التطورات في تكنولوجيا الكائنات العضوية البقرية باستخدام واجهات أحادية الطبقة المعوية الصغيرة والكبيرة
Summary
تقدم هذه الدراسة بروتوكولا لتوليد أحاديات 2D المعوية البقرية من المواد العضوية ، مما يوفر وصولا محسنا لدراسة تفاعلات المضيف والممرض. ويشمل طرقا لتقييم سلامة الغشاء ووظائفه ، وتطوير النماذج المختبرية التي تحاكي فسيولوجيا الجهاز الهضمي للماشية. ويعد هذا النهج بفوائد طبية حيوية وزراعية كبيرة، بما في ذلك تعزيز استراتيجيات العلاج.
Abstract
يعتمد تطوير المعرفة بفسيولوجيا الجهاز الهضمي وأمراضه بشكل حاسم على تطوير نماذج دقيقة ومحددة الأنواع في المختبر تحاكي بأمانة الأنسجة المعوية في الجسم الحي . هذا أمر حيوي بشكل خاص للتحقيق في التفاعلات بين المضيف والممرض في الأبقار ، والتي تعد مستودعات مهمة لمسببات الأمراض التي تشكل مخاطر خطيرة على الصحة العامة. توفر المواد العضوية التقليدية 3D وصولا محدودا إلى السطح القمي للظهارة المعوية ، وهي عقبة تغلب عليها ظهور ثقافات أحادية الطبقة 2D. توفر هذه الثقافات ، المشتقة من الخلايا العضوية ، سطحا لمعيا مكشوفا لدراسة يسهل الوصول إليها. في هذا البحث ، تم تقديم بروتوكول مفصل لإنشاء واستدامة ثقافات أحادية الطبقة 2D من خلايا الكائنات العضوية المعوية الصغيرة والكبيرة في الأبقار. تتضمن هذه الطريقة بروتوكولات لتقييم سلامة الغشاء من خلال المقاومة الكهربائية عبر الظهارة والنفاذية شبه الخلوية جنبا إلى جنب مع تقنيات تلطيخ الكيمياء المناعية. تضع هذه البروتوكولات الأساس لإنشاء وتوصيف نظام استزراع أحادي الطبقة 2D ، مما يدفع حدود تطبيقات هذه الطريقة في البحوث الطبية الحيوية والانتقالية ذات الأهمية الصحية العامة. يتيح استخدام هذا النهج المبتكر تطوير نماذج ذات صلة من الناحية الفسيولوجية في المختبر لاستكشاف كل من الحالات الطبيعية والمريضة لفسيولوجيا أمعاء الماشية. إن الآثار المترتبة على التقدم الطبي الحيوي والزراعي عميقة ، مما يمهد الطريق لعلاجات أكثر فعالية للأمراض المعوية في الماشية ، وبالتالي تعزيز كل من رعاية وسلامة الأغذية.
Introduction
تمثل زراعة الخلايا الجذعية الظهارية المعوية في الثقافات ثلاثية الأبعاد (3D) ، والمعروفة باسم الكائنات العضوية المعوية ، تقدما كبيرا في التكنولوجيا في المختبر للتحقيق في وظائف الأمعاء والتغذية والتفاعلات مع مسببات الأمراض 1,2. تحاكي هذه الكائنات العضوية البنية المعقدة لظهارة الأمعاء في الجسم الحي عن طريق التكرار الذاتي والتنظيم في تكوينات ثلاثية الأبعاد تشمل سلالات الخلايا المعويةالمختلفة 3. تسلط هذه الميزة الضوء على إمكاناتها الكبيرة لدفع فهم البيولوجيا المعوية إلى الأمام.
