התקדמות בטכנולוגיית אורגנואיד בקר באמצעות ממשקים חד-שכבתיים של מעי קטן וגדול

קריפטים של מעיים נרכשו מעודפי דגימות מעיים שמקורם בבית מטבחיים מקומי, ואיתות של תורמים מסופק בטבלה משלימה 1. אורגנואידים נוצרו באמצעות רקמות שמקורן בבעלי חיים שעברו המתת חסד הומנית בבית מטבחיים, ובעלי חיים לא נרכשו רק למחקר זה; לפיכך, מחקר זה פטור מביקורת IACUC, והצהרת אתיקה אינה ישימה. 1. ציפוי ECM על תוספות תרבית תאים לתרבית חד-שכבתית דו-ממדית שמקורה באורגנואידים הערה: כל ההליכים מתבצעים באמצעות חומרים מעוקרים וטכניקות אספטיות בארון בטיחות ביולוגית. כל הריאגנטים נשמרים על קרח לאורך כל ההליך, אלא אם כן צוין אחרת. הכן 100 μL של ECM לציפוי כל 0.33ס” מ 2 תרבית תאים להוסיף על ידי ערבוב מדיום בסיסי עם 2% (v/v) הידרוג’ל מבוסס ECM במיקרו צינור. יש להסיר את תרבית התאים הבודדת מהאריזה עם מלקחיים מעוקרים ולהניח בנפרד בבארות של צלחת תרבית תאים שטוחה ושטוחה בעלת 24 בארות. החל 100 μL של ציפוי ECM שהוכן בשלב 1.1 על התא האפי של כל תוספת תרבית תאים שהוכנה בשלב 1.2. יש להחליף את המכסה ולדגור על צלחת תרבית התאים המכילה תוספות תרבית תאים מצופות באינקובטור לח בטמפרטורה של 37°C ו-5% CO2 למשך שעה אחת.עבור תאי אורגנואיד איליאליים, העלון מוכן לשימוש לאחר דגירה של שעה אחת. עבור תאי אורגנואיד רקטליים, לאחר דגירה של שעה אחת, יש להחליף את ציפוי ECM בתווך תרבית חד-שכבתית רקטלית ולדגור למשך הלילה (טבלה 1). הכן תוספות נוספות של תרביות תאים עבור פקדים ריקים אם מיועד לבצע מדידות TEER. אילאום פי הטבעת זמן הדגירה של ציפוי ECM 1 שעות שעה ואחריהלילה במדיה התרבותית של מונולייר תוספים למדיום תרבית אורגנואידים CHIR99021 LY2157299 LY2157299 Y-27632 Y-27632 סרום בקר עוברי סרום בקר עוברי צפיפות זריעת תאים (תאים/באר) 5 x 105 3 x 105 טבלה 1: סיכום הפרוטוקול הממוטב ליצירת חד-שכבות דו-ממדיות הנגזרות מאורגנואידים רקטליים ורקטיליים של בקר בוגר. 2. זריעת תאי אורגנואיד רקטליים ו/או רקטליים ותרבית חד-שכבתית דו-ממדית הערה: הפרוטוקול המתואר בסעיף זה משתמש באורגנואידים איליאליים ורקטליים של בקר, אשר תורבתו ותוחזקו על לוחות של 48 בארות תוך שימוש בטכניקות המתוארות5. לקבלת תוצאות מיטביות, מומלץ להשתמש באורגנואידים מתוחזקים היטב שעברו יותר מ -3 פעמים לאחר ההקמה הראשונית וגודלו בתרבית במשך יותר מ -3 ימים לאחר המעבר האחרון. מבלי להפריע לכיפת הידרוג’ל מבוססת ECM המכילה אורגנואידים בוגרים, הסר את מדיית תרבית האורגנואידים באמצעות פיפט פסטר חד פעמי מזכוכית המחובר למערכת ואקום והוסף 300 מיקרוליטר של תמיסת דה-פולימריזציה ECM קרה כקרח לכל באר. לדגור לפחות 1 שעה ב 4 °C (75 °F).הערה: לחלופין, יש לשבש מכנית את האורגנואיד המכיל כיפת הידרוג’ל מבוססת ECM לאחר הוספת תמיסת דה-פולימריזציה של ECM ולאסוף תרחיף בצינור חרוטי של 15 מ”ל לפני הדגירה ב-4°C. שיטה זו מומלצת כאשר אורגנואידים שאינם מיועדים לשמש לתרבית חד-שכבתית דו-ממדית מתורבתים בו זמנית על אותה צלחת. צפיפות התרביות האורגנואידיות משפיעה באופן משמעותי על מספר הבארות הדרושות לזריעה אופטימלית לתוספות תרביות תאים.