הרכבת אורגנואידים ברשתית עם מיקרוגליה
Summary
תאי מיקרוגליה הם תאי חיסון ייחודיים השוכנים ברשתית, וממלאים תפקידים מכריעים במחלות ניווניות שונות ברשתית. יצירת מודל תרבית משותפת של אורגנואידים ברשתית עם מיקרוגליה יכולה להקל על הבנה טובה יותר של הפתוגנזה והתקדמות הפיתוח של מחלות רשתית.
Abstract
בשל הנגישות המוגבלת של הרשתית האנושית, אורגנואידים ברשתית (ROs) הם המודל הטוב ביותר לחקר מחלת רשתית אנושית, אשר יכול לחשוף את מנגנון התפתחות הרשתית ואת התרחשות מחלת הרשתית. מיקרוגליה (MG) הם מקרופאגים ייחודיים ברשתית ובמערכת העצבים המרכזית (CNS), המשרתים תפקודי חסינות חיוניים. עם זאת, אורגנואידים ברשתית חסרים מיקרוגליה מכיוון שמקור ההתמיינות שלהם הוא שק החלמון. הפתוגנזה הספציפית של תאי מיקרוגליה במחלות רשתית אלה נותרה לא ברורה; לכן, הקמת מודל אורגנואיד רשתית משולב מיקרוגליה מתברר כהכרחי. כאן, בנינו בהצלחה מודל בתרבית משותפת של אורגנואידים ברשתית עם מיקרוגליה שמקורם בתאי גזע אנושיים. במאמר זה הבחנו בין תאי מיקרוגליה ולאחר מכן תרבית משותפת לאורגנואידים ברשתית בשלב המוקדם. כשילוב של תאים חיסוניים, מודל זה מספק פלטפורמה אופטימלית למידול מחלות רשתית וסינון תרופות כדי להקל על מחקר מעמיק על הפתוגנזה והטיפול במחלות הקשורות לרשתית ולמערכת העצבים המרכזית.
Introduction
כמקור המוגבל של הרשתית האנושית, התמיינות תאי גזע אנושיים לאורגנואידים תלת-ממדיים (תלת-ממדיים) ברשתית מייצגת מודל מבטיח במבחנה להדמיית הרשתית1. הוא מכיל סוגי תאים שונים ברשתית, כולל פוטורצפטורים, תאי גנגליון ברשתית, תאים דו-קוטביים, תאי מולר, תאים אופקיים ואסטרוציטים2. מודל זה מאפשר אמולציה ולימוד הן של מנגנוני התפתחות הרשתית והן של הפתוגנזה של מחלות רשתית. עם זאת, בשל שיטת ההתמיינות הכיוונית, אורגנואידים ברשתית נגזרו מהנוירואקטודרם3, חסרים סוגי תאים רבים אחרים שמקורם בשכבות נבט שונות, כגון מיקרוגליה משק החלמון ותאים פריווסקולריים מהמזודרם 4,5,6.
כיום, מחלות רשתית רבות, כגון רטיניטיס פיגמנטוזה7, גלאוקומה8 ורטינובלסטומה9, הוכחו כקשורות קשר הדוק למיקרוגליה בתוך הרשתית. עם זאת, בשל היעדר מודלים מחקריים מתאימים, מנגנונים ספציפיים הממחישים את הקשר בין מיקרוגליה למחלות אלה עדיין אינם ברורים. בעוד עכברים שימשו מודל חיובי לחקר מחלות רשתית, מחקרים אחרונים הדגישו הבדלים משמעותיים בין תאי מיקרוגליה בעכבר ובתאי מיקרוגליה אנושיים במונחים של תוחלת חיים, קצב התפשטות והיעדר גנים הומולוגיים אנושיים10,11. ממצאים אלה הצביעו על כך שמסקנות שהוסקו ממודלים של עכברים עשויות להיות לא אמינות לחלוטין, והדגישו את החשיבות של בניית אורגנואידים ברשתית אנושית המכילים מיקרוגליה.
במהלך העשורים האחרונים פותחו שיטות שונות להתמיינות תלת ממדית של אורגנואידים ברשתית12,13. כדי להקל על פעולת התרבית המשותפת של תאי מיקרוגליה בתוך אורגנואידים ברשתית, בחרנו שיטת בידול הכוללת מעבר מתרבית דבק לתרבית תרחיף. גישה זו מאפשרת לשלב תאי מיקרוגליה באורגנואידים ברשתית, ולשמור עליהם למשך 60 יום לפחות14.
Protocol
Representative Results
Discussion
בשל הזמינות המוגבלת של הרשתית האנושית, ההבנה הנוכחית שלנו של תגובות דלקתיות ברשתית מגיעה כמעט ממודלים של בעלי חיים. כדי להתגבר על מגבלה זו, אורגנואידים ברשתית היו מובחנים. פיתוח מודלים של אורגנואידים ברשתית היה תחום מחקר פעיל, שמטרתו לשחזר את מורכבות הרשתית האנושית לצורך מידול מחלות ופית?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
מחקר זה נתמך על ידי הקרן הלאומית למדעי הטבע של סין (82101145) והקרן למדעי הטבע של בייג’ינג (Z200014).