إن الاهتمام المتزايد بتطبيق تكنولوجيا العضويات المعوية على المزرعة يستلزم صقل تقنيات الاستزراعوالصيانة 4,5. يتم التأكيد على أهمية هذه التكنولوجيا من خلال تأثيرها المحتمل على دراسة صحة الأمعاء لحيوانات المزرعة ، والتي تلعب دورا حاسما في إنتاجيتها ، وبالتالي اقتصاديات صناعة الأغذية من خلال التأثير على رعاية والتكاليف التشغيلية 6,7. على وجه التحديد ، فإن استخدام الثقافات العضوية المعوية لاستكشاف وظيفة الأمعاء للماشية له أهمية قصوى ، نظرا لدورها كخزانات لمسببات الأمراض المعوية الحيوانية المنشأ ، مثل السالمونيلا spp. و Escherichia coli (E. coli) O157: H78. يتم توطين مسببات الأمراض هذه في أجزاء معينة من الأمعاء ، مما يجعل من الضروري التمييز بين طرق زراعة الأعضاء المعوية حسب شريحة الأمعاء لتعزيز الدقة في الدراسات9.
عقبة كبيرة في دراسة العضويات المعوية هي الوصول المقيد إلى السطح القمي للخلية الظهارية10. عند استزراعها داخل مصفوفة خارج الخلية (ECM) ، توجه الخلايا نفسها بشكل طبيعي بحيث يواجه السطح القاعدي الخارج ، ويتم توجيه السطح القمي إلى الداخل10. لمواجهة هذا التحدي ، يتم تقديم الأساليب التي تنطوي على فصل المواد العضوية 3D إلى خلايا واحدة وزرعها في إدراج ثقافة الخلية شبه منفذة. ينشئ هذا الإعداد واجهة بين السطح القمي والمقصورة القاعدية. يوضح هذا البروتوكول أن الخلايا المشتقة من الكائنات العضوية المعوية البقرية يمكن أن تشكل طبقة أحادية 2D متماسكة ، كما يتضح من قياسات المقاومة الكهربائية عبر الظهارة (TEER) ومقايسات نفاذية الخلايا النظيرة. بالإضافة إلى ذلك ، يتم تأكيد تطور القطبية الخلوية مع حدود الفرشاة والوصلات الضيقة في الخلايا أحادية الطبقة 2D المشتقة من العضوية من خلال التألق المناعي والمجهر الإلكتروني ، مما يعكس خصائص ظهارة الأمعاء في الجسم الحي .
في هذه الدراسة ، يمثل الدقاق القناة المعوية الدقيقة ، ويشير المستقيم إلى القناة المعوية الغليظة. تعتمد هذه الاختيارات على مسببات الأمراض المعوية ذات الصلة مثل السالمونيلا النيابة، والتي يمكن أن تنقل الدقاق11، والإشريكية القولونية O157: H7 المعروفة باستعمار المستقيم9 في الماشية بشكل أساسي. يسلط اختيار هذه الأجزاء المعوية المحددة الضوء على ضرورة تكييف طرق زراعة الأعضاء المعوية مع منطقة الأمعاء من أجل الدقة في البحث. توضح هذه الطرق بالتفصيل الإجراء الخاص بزراعة واجهة أحادية الطبقة 2D مشتقة من الأعضاء بشكل فعال من هذه الأجزاء المعوية ، مما يوفر نموذجا قويا لاستكشاف صحة أمعاء الماشية ، والتهابات مسببات الأمراض ، والتفاعلات بين ميكروبيوم الأمعاء والمضيف.
Protocol
Representative Results
Discussion
تعتبر صحة الأمعاء أمرا بالغ الأهمية لكل من الإنتاجية والرفاه العام للماشية16. من خلال الاستفادة من تقنية 2D أحادية الطبقة المشتقة من المواد العضوية ، يمكن للعلماء الآن محاكاة البنية المعقدة لظهارة الأمعاء البقرية بدقة أكبر ضمن إعدادفي المختبر 5. لا يعيد هذا النهج المبتكر إنتاج التركيب الخلوي المتنوع لبطانة الأمعاء فحسب ، بما في ذلك أنسابها متعددة الخلايا فحسب ، بل يلتقط أيضا الخصائص الوظيفية الرئيسية ، مثل إفراز المخاط ووجود الزغابات الدقيقة ، وهي ضرورية لفهم فسيولوجيا الأمعاء وعلم الأمراض3. أدى تطوير بروتوكولات الاستزراع المصممة خصيصا لأجزاء من الدقاق والمستقيم إلى ظهور منصة متقدمة تعزز بشكل كبير القدرة على دراسة صحة الأمعاء الأبقارية. يتيح هذا النهج المتطور إجراء تحقيقات مفصلة في التفاعلات بين مسببات الأمراض الحيوانية المنشأ والبيئة المعوية للأبقار. تعد القدرة على تكرار ودراسة الجوانب الفريدة للنظام البيئي المعوي البقري في المختبر خطوة مهمة نحو تطوير استراتيجيات مستهدفة لتحسين صحة الماشية والتخفيف من انتشار الأمراض الحيوانية المصدر.