עבור תרביות אורגנואידים בצפיפות גבוהה (איור משלים 1A), תוספות תרבית תאים רקטליות משתמשות ביחס זריעה בטווח של 1:1 עד 1:2, כלומר באר תרבית אחת יכולה לזרוע באר אחת עד שתיים. עבור איליאום, שמור על יחס של 1:1. לעומת זאת, תרביות בצפיפות נמוכה יותר (איור משלים 1B) זקוקות ליותר בארות תרבות; השתמש ב-3-4 בארות תרבית אורגנואידים רקטליות עבור תוספת אחת של תרבית תאים רקטלית (יחס של 3-4:1), ובבארות תרבית אורגנואידים איליאליות עבור תוספת תרבית תאים איליאלית אחת (יחס של 4-5:1). בדוק חזותית המסת הידרוג’ל מלאה מבוססת ECM ואסוף תרחיף אורגנואיד לצינור חרוטי של 15 מ”ל. אורגנואידים גלולתיים על ידי צנטריפוגה ב 200 x גרם ו 4 ° C במשך 5 דקות. להשליך supernatant. גלולת השעיה ב-1 מ”ל של תמיסת אנזים דיסוציאציה של תאים רקומביננטיים בתוספת 10 מיקרומטר Y-27632. יש לדגור על תרחיף אורגנואידים באמבט מים של 37 מעלות צלזיוס למשך 10 דקות עם טלטול לסירוגין של 3-5 שניות עם מערבולת כל 2-3 דקות כדי להקל על דיסוציאציה אורגנואידית יעילה. לאחר עיכול אנזימטי, הוסף 5 מ”ל של מדיום בסיסי ופיפטה באגרסיביות עם מיקרופיפטה P1000 כדי לשבש עוד יותר אורגנואידים לתאים בודדים. בדוק את המתלה עבור גושים אורגנואידים, ואם עדיין ניתן להבחין חזותית, חזור על פיפטינג כדי לשפר את הדיסוציאציה של תא יחיד. הכינו צינור חרוטי 50 מ”ל עם מסננת תאים 70 מיקרומטר. הרטיבו מראש את המסננת על ידי מריחת 1-2 מ”ל של מדיום בסיסי. סנן את תרחיף התאים דרך המסננת כדי להסיר שאריות של פסולת הידרוג’ל מבוססת ECM וגושי תאים גדולים. שטפו את הצינור המקורי של 15 מ”ל ואת מסננת התאים של 70 מיקרומטר בתוספת של 10 מ”ל של מדיום בסיסי.הערה: אם תרחיף התא אינו עובר בקלות דרך מסננת, זה עשוי להיות אינדיקציה לדיסוציאציה אורגנואידית חלקית. ניתן לנסות להעביר מחדש את תרחיף התאים שנאסף דרך אותה מסננת תאים של 70 מיקרומטר. ייתכן שיהיה צורך בהפרעה אנזימטית או מכנית נוספת. תרחיף חד-תאי גלולה על ידי צנטריפוגה ב 200 x גרם ו 4 ° C במשך 5 דקות. הסר supernatant ו resuspend תאים עם נפח מתאים של מדיום בסיסי כדי לבצע ספירת תאים. ספור תאים קיימא עם המוציטומטר לאחר צביעה כחולה טריפאן כדי לחשב את המספר הכולל של תאים שנאספו. תרחיף חד-תאי גלולה על ידי צנטריפוגה ב 200 x גרם ו 4 ° C במשך 5 דקות. הסר תאים סופרנאטנטיים והשהה מחדש לצפיפות זריעה מתאימה בתווך תרבית חד-שכבתי מתאים (טבלה 1).