration. Immunity. 50 (3), 723-737.e7 (2019).
- Margeta, M. A., et al. Apolipoprotein E4 impairs the response of neurodegenerative retinal microglia and prevents neuronal loss in glaucoma. Immunity. 55 (9), 1627-1644.e7 (2022).
- Xu, J., et al. Enhanced innate responses in microglia derived from retinoblastoma patient-specific IPSCs. Glia. 72 (5), 872-884 (2024).
- Gosselin, D., et al. An environment-dependent transcriptional network specifies human microglia identity. Science. 356 (6344), eaal3222 (2017).
- Galatro, T. F., et al. Transcriptomic analysis of purified human cortical microglia reveals age-associated changes. Nat Neurosci. 20 (8), 1162-1171 (2017).
- Nakano, T., et al. Self-formation of optic cups and storable stratified neural retina from human ESCs. Cell Stem Cell. 10 (6), 771-785 (2012).
- Kim, S., et al. transcriptome profiling, and functional validation of cone-rich human retinal organoids. Proc Natl Acad Sci U S A. 116 (22), 10824-10833 (2019).
- Gao, M. L., et al. Functional microglia derived from human pluripotent stem cells empower retinal organ. Sci China Life Sci. 65 (6), 1057-1071 (2022).
- Zhang, X., Jin, Z. B. Reconstruct human retinoblastoma in vitro. J Vis Exp. (188), e62629 (2022).
- Park, D. S., et al. IPS-cell-derived microglia promote brain organoid maturation via cholesterol transfer. Nature. 623 (7986), 397-405 (2023).
- Usui-Ouchi, A., et al. Integrating human ipsc-derived macrophage progenitors into retinal organoids to generate a mature retinal microglial niche. Glia. 71 (10), 2372-2382 (2023).
- Chichagova, V., et al. Incorporating microglia-like cells in human induced pluripotent stem cell-derived retinal organoids. J Cell Mol Med. 27 (3), 435-445 (2023).