ومع ذلك ، لضمان تطوير أحادي الطبقة 2D بنجاح باستخدام عضويات معوية بقري ، من الأهمية بمكان الحفاظ على صحة وحيوية كل من الكائنات العضوية وخلاياها المفردة المنفصلة. يعد التعامل الدقيق وتقليل الإجهاد أمرا بالغ الأهمية في الحفاظ على سلامة الخلية ووظائفها ، والتي تعتبر ضرورية للنمو الفعال للعضويات والإنشاء اللاحق لطبقة أحادية تعمل لاحقا. علاوة على ذلك ، يعتمد تحقيق طبقة أحادية موحدة على التفكك الناجح للعضويات إلى خلايا مفردة دون تكوين كتل كبيرة. يمكن لمثل هذه الكتل أن تعطل توزيع الخلايا وتعرض بنية الطبقة الأحادية للخطر. لذلك ، فإن استخدام تقنيات دقيقة للتفكك السلس أمر بالغ الأهمية ، مما يؤدي إلى تعليق ثابت أحادي الخلية. بالإضافة إلى ذلك ، يصبح تقليل الاضطرابات أثناء التصاق الخلايا وعند غسل الخلايا الزائدة غير الملتصقة مفيدا. هذا النهج مهم بشكل خاص لمعالجة القضايا المحتملة مع مورفجينيسيس 3D ، وبالتالي تعزيز الجودة الشاملة للطبقة الأحادية.
ومن التحديات الملحوظة مع الهلاميات المائية القائمة على إدارة المحتوى في المؤسسة والتي هي من أصل بيولوجي التباين من دفعة إلى أخرى في التركيب17. في حين لم يلاحظ ذلك باستخدام البروتوكولات والمواد الموصوفة ، فإن الاختلافات من دفعة إلى أخرى في تكوين ECM يمكن أن تشكل تحديات أمام التطوير الأحادي الطبقة الناجح. إذا تم اختراق تكوين أحادي الطبقة عند تغيير منتجات ECM أو العلامات التجارية أو أرقام اللوت ، فقد تكون خطوات التحسين ضرورية لتحديد تركيز ECM المناسب المطلوب لطلاء إدخالات زراعة الخلية.
علاوة على ذلك ، يعد ضبط وسط المزرعة إلى درجة حرارة الغرفة قبل إجراء أي تغييرات خطوة حاسمة تساعد على تخفيف الصدمات الحرارية وحماية صحة الخلايا والحفاظ على جودة كل من الثقافات العضوية وأحادية الطبقة. تعتبر ممارسات الغسيل اللطيف ذات أهمية قصوى أيضا في الحفاظ على سلامة الطبقة الأحادية أثناء تكوينها والمقايسات اللاحقة ، وتجنب الاضطرابات يمكن أن يمنع عدم الدقة في النتائج. بدا استبدال PBS بمحلول الملح المتوازن (HBSS) من هانك مفيدا في تقليل انفصال الطبقة الأحادية عندما أصبح مشكلة أثناء الغسيل المتكرر أو التعرض لفترات طويلة ل PBS ، كما هو الحال في مقايسات نفاذية الخلايا النظيرة. أخيرا ، يعد تصميم وسط المزرعة لتلبية الاحتياجات المحددة للخلايا من أجزاء مختلفة من الأمعاء ، مثل الدقاق والمستقيم ، أمرا ضروريا للتكرار بدقة في ظروف الجسم الحي . تضمن هذه الخصوصية صحة الخلية ووظائفها المثلى ، مما يسهل النمذجة الدقيقة لفسيولوجيا أمعاء الماشية والتفاعلات مع مسببات الأمراض ، وبالتالي تسليط الضوء على هذه الخطوات الحاسمة في أبحاث الكائنات العضوية.