עבור תאי אורגנואיד איליאליים, יש להשהות מחדש תאים לריכוז של 2.5 x 106 תאים/מ”ל כדי להשיג צפיפות זריעה של 5 x 105 תאים לכל תרבית תאים ב-200 מיקרוליטר של מדיום תרבית חד-שכבתי איליאלי, שהוא מצע תרבית האורגנואידים בתוספת LY2157299 500 ננומטר, 10 מיקרומטר Y-27632 וסרום בקר עוברי (FBS) 20%. עבור תאי אורגנואידים רקטליים, תאי השעיה מחדש לריכוז של 1.5 x 106 תאים / מ”ל כדי להשיג צפיפות זריעה של 3 x 105 תאים לכל תרבית תאים להכניס 200 μL של מדיום תרבית חד שכבתית רקטלית, שהוא מדיה תרבית אורגנואידים בתוספת 100 ננומטר CHIR99021, 500 ננומטר LY2157299, 10 מיקרומטר Y-27632, ו-20% FBS. יש לאחזר את צלחת תרבית התאים בעלת 24 הקידוחים עם תוספות תרבית תאים מצופות ECM ולרוקן את התא האפי של תרבית התא בשאיבת ואקום זהירה כדי לא להפריע לציפוי. יש למרוח בעדינות 200 μL של תרחיף חד-תאי שהוכן בשלב 2.10 על התא האפי של תוספת תרבית התא. עבור הבקרה הריקה, הוסף 200 μL של מדיה תרבית ללא תאים בתא האפיקאלי. עבור הבקרה הריקה, הוסף 200 μL של מדיה תרבית ללא תאים בתא האפיקאלי. יש למרוח 500 μL של מדיום תרבית חד-שכבתי בתוספת מתאימה (תלוי בתאים איליאליים לעומת רקטליים) על החדר הבזולטרלי של כל באר. יש לדגור באינקובטור לח בטמפרטורה של 37°C ו-5%CO2 כדי להקל על הידבקות התא וצמיחתו ליצירת חד-שכבה דו-ממדית על תוספת תרבית התא. החליפו את אמצעי התרבית הן בחדרים אפיים והן בתאים בזולטרליים אחת ליומיים החל מ-48 שעות לאחר זריעת תאים. ודא זמן דגירה שווה עבור הפקד הריק וההוספה המכילה תא. 3. מדידת TEER הערה: השיטה המתוארת כאן משתמשת במערכת מדידה ידנית של TEER הזמינה מסחרית בשם מד מתח אפיתל עם זוג אלקטרודות Ag/AgCl (איור 1A). קביעת TEER על פני חד-שכבה דו-ממדית דורשת מדידה של בארות ריקות. ודא שהקריאה הריקה נלקחת באותו אופן כמו הדגימה. אחזר צלחת המכילה תוספות תרבית תאים עם חד-שכבות דו-ממדיות שמקורן באורגנואידים וריק מהאינקובטור. מניחים לצלחת להגיע לטמפרטורת החדר למשך כ-10 דקות. לחטא את האלקטרודות עם 70% אתנול ולאפשר להם להתייבש לחלוטין. הציגו בזהירות את האלקטרודות עם הקצה הקצר בתא האפי והקצה הארוך בתא הבזולטרלי (איור 1A).הערה: נדרשת זהירות יתרה כדי לא להפריע לחד-שכבה של התא. אפשר לקריאה להתאזן ורשום את הערך באוהם כאשר הוא מתייצב.הערה: הרגישות של מד המתח היא כזו שתנודות בערך האוהם יתרחשו בעת לקיחת מדידת ההתנגדות החשמלית. קריאה אמינה מתקבלת כאשר המדידות מתייצבות ומרחפות באופן עקבי סביב ערך מישורי. קבע TEER של monolayer דו-ממדי באמצעות הנוסחה הבאה:TEER (Ω x ס”מ 2) = שטח הפנים של תוספות תרבית תאים (ס”מ 2) x התנגדות חשמלית נטוכאשר ההתנגדות החשמלית נטו שווה להתנגדות הנמדדת של הכנס החד-שכבתי של התא פחות ההתנגדות הנמדדת של התוספת הריקה. תוספות תרבית תאים עבור לוחות 24 בארות יש שטח פנים של 0.33 ס”מ2. איור 1: הערכת שלמות מחסום אפיתל של חד-שכבה דו-ממדית שמקורה באורגנואידים במעי בקר. (A) סכמטי של מיקום מתאים של אלקטרודות בתוך החדרים האפיקליים והבזולטרליים של תוספת תרבית תאים למדידות TEER. האלקטרודה הקצרה מוחדרת לתא האפיקאלי, והאלקטרודה הארוכה ממוקמת בתא הבזולטרלי בזהירות כדי למנוע מגע עם