Materials
| Acctuase | Stemcell Technologies | 07920 | |
| Advanced DMEM/F12 | Thermo | 12634-010 | |
| Anti-CRX(M02) | abnova | H00001406-M02 | Antibody; dilution as per the manufacturer's instructions |
| Anti-IBA1 | Abcam | ab5076 | Antibody; dilution as per the manufacturer's instructions |
| B27 | Life Technologies | 17105-041 | |
| Dispase (1U/mL) | Stemcell Technologies | 07923 | |
| DMEM basic | Gibco | 10566-016 | |
| DMEM/F12 | Gibco | 10565-042 | |
| DPBS | Gibco | C141905005BT | |
| EDTA | Thermo | 15575020 | |
| F12 | Gibco | 11765-054 | |
| FBS | Biological Industry | 04-002-1A | |
| Gelatin | Sigma | G7041-100G | Solid |
| Glutamax | Gibco | 35050-061 | |
| H9 cell line | WiCell Research Institute | ||
| IL-3 | RD Systems | 203-IL-050 | |
| IL-34 | PeproTech | 200-34-50UG | |
| KSR | Gibco | 10828028 | |
| Matrix | Corning | 356231 | |
| M-CSF | RD Systems | 216-MC-500 | |
| MEM Non-essential Amino Acid Solution | Sigma | M7145 | |
| N2 | Life Technologies | 17502-048 | |
| Neurobasal | Gibco | 21103-049 | |
| Pen/strep | Gibco | 15140-122 | |
| Stem cell medium | Stemcell Technologies | 5990 | |
| Taurine | Sigma | T-8691-25G | |
| X-ViVO | LONZA | 04-418Q | |
| Y27632 | Selleck | S1049 | |
| β-mercaptoethanol | Life Technologies | 21985-023 |
References
- Cowan, C. S., et al. Cell types of the human retina and its organoids at single-cell resolution. Cell. 182 (6), 1623-1640.e34 (2020).
- Zhang, X., Jin, Z. B. Directed induction of retinal organoids from human pluripotent stem cells. J Vis Exp. (170), e62298 (2021).
- Eiraku, M., et al. Self-organizing optic-cup morphogenesis in three-dimensional culture. Nature. 472 (7341), 51-56 (2011).
- Ginhoux, F., et al. Fate mapping analysis reveals that adult microglia derive from primitive macrophages. Science. 330 (6005), 841-845 (2010).
- Kierdorf, K., et al. Microglia emerge from erythromyeloid precursors via pu.1- and irf8-dependent pathways. Nat Neurosci. 16 (3), 273-280 (2013).
- Schulz, C., et al. A lineage of myeloid cells independent of myb and hematopoietic stem cells. Science. 336 (6077), 86-90 (2012).
- O’koren, E. G., et al. Microglial function is distinct in different anatomical locations during retinal homeostasis and degeneration. Immunity. 50 (3), 723-737.e7 (2019).
- Margeta, M. A., et al. Apolipoprotein E4 impairs the response of neurodegenerative retinal microglia and prevents neuronal loss in glaucoma. Immunity. 55 (9), 1627-1644.e7 (2022).
- Xu, J., et al. Enhanced innate responses in microglia derived from retinoblastoma patient-specific IPSCs. Glia. 72 (5), 872-884 (2024).
- Gosselin, D., et al. An environment-dependent transcriptional network specifies human microglia identity. Science. 356 (6344), eaal3222 (2017).
- Galatro, T. F., et al. Transcriptomic analysis of purified human cortical microglia reveals age-associated changes. Nat Neurosci. 20 (8), 1162-1171 (2017).
- Nakano, T., et al. Self-formation of optic cups and storable stratified neural retina from human ESCs. Cell Stem Cell. 10 (6), 771-785 (2012).
- Kim, S., et al. transcriptome profiling, and functional validation of cone-rich human retinal organoids. Proc Natl Acad Sci U S A. 116 (22), 10824-10833 (2019).
- Gao, M. L., et al. Functional microglia derived from human pluripotent stem cells empower retinal organ. Sci China Life Sci. 65 (6), 1057-1071 (2022).
- Zhang, X., Jin, Z. B. Reconstruct human retinoblastoma in vitro. J Vis Exp. (188), e62629 (2022).
- Park, D. S., et al. IPS-cell-derived microglia promote brain organoid maturation via cholesterol transfer. Nature. 623 (7986), 397-405 (2023).
- Usui-Ouchi, A., et al. Integrating human ipsc-derived macrophage progenitors into retinal organoids to generate a mature retinal microglial niche. Glia. 71 (10), 2372-2382 (2023).
- Chichagova, V., et al. Incorporating microglia-like cells in human induced pluripotent stem cell-derived retinal organoids. J Cell Mol Med. 27 (3), 435-445 (2023).