إلى جانب استخدام ممارسة التعامل اللطيف مع الخلايا ، فإن بناء الكفاءة التقنية الجيدة المرتبطة بحساب الخلايا وقياسات TEER أمر بالغ الأهمية للتطوير الناجح لطبقة أحادية 2D فعالة. نظرا لأن كثافات البذر المنخفضة جدا والعالية جدا الناتجة عن الإفراط في العد أو النقص في عدد الخلايا ، على التوالي ، يمكن أن تؤدي إلى نمو أحادي الطبقة معرض. يتم تشجيعه على مراجعة عدد الخلايا بعناية وضمان كثافة البذر المناسبة في الحالات التي يشتبه فيها في كثافات بذر غير دقيقة. بالإضافة إلى ذلك ، يمكن أن تؤدي تقنيات قياس TEER غير الكافية إلى تعطيل الطبقة الأحادية عن طريق الخدوش غير المقصودة مع الأقطاب الكهربائية. يمكن أن يساعد إدخال الأقطاب الكهربائية بعناية إلى الغرفة القمية وإيلاء اهتمام خاص للحفاظ على اتجاهها الرأسي بالنسبة لسطح الغشاء في التخفيف من مخاطر التلف العرضي للطبقة الأحادية.
تم تكييف طرق مقايسة نفاذية الخلايا الموصوفة هنا من بروتوكول سابق18. يتم إجراء تعديلات على البروتوكول المبلغ عنه ، والتي تشمل أخذ عينات متعددة على مدى 120 دقيقة واستبدال الحصة المأخوذة بكميات متساوية من PBS ، لتحسين دقة النتائج وموثوقيتها. يعد الحفاظ على الحجم الكلي داخل الغرفة أمرا بالغ الأهمية لعدة أسباب: فهو يحافظ على التوازن التناضحي ، ويضمن سلامة الخلية ، ويحافظ على تدرج التركيز الضروري لتقييم النفاذية بدقة ، ويمنع التغيرات في الضغط الهيدروستاتيكي التي يمكن أن تؤثر على معدلات النقل. هذه الممارسة المتمثلة في تجديد الغرفة القاعدية ب PBS جديد مكافئ لحجم عينة PBS المحتوية على مادة التتبع الفلورية أمر محوري للحفاظ على هذه الظروف ، مما يتيح إجراء تقييمات دقيقة وذات مغزى لنفاذية الطبقة الواحدة. يعمل اختبار نفاذية الخلايا كمكمل لقياس TEER من خلال تقييم حركة جزيئات التتبع عبر الطبقة الأحادية مباشرة. علاوة على ذلك ، قد لا تسفر مقارنة قيم TEER عبر المختبرات المختلفة عن رؤى ذات صلة ، حيث يمكن أن تتأثر هذه القيم بالعديد من المتغيرات ، مثل درجة الحرارة والظروف المحددة التي يتم فيها زراعة الخلايا ، بما في ذلك أنواع الخلايا وأرقام المرور وتكوين وسط الاستزراع19. يوفر اختبار نفاذية الخلايا تقييما وظيفيا في المختبر للتعبير الفعال عن الالتصاقات والوصلات الضيقة داخل الحاجز الظهاري20.