הממברנה. (B) סכמה של תהליך בדיקת החדירות. תאי תרבית תאים נשטפים 2x עם PBS מחומם, ו 0.5 מ”ג / מ”ל 4 kDa FITC-dextran tracer מומס PBS מוחל על תא apical . אליציטוטים חוזרים של 50 μL מהחדר הבזולטרלי נדגמים עם החלפת נפח שווה של PBS כדי לשמור על הנפח הכולל בחדר הבזולטרלי לאורך כל תקופת הדגירה. עוצמת הפלואורסצנטיות של aliquot נמדדת באמצעות קורא microplate כדי לכמת את הדיפוזיה של נותב 4 kDa FITC-dextran על פני monolayer התא. (C) ההתפתחות הדינמית של שלמות המחסום בתוך חד-שכבות איליאליות ורקטליות לאורך זמן הוערכה באמצעות מדידות TEER (המיוצגות על ידי עיגולים סגורים עבור האילאום וריבועים סגורים עבור פי הטבעת) ומבחני חדירות (המסומנים על ידי עיגולים פתוחים עבור האילאום וריבועים פתוחים עבור פי הטבעת) עם נותב 4 kDa FITC-dextern. ביום השלישי של התרבות, שני סוגי החד-שכבות הציגו את הקמתם של מחסומי אפיתל יציבים ופונקציונליים, כפי שמעידים פרופילי TEER וחדירות בהתאמה. התוצאות הן ממוצע של לפחות שני ניסויים עצמאיים עם שני שכפולים טכניים. קווי שגיאה מייצגים את ה- SEM של המדידות. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה. 4. בדיקת חדירות פארא-תאית הערה: בדיקה זו כוללת את קביעת עוצמת הפלואורסצנטיות הנובעת מדיפוזיה של איזותיוציאנט פלואורסצאין (FITC)-דקסטרן מהחדר האפי לחדר הבזולטרלי על פני חד-שכבות דו-ממדיות במשך 120 דקות (איור 1B). לקבלת תוצאות מיטביות, מומלץ למזער את החשיפה לאור במהלך הבדיקה ולבצע מדידות בקורא microplate מיד לאחר כל דגימה כדי למנוע כל ירידה או מרווה של פלואורסצנטיות. ניתן להשתמש בכל באר פעם אחת בלבד ולא ניתן לעשות בה שימוש חוזר בבדיקות הבאות. הכינו לפחות 2 בארות שישמשו כשכפולים טכניים לכל בדיקה. לדוגמה, נדרשות בסך הכל 6 בארות כדי לקבל את התוצאות המוצגות באיור 1C, שבו הבדיקות בוצעו בשכפול ב-3 נקודות זמן שונות (ימים 1, 3 ו-5 של תרבית). הכן סדרת דילול עקומה סטנדרטית עם 4 kDa FITC-dextran במי מלח חוצצי פוספט (PBS). עבור כל דילול, פיפטה 50 μL לצלחת 96 באר משולש.הערה: מומלץ ליצור סדרה של 5-7 דילולים בטווח של 0 עד 0.5 מ”ג/מ”ל. קבע את עוצמת הפלואורסצנטיות של התקנים בקורא מיקרו-לוחות מכויל מראש באורך גל עירור של 495 ננומטר ובאורך גל פליטה של 535 ננומטר. חשב את הרגרסיה הליניארית עם תוצאות עוצמת פלואורסצנטיות ליצירת עקומה סטנדרטית. אחזור צלחת המכילה תוספות תרבית תאים עם חד-שכבות דו-ממדיות שמקורן באורגנואידים מהאינקובטור. הסר את אמצעי התרבית החד-שכבתיים מהחדר האפי והבזולטרלי של עלון תרבית התא המכיל את החד-שכבה הדו-ממדית שמקורה באורגנואידים להערכה. שטפו בעדינות כל תא 2x עם 200 μL (תא אפיקלי) ו-500 μL (תא בזולטרלי) של PBS שחומם מראש, בהתאמה. הסר את תמיסת השטיפה מתא האפיקלי והחל 200 μL של 0.5 מ”ג / מ”ל 4 kDa FITC-dextran tracer ב- PBS על התא האפי של תוספת תרבית התא. יש לדגור באינקובטור לח בטמפרטורה של 