تجميع عضويات الشبكية مع الخلايا الدبقية الصغيرة
Summary
الخلايا الدبقية الصغيرة هي خلايا مناعية مقيمة فريدة في شبكية العين ، وتلعب أدوارا حاسمة في العديد من الأمراض التنكسية في شبكية العين. يمكن أن يؤدي إنشاء نموذج زراعة مشتركة لعضويات الشبكية مع الخلايا الدبقية الصغيرة إلى تسهيل فهم أفضل للتسبب في أمراض الشبكية والتقدم التنموي.
Abstract
نظرا لمحدودية الوصول إلى شبكية العين البشرية ، فإن عضويات الشبكية (ROs) هي أفضل نموذج لدراسة أمراض الشبكية البشرية ، والتي يمكن أن تكشف عن آلية تطور الشبكية وحدوث أمراض الشبكية. الخلايا الدبقية الصغيرة (MG) هي بلاعم مقيمة فريدة من نوعها في شبكية العين والجهاز العصبي المركزي (CNS) ، وتخدم وظائف المناعة الحاسمة. ومع ذلك ، تفتقر الكائنات العضوية في شبكية العين إلى الخلايا الدبقية الصغيرة لأن أصل تمايزها هو كيس الصفار. لا يزال التسبب المحدد للخلايا الدبقية الصغيرة في أمراض الشبكية هذه غير واضح. لذلك ، تبين أن إنشاء نموذج عضوي شبكي مدمج في الخلايا الدبقية الصغيرة أمر ضروري. هنا ، نجحنا في بناء نموذج مشترك من عضويات الشبكية مع الخلايا الدبقية الصغيرة المشتقة من الخلايا الجذعية البشرية. في هذه المقالة ، قمنا بتمييز الخلايا الدبقية الصغيرة ثم شاركنا في الاستزراع إلى عضويات الشبكية في المرحلة المبكرة. كدمج للخلايا المناعية ، يوفر هذا النموذج منصة محسنة لنمذجة أمراض الشبكية وفحص الأدوية لتسهيل البحث المتعمق حول التسبب في أمراض الشبكية والجهاز العصبي المركزي وعلاجها.
Introduction
كمصدر محدود لشبكية العين البشرية ، يمثل تمايز الخلايا الجذعية البشرية إلى عضويات شبكية ثلاثية الأبعاد (3D) نموذجا واعدا في المختبر لمحاكاة شبكية العين1. يحتوي على أنواع مختلفة من الخلايا في شبكية العين ، بما في ذلك المستقبلات الضوئية وخلايا العقدة الشبكية والخلايا ثنائية القطب وخلايا مولر والخلايا الأفقية والخلايا النجمية2. يتيح هذا النموذج محاكاة ودراسة كل من آليات نمو الشبكية والتسبب في أمراض الشبكية. ومع ذلك ، بسبب طريقة التمايز الاتجاهي ، تم اشتقاق عضويات الشبكية من الأديم الظاهر العصبي3 ، والتي تفتقر إلى العديد من أنواع الخلايا الأخرى التي تنشأ من طبقات جرثومية مختلفة ، مثل الخلايا الدبقية الصغيرة من كيس الصفار والخلايا المحيطة بالأوعية الدموية من الأديم المتوسط4،5،6.
في الوقت الحاضر ، ثبت أن العديد من أمراض الشبكية ، مثل التهاب الشبكية الصباغي7 ، والزرق8 ، والورم الأرومي الشبكي9 ، ترتبط ارتباطا وثيقا بالخلايا الدبقية الصغيرة داخل شبكية العين. ومع ذلك ، نظرا لعدم وجود نماذج بحثية مناسبة ، لا تزال الآليات المحددة التي توضح العلاقة بين الخلايا الدبقية الصغيرة وهذه الأمراض غير واضحة. في حين أن الفئران كانت بمثابة نموذج مناسب لدراسة أمراض الشبكية ، فقد أبرزت الدراسات الحديثة اختلافات كبيرة بين الخلايا الدبقية الصغيرة للفأر والإنسان من حيث العمر ومعدل الانتشار وغياب الجينات البشريةالمتماثلة 10,11. أشارت هذه النتائج إلى أن الاستنتاجات المستخلصة من نماذج الفئران قد لا تكون موثوقة تماما ، مما يؤكد أهمية بناء عضويات شبكية العين البشرية التي تحتوي على الخلايا الدبقية الصغيرة.
على مدى العقود القليلة الماضية ، تم تطوير طرق مختلفة للتمايز ثلاثي الأبعاد لعضويات الشبكية12,13. لتسهيل عملية الاستزراع المشترك للخلايا الدبقية الصغيرة داخل عضويات الشبكية ، اخترنا طريقة تمايز تتضمن الانتقال من ثقافة الالتصاق إلى ثقافة التعليق. يتيح هذا النهج بنجاح دمج الخلايا الدبقية الصغيرة في عضويات الشبكية ، والحفاظ عليها لمدة 60 يوما على الأقل14.