في حين أن تطوير أحاديات الطبقات ثنائية الأبعاد من المواد العضوية ثلاثية الأبعاد يمثل تقدما كبيرا في تكنولوجيا الاستزراع ، فمن المهم الاعتراف بالقيود المرتبطة بالطبقات أحادية الطبقة ثنائية الأبعاد. أحد العيوب الرئيسية هو أن هذا لا يزال نظام استزراع ثابت ، يفتقر إلى التحفيز الديناميكي الموجود في البيئة في الجسم الحي . بالإضافة إلى ذلك ، يمثل تعديل محتوى الأكسجين داخل نظام الاستزراع تحديات بسبب إعداده المفتوح الذي يتضمن لوحات استزراع ذات أغطية ، مما يجعله أقل ملاءمة للاستزراع المشترك طويل الأمد مع البكتيريا اللاهوائية. يمكن معالجة هذه القيود من خلال اعتماد منصات استزراع أكثر ديناميكية ، مثل أنظمة الموائع الدقيقة21 ، والتي توفر بيئة أكثر تحكما وذات صلة من الناحية الفسيولوجية. علاوة على ذلك ، من الأهمية بمكان أن ندرك أنه في حين أن ظروف الاستزراع الحالية غنية بالعناصر الغذائية المفيدة للحفاظ على نمو الخلايا الجذعية ، إلا أنها قد لا تكون مثالية لإحداث تمايز فسيولوجي للخلايا الظهارية. يسلط هذا التناقض الضوء على الحاجة إلى التحسين في الأبحاث المستقبلية لمحاكاة الظروف في الجسم الحي عن كثب ودعم عملية التمايز. من خلال معالجة هذه القيود وتحسين هذه الأساليب ، يتم تعزيز فائدة وإمكانية تطبيق تقنيات الزراعة العضوية ، والاقتراب من تكرار الديناميات والتفاعلات المعقدة للجهاز الهضمي في المختبر.
يوفر بروتوكول توليد أحاديات الطبقات 2D من الأنسجة اللفائفية والمستقيمية البقري للباحثين نموذجا قيما في المختبر للواجهة اللمعية لكل من ظهارة الأمعاء الصغيرة والكبيرة. يفتح هذا النموذج إمكانيات واسعة للتطبيق في دراسات التغذية الحيوانية الأساسية ، لا سيما في فحص كيفية امتصاص العناصر الغذائية في ظل ظروف مختلفة. أحد مجالات الاهتمام البارزة هو التحقيق في متلازمة الأمعاء المتسربة ، التي تتميز بزيادة غير طبيعية في نفاذية الجهاز الهضمي ، وغالبا ما تنجم عن التحولات الغذائية ودرجات الحرارة البيئية القصوى22,23. علاوة على ذلك ، يعمل هذا النموذج كأداة أساسية لاستكشاف التفاعلات المعقدة بين ميكروبيوم الأمعاء ومضيفه. يسمح بدراسة كيفية تأثير الكائنات الحية الدقيقة المتعايشة على صحة الكائن الحي المضيف ، ومعالجة جانب حاسم من العلوم البيطرية والطبية1،24. بالإضافة إلى ذلك ، غالبا ما توجد مسببات الأمراض التي تنقلها الأغذية البشرية كمتعايشات في قطاعات مختلفة من أمعاء الماشية8،9،25 ، يتيح هذا البروتوكول إجراء دراسات مفصلة للظروف المحددة التي تسمح لهذه العوامل الحيوانية المنشأ بالازدهار في مجالات تخصصها.
