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Avanços na tecnologia de organoides bovinos usando interfaces de monocamada de intestino delgado e grosso

Published: June 14, 2024
doi:
10.3791/67010
, ,
1Department of Veterinary Microbiology and Pathology, College of Veterinary Medicine,Washington State University, 2Department of Veterinary Clinical Sciences, College of Veterinary Medicine,Washington State University

Summary

Este estudo apresenta um protocolo para geração de monocamadas 2D intestinais bovinas a partir de organoides, oferecendo melhor acesso para o estudo das interações patógeno-hospedeiro. Inclui métodos para avaliar a integridade e funcionalidade da membrana, avançando modelos in vitro que imitam a fisiologia gastrointestinal do gado. Essa abordagem promete benefícios biomédicos e agrícolas significativos, incluindo estratégias de tratamento aprimoradas.

Abstract

O avanço do conhecimento da fisiologia gastrointestinal e suas doenças depende criticamente do desenvolvimento de modelos in vitro precisos e específicos da espécie que imitam fielmente os tecidos intestinais in vivo . Isso é particularmente vital para investigar as interações patógeno-hospedeiro em bovinos, que são reservatórios significativos para patógenos que representam sérios riscos à saúde pública. Os organoides 3D tradicionais oferecem acesso limitado à superfície apical do epitélio intestinal, um obstáculo superado pelo advento das culturas de monocamada 2D. Essas culturas, derivadas de células organoides, fornecem uma superfície luminal exposta para um estudo mais acessível. Nesta pesquisa, um protocolo detalhado é introduzido para criar e sustentar culturas de monocamada 2D a partir de células de organoides do intestino delgado e grosso bovinos. Este método inclui protocolos para avaliar a integridade da membrana por meio de resistência elétrica transepitelial e permeabilidade paracelular, juntamente com técnicas de coloração imunocitoquímica. Esses protocolos estabelecem as bases para estabelecer e caracterizar um sistema de cultura de monocamada bovina 2D, ultrapassando os limites dessas aplicações de métodos em pesquisas biomédicas e translacionais de importância para a saúde pública. O emprego dessa abordagem inovadora permite o desenvolvimento de modelos in vitro fisiologicamente pertinentes para explorar os estados normais e doentes da fisiologia intestinal do gado. As implicações para os avanços biomédicos e agrícolas são profundas, abrindo caminho para tratamentos mais eficazes para doenças intestinais em bovinos, aumentando assim o bem-estar animal e a segurança alimentar.

Introduction

A cultura de células-tronco epiteliais intestinais em culturas tridimensionais (3D), conhecidas como organoides intestinais, marca um avanço significativo na tecnologia in vitro para investigar funções intestinais, nutrição e interações com patógenos 1,2. Esses organoides imitam a estrutura complexa do epitélio intestinal in vivo, auto-replicando-se e organizando-se em formações 3D que abrangem várias linhagens de células intestinais3. Esse recurso destaca seu considerável potencial para impulsionar a compreensão da biologia intestinal.

O crescente interesse na aplicação da tecnologia organoide intestinal em animais de fazenda requer o refinamento das técnicas de cultura e manutenção 4,5. A relevância dessa tecnologia é ressaltada por seu impacto potencial no estudo da saúde intestinal de animais de fazenda, que desempenha um papel crítico em sua produtividade e, consequentemente, na economia da indústria de alimentos e animais, influenciando o bem-estar animal e os custos operacionais 6,7. Especificamente, o emprego de culturas organoides intestinais para explorar a função intestinal do gado é de suma importância, dado seu papel como reservatórios de patógenos entéricos zoonóticos, como Salmonella spp. e Escherichia coli (E. coli) O157: H78. Esses patógenos estão localizados em segmentos específicos do intestino, tornando essencial diferenciar os métodos de cultura organoide intestinal por segmento intestinal para aumentar a precisão nos estudos9.