Protocol
Representative Results
Discussion
نظرا لمحدودية توافر شبكية العين البشرية ، فإن فهمنا الحالي للاستجابات الالتهابية للشبكية يأتي تقريبا من النماذج الحيوانية. للتغلب على هذا القيد ، تم تمييز عضويات الشبكية. كان تطوير نماذج الشبكية العضوية مجالا نشطا للبحث ، يهدف إلى تلخيص تعقيد شبكية العين البشرية لنمذجة المرض والتطوير ال…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
هذه الدراسة مدعومة من قبل المؤسسة الوطنية للعلوم الطبيعية في الصين (82101145) ومؤسسة بكين للعلوم الطبيعية (Z200014).
Materials
| Acctuase | Stemcell Technologies | 07920 | |
| Advanced DMEM/F12 | Thermo | 12634-010 | |
| Anti-CRX(M02) | abnova | H00001406-M02 | Antibody; dilution as per the manufacturer's instructions |
| Anti-IBA1 | Abcam | ab5076 | Antibody; dilution as per the manufacturer's instructions |
| B27 | Life Technologies | 17105-041 | |
| Dispase (1U/mL) | Stemcell Technologies | 07923 | |
| DMEM basic | Gibco | 10566-016 | |
| DMEM/F12 | Gibco | 10565-042 | |
| DPBS | Gibco | C141905005BT | |
| EDTA | Thermo | 15575020 | |
| F12 | Gibco | 11765-054 | |
| FBS | Biological Industry | 04-002-1A | |
| Gelatin | Sigma | G7041-100G | Solid |
| Glutamax | Gibco | 35050-061 | |
| H9 cell line | WiCell Research Institute | ||
| IL-3 | RD Systems | 203-IL-050 | |
| IL-34 | PeproTech | 200-34-50UG | |
| KSR | Gibco | 10828028 | |
| Matrix | Corning | 356231 | |
| M-CSF | RD Systems | 216-MC-500 | |
| MEM Non-essential Amino Acid Solution | Sigma | M7145 | |
| N2 | Life Technologies | 17502-048 | |
| Neurobasal | Gibco | 21103-049 | |
| Pen/strep | Gibco | 15140-122 | |
| Stem cell medium | Stemcell Technologies | 5990 | |
| Taurine | Sigma | T-8691-25G | |
| X-ViVO | LONZA | 04-418Q | |
| Y27632 | Selleck | S1049 | |
| β-mercaptoethanol | Life Technologies | 21985-023 |
References
- Cowan, C. S., et al. Cell types of the human retina and its organoids at single-cell resolution. Cell. 182 (6), 1623-1640.e34 (2020).
- Zhang, X., Jin, Z. B. Directed induction of retinal organoids from human pluripotent stem cells. J Vis Exp. (170), e62298 (2021).
- Eiraku, M., et al. Self-organizing optic-cup morphogenesis in three-dimensional culture. Nature. 472 (7341), 51-56 (2011).
- Ginhoux, F., et al. Fate mapping analysis reveals that adult microglia derive from primitive macrophages. Science. 330 (6005), 841-845 (2010).
- Kierdorf, K., et al. Microglia emerge from erythromyeloid precursors via pu.1- and irf8-dependent pathways. Nat Neurosci. 16 (3), 273-280 (2013).
- Schulz, C., et al. A lineage of myeloid cells independent of myb and hematopoietic stem cells. Science. 336 (6077), 86-90 (2012).
- O’koren, E. G., et al. Microglial function is distinct in different anatomical locations during retinal homeostasis and degeneration. Immunity. 50 (3), 723-737.e7 (2019).
- Margeta, M. A., et al. Apolipoprotein E4 impairs the response of neurodegenerative retinal microglia and prevents neuronal loss in glaucoma. Immunity. 55 (9), 1627-1644.e7 (2022).
- Xu, J., et al. Enhanced innate responses in microglia derived from retinoblastoma patient-specific IPSCs. Glia. 72 (5), 872-884 (2024).
- Gosselin, D., et al. An environment-dependent transcriptional network specifies human microglia identity. Science. 356 (6344), eaal3222 (2017).
- Galatro, T. F., et al. Transcriptomic analysis of purified human cortical microglia reveals age-associated changes. Nat Neurosci. 20 (8), 1162-1171 (2017).
- Nakano, T., et al. Self-formation of optic cups and storable stratified neural retina from human ESCs. Cell Stem Cell. 10 (6), 771-785 (2012).
- Kim, S., et al. transcriptome profiling, and functional validation of cone-rich human retinal organoids. Proc Natl Acad Sci U S A. 116 (22), 10824-10833 (2019).
- Gao, M. L., et al. Functional microglia derived from human pluripotent stem cells empower retinal organ. Sci China Life Sci. 65 (6), 1057-1071 (2022).
- Zhang, X., Jin, Z. B. Reconstruct human retinoblastoma in vitro. J Vis Exp. (188), e62629 (2022).
- Park, D. S., et al. IPS-cell-derived microglia promote brain organoid maturation via cholesterol transfer. Nature. 623 (7986), 397-405 (2023).
- Usui-Ouchi, A., et al. Integrating human ipsc-derived macrophage progenitors into retinal organoids to generate a mature retinal microglial niche. Glia. 71 (10), 2372-2382 (2023).
- Chichagova, V., et al. Incorporating microglia-like cells in human induced pluripotent stem cell-derived retinal organoids. J Cell Mol Med. 27 (3), 435-445 (2023).