خلال هذه الدراسة ، لوحظ أن الطبقات الأحادية المشتقة من المستقيم واللفائفي تتطلب ظروفا مختلفة للتطور الناجح. على وجه التحديد ، عندما تم زرع الطبقات الأحادية العضوية المشتقة من المستقيم في البداية على إدخالات زراعة الخلايا المحضرة بهيدروجيل قائم على ECM بنسبة 2٪ في الوسائط القاعدية لمدة 1 ساعة ، لوحظت ثقوب كبيرة وتقشير الخلايا. تم حل هذه المشكلة عن طريق التحول إلى وسط زراعة أحادي الطبقة المستقيم المتخصص وتمديد فترة الحضانة إلى ليلة واحدة قبل البذر ، في حين تم تطوير أحاديات الطبقة المشتقة من العضوية اللفائفية بنجاح باستخدام بروتوكول تحضير أقصر. علاوة على ذلك ، أدت إضافة CHIR99021 إلى وسط الاستزراع باستمرار إلى تحسين إنشاء أحاديات المستقيم26 ولكنها لم تكن ضرورية للطبقات الأحادية اللفائفية27. بالإضافة إلى ذلك ، تتطلب الطبقات الأحادية اللفائفية كثافة خلايا أعلى للتطور الناجح مقارنة بعضويات المستقيم27. طورت هذه الظروف المحسنة (الجدول 1) بشكل متكرر طبقات أحادية تحافظ على سلامة الحاجز المقاوم ، مما يؤكد أهمية تكييف ظروف الاستزراع مع قطاع الأمعاء المحدد.
يعد الوصول إلى نموذج يعكس بدقة تعقيد النسب متعدد الخلايا للأمعاء في الجسم الحي أمرا بالغ الأهمية لهذه التحقيقات. يسمح للباحثين بمحاكاة الظروف الطبيعية لبيئة الأمعاء عن كثب ، مما يوفر أساسا أكثر موثوقية للتجارب. مع هذا البروتوكول ، تم تجهيز الباحثين بنموذج قوي يعزز قدراتهم البحثية ، مما قد يؤدي إلى اكتشافات رائدة في مجالات دراستهم. لا يساهم هذا النهج في فهم صحة الأمعاء والأمراض فحسب ، بل يساعد أيضا في تطوير استراتيجيات لتحسين إدارة الثروة الحيوانية وسلامة الأغذية.
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
تم دعم هذه الدراسة جزئيا من قبل مكتب مدير المعاهد الوطنية للصحة (K01OD030515 و R21OD031903 إلى YMA) ومنحة أبحاث WSU VCS للمقيمين وطلاب الدراسات العليا (إلى GDD). يود المؤلفون أن يشكروا المسلخ المشارك على توفير الماشية المانحة.
Materials
| Basal Medium | |||
| Advanced DMEM/F12 (1X) | Gibco | 12634-010 | n/a |
| GlutaMAX-I (100X) | Gibco | 35050-061 | 2 mM |
| HEPES (1M) | Gibco | 15630-080 | 10 mM |
| Pen Strep Glutamine (100X) | Gibco | 10378-016 | 1X |
| Organoid Culture Medium (Supplements to Basal Medium) | |||
| A-83-01 | Sigma-Aldrich | SML0788-5MG | 500 nM |
| B27 Supplement (50X) | Gibco | 17504-001 | 1X |
| [Leu15]-Gastrin I human | Sigma-Aldrich | G9145-.5MG | 10 nM |
| Murine EGF | PeproTech | 315-09-500UG | 50 ng/mL |
| Murine Wnt-3a | PeproTech | 315-20-10UG | 100 ng/mL |
| N-Acetyl-L-cysteine | MP Biomedicals | 194603 | 1 mM |
| N-2 MAX Media Supplement (100X) | R&D Systems | AR009 | 1X |
| Nicotinamide | Sigma-Aldrich | N0636-100G | 10 mM |
| Noggin Conditioned Medium | n/a | n/a | 10 vol/vol % |
| Primocin | InvivoGen | ant-pm-2 | 100 µg/mL |
| R-Spondin-1 Conditioned Medium | n/a | n/a | 20 vol/vol % |
| SB202190 | Sigma-Aldrich | S7067-25MG | 10 µM |
| Monolayer Culture Medium (Supplements to Organoid Culture Medium) | |||
| CHIR99021 | Sigma-Aldrich | SML1046-5MG | 2.5 µM |
| HI FBS | Gibco | 10438-034 | 20 vol/vol % |
| LY2157299 | Sigma-Aldrich | SML2851-5MG | 500 nM |
| Y-27632 | StemCellTechnologies | 72308 | 10 µM |
| Reagents | |||
| Alexa Fluor 488 Mouse anti-E-cadherin | BD Biosciences | 560061 | 1:200 dilution |