Um obstáculo significativo no estudo dos organoides intestinais é o acesso restrito à superfície apical da célula epitelial10. Quando cultivadas dentro de uma matriz extracelular (MEC), as células naturalmente se orientam para que a superfície basal fique voltada para fora e a superfície apical seja direcionada para dentro10. Para enfrentar esse desafio, são apresentados métodos que envolvem a dissociação de organoides 3D em células únicas e a semeadura em inserções de cultura de células semipermeáveis. Esta configuração estabelece uma interface entre a superfície apical e um compartimento basolateral. Este protocolo demonstra que células derivadas de organoides intestinais bovinos podem formar uma monocamada 2D coerente, como evidenciado por medições de resistência elétrica transepitelial (TEER) e ensaios de permeabilidade paracelular. Além disso, o desenvolvimento da polaridade celular com bordas em escova e junções apertadas nas células de monocamada 2D derivadas de organoides é confirmado por imunofluorescência e microscopia eletrônica, refletindo as propriedades do epitélio intestinal in vivo .

Neste estudo, o íleo representa o trato intestinal delgado e o reto significa o trato intestinal grosso. Essas seleções são baseadas em patógenos entéricos relevantes, como Salmonella spp., que pode translocar o íleo11, e E. coli O157: H7, conhecida por colonizar principalmente o reto9 em bovinos. A seleção desses segmentos intestinais específicos destaca a necessidade de adaptar os métodos de cultura organoide intestinal à região intestinal para precisão na pesquisa. Esses métodos detalham o procedimento para cultivar efetivamente uma interface de monocamada 2D derivada de organoides desses segmentos intestinais, fornecendo um modelo robusto para explorar a saúde intestinal do gado, infecções por patógenos e interações entre o microbioma intestinal e o hospedeiro.