37°C ו-5%CO2 למשך 20 דקות. דגימה של 50 μL מהחדר הבזולטרלי של הצלחת המודגרת בת 24 הקידוחים והעברה לצלחת תואמת 96 בארות לקורא מיקרו-צלחות. החלף 50 μL של PBS טרי בתא basolateral של הבאר שנדגמה. בצע מיד מדידת עוצמת פלואורסצנטיות בקורא מיקרו-לוחות מכויל מראש באורך גל עירור של 495 ננומטר ובאורך גל פליטה של 535 ננומטר. חזור על שלבים 4.6-4.10 כל 20 דקות עד 120 דקות. בסוף הבדיקה, אם רוצים לשמר את החד-שכבה הדו-ממדית, שוטפים הן את החדר האפי והן את החדר הבזולטרלי ב-PBS 2x טרי, מחליפים במדיום תרבית חד-שכבתי טרי ודוגרים.הערה: ניתן לבצע הערכה נוספת של חד-שכבות דו-ממדיות, כלומר, מדידות TEER, צביעה אימונופלואורסצנטית וכו ‘; עם זאת, זה לא מומלץ כמו נותב פלואורסצנטי שיורי סביר ועשוי להשפיע על הניתוח. קבע את מקדם החדירות הנראה (Papp) באמצעות הנוסחה הבאה:ΔQ / Δt = ריכוז נותב פלואורסצנטי שהעביר את החד-שכבה לתא הבזולטרלי של תרבית התא שהוכנס במשך הזמן הספציפי, נמדד על ידי עוצמת הפלואורסצנטיות ואקסטרפולציה למק”ג/מ”ל דרך העקומה הסטנדרטיתA = שטח הפנים של תרבית התא מוסיףCo = ריכוז של נותב פלואורסצנטי שנוסף לתא האפי של תרבית התא בהכנסה של מיקרוגרם/מ”ל 5. צביעה אימונופלואורסצנטית של חד-שכבה דו-ממדית שמקורה באורגנואידים הסר מדיית תרבית חד-שכבתית מתרבית תאים, הכנס עם שאיבת ואקום והוסף 200 μL של 4% paraformaldehyde (PFA). יש לדגור בטמפרטורת החדר למשך 15-30 דקות לצורך קיבוע תאים. יש להסיר את PFA עם שאיבת ואקום ולשטוף עם 100 μL של PBS 2x. חדיר תאים עם 100 μL של 0.3% Triton X-100 באלבומין 2% בסרום בקר (BSA) ב- PBS על ידי דגירה בטמפרטורת החדר למשך 10 דקות. יש להסיר את הסופרנאטנט עם שאיבת ואקום ולשטוף עם 100 μL של PBS 2x. מוציאים סופרנאטנט ומחליפים ב-2% BSA ב-PBS ודגרים בטמפרטורת החדר למשך שעה לחסימה. יש לסלק סופרנטנט, למרוח 100 μL של נוגדן ראשוני מדולל ב-2% BSA ב-PBS ולדגור בטמפרטורת החדר למשך שעה אחת, או למשך הלילה ב-4°C.הערה: ריכוזי הנוגדנים הראשוניים המשמשים נמצאים בטבלת החומרים. אלא אם צוין אחרת, המלצות היצרן מתבצעות. יש להסיר סופרנאטנט ולשטוף עם 100 μL של PBS 3x. יש למרוח 100 μL של נוגדן משני מדולל ב-2% BSA ב-PBS ולדגור בטמפרטורת החדר למשך שעה אחת, או למשך הלילה ב-4°C.הערה: ניתן לדלג על שלב זה אם הנוגדן העיקרי המשמש מצומד עם בדיקה פלואורסצנטית. ריכוזי נוגדנים משניים בשימוש נמצאים בטבלת החומרים. אלא אם צוין אחרת, המלצות היצרן מתבצעות. יש להסיר סופרנאטנט ולשטוף עם 100 μL של PBS 3x. אופציונלי: לצביעה נגדית של F-אקטין וגרעינים (DAPI), יש להכין על ידי ערבוב שתי הגשושיות בדילול מתאים (לפי המלצת היצרן) ב-PBS, למרוח 100 μL ולדגור בטמפרטורת החדר למשך 30 דקות. יש להסיר סופרנאטנט ולשטוף עם 100 μL של PBS 3x. גזור בזהירות את תרבית התא, הכנס קרום עם להב אזמל, והרכבה על מגלשת זכוכית עם פתרון הרכבה. מניחים פתק כיסוי ומתבוננים.