| Alexa Fluor 647 Phalloidin | Invitrogen | A22287 | 1:400 dilution |
| BSA | Cytiva | SH30574.02 | 2 w/vol % |
| Cell Recovery Solution | Corning | 354253 | n/a |
| DAPI Solution (1 mg/mL) | Thermo Scientific | 62248 | 1:1000 dilution |
| DPBS (1X) | Gibco | 14190-144 | n/a |
| Fluorescein Isothiocyanate–Dextran | Sigma-Aldrich | FD4-100MG | 0.5 mg/mL |
| Matrigel Matrix | Corning | 354234 | n/a |
| Paraformaldehyde Solution (4%) | Thermo Scientific | J19943K2 | n/a |
| ProLong Gold antifade reagent | Invitrogen | P36930 | n/a |
| SNA, EBL, Fluorescein | Vector Laboratories | FL-1301 | 1:100 dilution |
| Triton X-100 | Thermo Scientific | A16046.AE | 0.3 vol/vol % |
| TrypLE Express | Gibco | 12605-028 | n/a |
| Trypan Blue Solution, 0.4% | VWR Life Science | K940-100ML | n/a |
| Materials and Equipment | |||
| 0.4 µm Cell Culture Insert | Falcon | 353095 | |
| 24-well Cell Culture Plate | Corning | 3524 | |
| 48-well Cell Culture Plate | Thermo Scientific | 150687 | |
| 70 µm Sterile Cell Strainer | Fisher Scientific | 22-363-548 | |
| 96-well Cell Culture Plate | Greiner Bio-One | 655086 | |
| Centrifuge | Eppendorf | 5910Ri | |
| CO2 Incubator | Thermo Scientific | 370 | |
| Epithelial Volt-Ohm Meter | Millipore | Millicell ERS-2 | |
| Hemocytometer | LW Scientific | CTL-HEMM-GLDR | |
| Inverted Confocal Microscope | Leica Microsystems | SP8-X | |
| Inverted Phase-Contrast Microscope | Leica Microsystems | DMi1 | |
| Microscope Cover Glass | Fisher Scientific | 12-540-B | |
| Microplate Reader | Molecular Devices | SpecrtraMax i3x | |
| Microscope Slides | Fisher Scientific | 22-034-486 | |
| Pasteur Pipets | Fisher Scientific | 13-678-20C | |
| Scalpel Blade | iMed Scientific | – | #11 carbon steel |
| Vortex Mixer | Scientific Industries | SI-0236 | |
| Software | |||
| LAS X imaging software | Leica Microsystems | LAS X 3.7.6.25997 | |
| Microplate Reader software | Molecular Devces | SoftMax Pro 7.1.2 |
References
- Min, S., Kim, S., Cho, S. W. Gastrointestinal tract modeling using organoids engineered with cellular and microbiota niches. Exp Mol Med. 52 (2), 227-237 (2020).
- Fitzgerald, S. F., et al. Shiga toxin sub-type 2a increases the efficiency of Escherichia coli O157 transmission between animals and restricts epithelial regeneration in bovine enteroids. PLoS Pathogens. 15 (10), e1008003 (2019).
- Dutta, D., Heo, I., Clevers, H. Disease modeling in stem cell-derived 3D organoid systems. Trend Mol Med. 23 (5), 393-410 (2017).
- Beaumont, M., et al. Intestinal organoids in farm animals. Vet Res. 52 (1), 33 (2021).
- Kawasaki, M., Dykstra, G. D., McConnel, C. S., Burbick, C. R., Ambrosini, Y. M. Adult bovine-derived small and large intestinal organoids: In vitro development and maintenance. J Tissue Eng Regene Med. 2023, e3095002 (2023).
- Kvidera, S. K., et al. Intentionally induced intestinal barrier dysfunction causes inflammation, affects metabolism, and reduces productivity in lactating Holstein cows. J Dairy Sci. 100 (5), 4113-4127 (2017).