Protocol

As criptas intestinais foram obtidas a partir de amostras intestinais excedentes provenientes de um matadouro local, e a sinalização dos doadores é fornecida na Tabela Suplementar 1. Os organoides foram gerados usando tecidos derivados de animais que foram sacrificados humanamente em um matadouro, e os animais não foram adquiridos apenas para esta pesquisa; portanto, este estudo está isento da revisão da IACUC e uma declaração de ética não é aplicável. 1. Revestimento ECM em insertos de cultura de células para cultura de monocamada 2D derivada de organoides NOTA: Todos os procedimentos são realizados com recurso a materiais esterilizados e técnicas assépticas em cabine de biossegurança. Todos os reagentes são mantidos em gelo durante todo o procedimento, salvo indicação em contrário. Prepare 100 μL de ECM para revestir cada inserto de cultura decélulas 2 de 0,33 cm misturando meio basal com hidrogel à base de ECM a 2% (v/v) em um microtubo completamente. Remova o inserto de cultura de células individual da embalagem com uma pinça esterilizada e coloque individualmente nos poços de uma placa de cultura de células de fundo plano transparente de 24 poços. Aplique 100 μL de revestimento de ECM preparado na etapa 1.1 na câmara apical de cada inserto de cultura de células preparado na etapa 1.2. Volte a colocar a tampa e incubar a placa de cultura celular que contém a(s) inserção(ões) de cultura celular revestida(s) numa incubadora humidificada a 37 °C e 5% de CO2 durante 1 h.Para células organoides ileais, o inserto está pronto para uso após 1 h de incubação. Para células organoides retais, após 1 h de incubação, substitua o revestimento de ECM por meio de cultura de monocamada retal e incube durante a noite (Tabela 1). Prepare insertos de cultura de células extras para controles em branco, se destinados a realizar medições TEER. Íleo Recto Tempo de incubação do revestimento ECM 1 h 1 h seguido dedurante a noite em meios de cultura monocamada Suplementação parameio de cultura organoide CHIR99021 LY2157299 LY2157299 Y-27632 Y-27632 Soro fetal bovino Soro fetal bovino Densidade de semeadura celular (células/poço) 5 x 105 3 x 105 Tabela 1: Resumo do protocolo otimizado para criação de monocamadas 2D derivadas de organoides ileais e retais bovinos adultos. 2. Semeadura de células organoides ileais e/ou retais bovinas e cultura de monocamada 2D NOTA: O protocolo descrito nesta seção utiliza organoides ileais e retais bovinos, que foram cultivados e mantidos em placas de 48 poços usando as técnicas descritas5. Para obter os melhores resultados, é aconselhável usar organoides mantidos de forma estável que tenham sido passados mais de 3x após o estabelecimento inicial e tenham sido cultivados por mais de 3 dias após a passagem mais recente. Sem perturbar a cúpula de hidrogel à base de ECM contendo organoides maduros, remova o meio de cultura organoide usando uma pipeta de Pasteur de vidro descartável conectada a um sistema de vácuo e adicione 300 μL de solução de despolimerização de ECM gelada por poço. Incubar durante, pelo menos, 1 h a 4 °C.NOTA: Alternativamente, interrompa mecanicamente a cúpula de hidrogel à base de ECM contendo organoide após a adição da solução de despolimerização ECM e colete a suspensão em um tubo cônico de 15 mL antes de incubar a 4 ° C. Este método é recomendado quando organoides que não se destinam a ser usados para cultura de monocamada 2D são cultivados simultaneamente na mesma placa. A densidade das culturas organoides influencia significativamente o número de poços de cultura organoide necessários para a semeadura ideal em inserções de cultura de células.Para culturas organoides de alta densidade (Figura Suplementar 1A), as pastilhas de cultura de células retais usam uma proporção de semeadura na faixa de 1:1 a 1:2, o que significa que um poço de cultura pode semear de um a dois poços. Para íleo, mantenha a proporção em 1:1. Em contraste, culturas de baixa densidade (Figura Suplementar 1B) requerem mais poços de cultura; Use 3-4 poços de cultura de organoides retais para um inserto de cultura de células retais (proporção de 3-4:1) e 4-5 percursos de cultura de organoides ileais para um inserto de cultura de células ileais (proporção de 4-5:1). Inspecione visualmente a dissolução completa do hidrogel à base de ECM e colete a suspensão organoide em um tubo cônico de 15 mL. Organoides de pellets por centrifugação a 200 x g e 4 °C durante 5 min. Rejeitar o sobrenadante. Ressuspenda o pellet em 1 mL de solução enzimática de dissociação celular recombinante suplementada com 10 μM de Y-27632. Incubar a suspensão organoide em banho-maria a 37 °C por 10 min com agitação intermitente de 3-5 s com um vórtice a cada 2-3 min para facilitar a dissociação efetiva do organoide. Após a digestão enzimática, adicione 5 mL de meio basal e pipete agressivamente com uma micropipeta P1000 para interromper ainda mais os organoides em células individuais. Inspecione a suspensão em busca de aglomerados organoides e, se ainda for visualmente apreciável, repita a pipetagem para aumentar a dissociação de uma única célula. Prepare um tubo cônico de 50 mL com um filtro de células de 70 μm. Umedeça previamente o filtro aplicando 1-2 mL de meio basal. Filtre a suspensão da célula através do filtro para remover detritos residuais