Assemblaggio di organoidi retinici con microglia
Summary
Le microglia sono cellule immunitarie uniche residenti nella retina, che svolgono un ruolo cruciale in varie malattie degenerative della retina. La generazione di un modello di co-coltura di organoidi retinici con microglia può facilitare una migliore comprensione della patogenesi e del progresso dello sviluppo delle malattie retiniche.
Abstract
A causa della limitata accessibilità della retina umana, gli organoidi retinici (RO) sono il miglior modello per lo studio della malattia retinica umana, che potrebbe rivelare il meccanismo dello sviluppo retinico e l’insorgenza della malattia retinica. Le microglia (MG) sono macrofagi residenti unici nella retina e nel sistema nervoso centrale (SNC) e svolgono funzioni immunitarie cruciali. Tuttavia, gli organoidi retinici mancano di microglia poiché la loro origine di differenziazione è il sacco vitellino. La patogenesi specifica della microglia in queste malattie della retina rimane poco chiara; Pertanto, la creazione di un modello di organoide retinico incorporato nella microglia risulta essere necessaria. Qui, abbiamo costruito con successo un modello co-coltivato di organoidi retinici con microglia derivate da cellule staminali umane. In questo articolo, abbiamo differenziato le microglia e poi le abbiamo co-coltivate con organoidi retinici nella fase iniziale. Come incorporazione di cellule immunitarie, questo modello fornisce una piattaforma ottimizzata per la modellazione delle malattie retiniche e lo screening dei farmaci per facilitare la ricerca approfondita sulla patogenesi e il trattamento delle malattie retiniche e correlate al SNC.
Introduction
Essendo la fonte limitata della retina umana, la differenziazione delle cellule staminali umane in organoidi retinici tridimensionali (3D) rappresenta un promettente modello in vitro per la simulazione della retina1. Contiene diversi tipi di cellule nella retina, tra cui fotorecettori, cellule gangliari retiniche, cellule bipolari, cellule di Müller, cellule orizzontali e astrociti2. Questo modello consente l’emulazione e lo studio sia dei meccanismi di sviluppo retinico che della patogenesi delle malattie retiniche. Tuttavia, a causa del metodo di differenziazione direzionale, gli organoidi retinici sono stati derivati dal neuroectoderma3, mancando di molti altri tipi di cellule originate da diversi strati germinali, come le microglia dal sacco vitellino e le cellule perivascolari dal mesoderma 4,5,6.
Attualmente, molte malattie della retina, come la retinite pigmentosa7, il glaucoma8 e il retinoblastoma9, hanno dimostrato di essere strettamente correlate alla microglia all’interno della retina. Tuttavia, a causa della mancanza di adeguati modelli di ricerca, i meccanismi specifici che illustrano la relazione tra la microglia e queste malattie rimangono ancora poco chiari. Mentre i topi sono serviti come modello favorevole per lo studio delle malattie retiniche, studi recenti hanno evidenziato differenze significative tra microglia di topo e umane in termini di durata della vita, tasso di proliferazione e assenza di geni omologhi umani10,11. Questi risultati hanno suggerito che le conclusioni tratte dai modelli murini potrebbero non essere del tutto affidabili, sottolineando l’importanza di costruire organoidi retinici umani contenenti microglia.
Negli ultimi decenni, sono stati sviluppati vari metodi per la differenziazione 3D di organoidi retinici12,13. Per facilitare l’operazione di co-coltura delle microglia all’interno degli organoidi retinici, abbiamo selezionato un metodo di differenziazione che prevede una transizione dalla coltura aderente a quella in sospensione. Questo approccio consente con successo di incorporare le microglia negli organoidi retinici, mantenendoli per almeno 60 giorni14.
Protocol
Representative Results
Discussion
A causa della limitata disponibilità della retina umana, la nostra attuale comprensione delle risposte infiammatorie retiniche proviene quasi da modelli animali. Per superare questa limitazione, gli organoidi retinici sono stati differenziati. Lo sviluppo di modelli di organoidi retinici è stata un’area di ricerca attiva, con l’obiettivo di ricapitolare la complessità della retina umana per la modellazione delle malattie e lo sviluppo terapeutico. Diversi studi hanno riportato la generazione di organoidi retinici da c…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Questo studio è supportato dalla National Natural Science Foundation of China (82101145) e dalla Beijing Natural Science Foundation (Z200014).
Materials
| Acctuase | Stemcell Technologies | 07920 | |
| Advanced DMEM/F12 | Thermo | 12634-010 | |
| Anti-CRX(M02) | abnova | H00001406-M02 | Antibody; dilution as per the manufacturer's instructions |
| Anti-IBA1 | Abcam | ab5076 | Antibody; dilution as per the manufacturer's instructions |
| B27 | Life Technologies | 17105-041 | |
| Dispase (1U/mL) | Stemcell Technologies | 07923 | |
| DMEM basic | Gibco | 10566-016 | |
| DMEM/F12 | Gibco | 10565-042 | |
| DPBS | Gibco | C141905005BT | |
| EDTA | Thermo | 15575020 | |
| F12 | Gibco | 11765-054 | |
| FBS | Biological Industry | 04-002-1A | |
| Gelatin | Sigma | G7041-100G | Solid |
| Glutamax | Gibco | 35050-061 | |
| H9 cell line | WiCell Research Institute | ||
| IL-3 | RD Systems | 203-IL-050 | |
| IL-34 | PeproTech | 200-34-50UG | |
| KSR | Gibco | 10828028 | |
| Matrix | Corning | 356231 | |
| M-CSF | RD Systems | 216-MC-500 | |
| MEM Non-essential Amino Acid Solution | Sigma | M7145 | |
| N2 | Life Technologies | 17502-048 | |
| Neurobasal | Gibco | 21103-049 | |
| Pen/strep | Gibco | 15140-122 | |
| Stem cell medium | Stemcell Technologies | 5990 | |
| Taurine | Sigma | T-8691-25G | |
| X-ViVO | LONZA | 04-418Q | |
| Y27632 | Selleck | S1049 | |
| β-mercaptoethanol | Life Technologies | 21985-023 |
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