- Crawford, C. K., et al. Inflammatory cytokines directly disrupt the bovine intestinal epithelial barrier. Sci Rep. 12 (1), 14578 (2022).
- Heredia, N., García, S. Animals as sources of food-borne pathogens: A review. Animal Nutri. 4 (3), 250-255 (2018).
- Naylor, S. W., et al. Lymphoid follicle-dense mucosa at the terminal rectum is the principal site of colonization of enterohemorrhagic Escherichia coli O157:H7 in the bovine host. Infect Immun. 71 (3), 1505-1512 (2003).
- Co, J. Y., et al. Controlling epithelial polarity: A human enteroid model for host-pathogen interactions. Cell Rep. 26 (9), 2509-2520.e4 (2019).
- Pullinger, G. D., et al. Systemic translocation of Salmonella enterica Serovar Dublin in cattle occurs predominantly via efferent lymphatics in a cell-free niche and requires type III secretion system 1 (T3SS-1) but not T3SS-2. Infect Immun. 75 (11), 5191-5199 (2007).
- Nickerson, K. P., et al. A versatile human intestinal organoid-derived epithelial monolayer model for the study of enteric pathogens. Microbiol Spectr. 9 (1), e0000321 (2021).
- Varani, J., McClintock, S. D., Aslam, M. N. Cell-matrix interactions contribute to barrier function in human colon organoids. Front Med. 9, 838975 (2022).
- Freire, R., et al. Human gut derived-organoids provide model to study gluten response and effects of microbiota-derived molecules in celiac disease. Sci Rep. 9, 7029 (2019).
- Ambrosini, Y. M., et al. Recapitulation of the accessible interface of biopsy-derived canine intestinal organoids to study epithelial-luminal interactions. PLoS ONE. 15 (4), e0231423 (2020).
- Kogut, M. H., Arsenault, R. J. Editorial: Gut health: The new paradigm in food animal production. Front Vet Sci. 3, 71 (2016).
- Lingard, E., et al. Optimising a self-assembling peptide hydrogel as a Matrigel alternative for 3-dimensional mammary epithelial cell culture. Biomater Adv. 160, 213847 (2024).
- Turksen, K. . Permeability Barrier: Methods and Protocols. , (2011).
- Srinivasan, B., et al. TEER measurement techniques for in vitro barrier model systems. J Lab Autom. 20 (2), 107-126 (2015).
- Frost, T. S., Jiang, L., Lynch, R. M., Zohar, Y. Permeability of epithelial/endothelial barriers in Transwells and microfluidic bilayer devices. Micromachines. 10 (8), 533 (2019).
- Bein, A., et al. Microfluidic organ-on-a-chip models of human intestine. Cell Mol Gastroenterol Hepatol. 5 (4), 659 (2018).
- Sanz-Fernandez, M. V., et al. Targeting the hindgut to improve health and performance in cattle. Animals. 10 (10), 1817 (2020).
- Gressley, T. F., Hall, M. B., Armentano, L. E. Ruminant nutrition symposium: Productivity, digestion, and health responses to hindgut acidosis in ruminants. J Anim Sci. 89 (4), 1120-1130 (2011).
- O’Hara, E., Neves, A. L. A., Song, Y., Guan, L. L. The role of the gut microbiome in cattle production and health: Driver or passenger. Ann Rev Animal Biosci. 8 (2020), 199-220 (2020).
- Beach, J. C., Murano, E. A., Acuff, G. R. Prevalence of Salmonella and Campylobacter in beef cattle from transport to slaughter. J Food Protect. 65 (11), 1687-1693 (2002).
- Kawasaki, M., Ambrosini, Y. M. Accessible luminal interface of bovine rectal organoids generated from cryopreserved biopsy tissues. PLoS One. 19 (3), e0301079 (2024).
- Kawasaki, M., McConnel, C. S., Burbick, C. R., Ambrosini, Y. M. Pathogen-epithelium interactions and inflammatory responses in Salmonella Dublin infections using ileal monolayer models derived from adult bovine organoids. Scientific Reports. 14 (1), 11479 (2024).