de hidrogel à base de ECM e grandes aglomerados de células. Enxágue o tubo original de 15 mL e o filtro de células de 70 μm com mais 10 mL de meio basal.NOTA: Se a suspensão celular não passar facilmente por um filtro, pode ser uma indicação de dissociação organoide incompleta. Pode-se tentar repassar a suspensão celular coletada através do mesmo filtro de células de 70 μm. Pode ser necessária uma interrupção enzimática ou mecânica adicional. Suspensão monocelular de pellets por centrifugação a 200 x g e 4 °C durante 5 min. Remova o sobrenadante e ressuspenda as células com um volume apropriado de meio basal para realizar a contagem de células. Conte as células viáveis com um hemocitômetro após a coloração com azul de tripano para calcular o número total de células coletadas. Suspensão monocelular de pellets por centrifugação a 200 x g e 4 °C durante 5 min. Remover o sobrenadante e ressuspender as células até à densidade de propagação adequada no respectivo meio de cultura monocamada (Quadro 1).Para células organoides ileais, ressuspenda as células até a concentração de 2,5 x 106 células/mL para atingir uma densidade de semeadura de 5 x 105 células por inserção de cultura de células em 200 μL de meio de cultura de monocamada ileal, que é o meio de cultura organoide suplementado com 500 nM LY2157299, 10 μM Y-27632 e 20% de soro bovino fetal (FBS). Para células organoides retais, ressuspenda as células à concentração de 1,5 x 106 células/mL para atingir uma densidade de semeadura de 3 x 105 células por inserção de cultura celular em 200 μL de meio de cultura monocamada retal, que é o meio de cultura organoide suplementado com 100 nM CHIR99021, 500 nM LY2157299, 10 μM Y-27632, e 20% FBS. Recupere a placa de cultura de células de 24 poços com inserto de cultura de células revestido com ECM e esvazie a câmara apical do inserto de cultura de células com sucção a vácuo cuidadosa para não romper o revestimento. Aplique suavemente 200 μL de suspensão unicelular preparada na etapa 2.10 na câmara apical do inserto de cultura celular. Para o controle em branco, adicione 200 μL de meio de cultura sem células na câmara apical. Para o controle em branco, adicione 200 μL de meio de cultura sem células na câmara apical. Aplique 500 μL de meio de cultura monocamada adequadamente suplementado (dependendo das células ileais versus retais) na câmara basolateral de cada poço. Incubar em uma incubadora umidificada a 37 °C e 5% de CO2 para facilitar a adesão e o crescimento celular para formar uma monocamada 2D confluente no inserto de cultura de células. Troque os meios de cultura nas câmaras apicais e basolaterais em dias alternados, começando 48 h após a semeadura celular. Garanta o mesmo tempo de incubação para o controle em branco e a inserção que contém a célula. 3. Medição TEER NOTA: O método descrito aqui usa um sistema de medição TEER manual disponível comercialmente conhecido como voltohímetro epitelial com um par de eletrodos Ag / AgCl (Figura 1A). A determinação de TEER em uma monocamada 2D requer a medição de poços em branco. Certifique-se de que a leitura em branco seja feita da mesma maneira que a amostra. Recupere a placa contendo inserções de cultura de células com monocamada(s) 2D derivada de organoide e branco da incubadora. Deixe o prato atingir a temperatura ambiente por aproximadamente 10 min. Desinfete os eletrodos com etanol 70% e deixe-os secar completamente. Introduza cuidadosamente os eletrodos com a extremidade curta na câmara apical e a extremidade longa na câmara basolateral (Figura 1A).NOTA: Recomenda-se cuidado extra para não romper a monocamada da célula. Permita que a leitura se equilibre e registre o valor em ohm quando ela se estabilizar.NOTA: A sensibilidade do voltohímetro é tal que ocorrerão flutuações do valor do ohm durante a medição da resistência elétrica. Uma leitura confiável é obtida quando as medições se estabilizam e pairam consistentemente em torno de um valor de platô. Determine o TEER da monocamada 2D com a seguinte fórmula:TEER (Ω x cm2) = área de superfície dos insertos de cultura de células (cm2) x resistência elétrica líquidaOnde a resistência elétrica líquida é igual à resistência medida do inserto monocamada da célula menos a resistência medida do inserto em branco. Os insertos de cultura celular para placas de 24 poços têm uma área de superfície de 0,33 cm2. Figura 1: Avaliação da integridade da barreira epitelial de monocamada 2D derivada de organoide intestinal bovino. (A) Esquema do posicionamento apropriado dos eletrodos dentro das câmaras apicais e basolaterais de um inserto de cultura de células para medições TEER. O eletrodo curto é inserido na câmara apical e o eletrodo longo é colocado na câmara basolateral com cuidado para evitar o contato com a membrana. (B) Esquema do processo de ensaio de permeabilidade. As câmaras de cultura de células são lavadas 2x com PBS aquecido e o marcador FITC-dextrano de 0,5 mg/mL 4 kDa dissolvido em PBS é aplicado à câmara apical. Alíquotas repetidas de 50 μL da câmara basolateral são amostradas com a substituição de um volume igual de PBS para manter o volume total na câmara basolateral durante todo o período de incubação. A intensidade de fluorescência da alíquota é medida usando um leitor de microplacas para quantificar a difusão do traçador FITC-dextrano de 4 kDa através da monocamada da célula. (C) O desenvolvimento dinâmico da integridade da barreira dentro das monocamadas ileais e retais ao longo do tempo foi avaliado utilizando medições TEER (representadas por círculos fechados para o íleo e quadrados fechados para o reto) e ensaios de permeabilidade (denotados por círculos abertos para o íleo e quadrados abertos para o reto) com um traçador FITC-dextrano de 4 kDa. No dia 3 de cultivo, ambos os tipos de monocamadas exibiram o estabelecimento de barreiras epiteliais estáveis e funcionais, como evidenciado por seus respectivos perfis de TEER e permeabilidade. Os resultados são a média de pelo menos dois experimentos independentes com duas réplicas técnicas. As barras de erro representam o SEM das medições. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura. 4. Ensaio de permeabilidade paracelular NOTA: Este ensaio envolve a determinação da intensidade de fluorescência resultante da difusão de isotiocianato de fluoresceína (FITC)-dextrano da câmara apical para a câmara basolateral através de monocamadas 2D durante 120 min (Figura 1B). Para obter os melhores resultados, é aconselhável minimizar a exposição à luz durante o ensaio e fazer medições em um leitor de microplacas imediatamente após cada amostragem para evitar qualquer diminuição ou extinção da fluorescência. Cada poço só pode ser usado uma vez e não pode ser reutilizado em ensaios subsequentes. Prepare pelo menos 2 poços para servir como réplicas técnicas para cada ensaio. Por exemplo, um total de 6 poços são necessários para obter os resultados apresentados na Figura 1C, onde os ensaios foram executados em duplicata em 3 pontos de tempo diferentes (dias 1, 3 e 5 de cultura). Preparar séries de diluição da curva padrão com 4 kDa FITC-dextrano em solução salina tamponada com fosfato (PBS). Para cada diluição, pipetar 50 μL para uma placa de 96 poços em triplicata.NOTA: Recomenda-se criar uma série de 5-7 diluições variando de 0 a 0,5 mg / mL. Determinar a intensidade de fluorescência dos padrões num leitor de microplacas pré-calibrado com um comprimento de onda de excitação de 495 nm e um comprimento de onda de emissão de 535 nm. Calcule a regressão linear com resultados de intensidade de fluorescência para criar uma curva padrão. Recupere a placa contendo inserções de cultura de células com monocamadas(ões) 2D derivadas de organoides da incubadora. Remover os meios de cultura em monocamada da câmara apical e basolateral da pastilha de cultura celular que contém a monocamada 2D derivada de organoides a avaliar. Lave suavemente cada câmara 2x com 200 μL (câmara apical) e 500 μL (câmara basolateral) de PBS pré-aquecido, respectivamente. Remova a solução de lavagem da câmara apical e aplique 200 μL de 0,5 mg / mL 4 kDa marcador FITC-dextrano em PBS na câmara apical do inserto de cultura de células. Incubar em uma incubadora umidificada a 37 °C e 5% de CO2 por 20 min. Amostra de 50 μL da câmara basolateral da placa incubada de 24 poços e transferência para uma placa de 96 poços compatível com o leitor de microplacas. Substituir 50 μL de PBS fresco na câmara basolateral do poço amostrado. Faça imediatamente a medição da intensidade de fluorescência em um leitor de microplacas pré-calibrado em um comprimento de onda de excitação de 495 nm e comprimento de onda de emissão de 535 nm. Repita as etapas 4.6-4.10 a cada 20 minutos até 120 minutos. No final do ensaio, se a preservação da monocamada 2D for desejada, enxágue a câmara apical e basolateral com PBS 2x fresco, substitua por meio de cultura monocamada fresco e incuba.NOTA: Uma avaliação adicional das monocamadas 2D pode ser realizada, ou seja, medições TEER, coloração de imunofluorescência, etc.; no entanto, não é recomendado, pois o traçador fluorescente residual é provável e pode afetar a análise. Determine o coeficiente de permeabilidade aparente (Papp) com a seguinte fórmula:ΔQ / Δt = concentração do traçador fluorescente que passou a monocamada para a câmara basolateral do inserto de cultura celular durante o período de tempo específico, medido pela intensidade de fluorescência e extrapolado para μg/mL através da curva padrãoA = área de superfície das inserções de cultura de célulasCo = concentração do marcador fluorescente adicionado à câmara apical do inserto da cultura celular em μg/ml 5. Coloração de imunofluorescência de monocamada 2D derivada de organoide Remova o meio de cultura monocamada do inserto de cultura de células com sucção a vácuo e adicione 200 μL de paraformaldeído a 4% (PFA). Incube em temperatura ambiente por 15-30 min para fixação celular. Remova o PFA com sucção a vácuo e lave com 100 μL de PBS 2x. Permeabilize as células com 100 μL de Triton X-100 a 0,3% em albumina de soro bovino (BSA) a 2% em PBS, incubando em temperatura ambiente por 10 min. Remova o sobrenadante com sucção a vácuo e lave com 100 μL de PBS 2x. Remova o sobrenadante e substitua por 2% de BSA em PBS e incube em temperatura ambiente por 1 h para bloqueio. Remova o sobrenadante, aplique 100 μL de anticorpo primário diluído em 2% BSA em PBS e incube em temperatura ambiente por 1 h ou durante a noite a 4 ° C.NOTA: As concentrações de anticorpos primários usados estão na Tabela de Materiais. A menos que especificado, as recomendações do fabricante são seguidas. Remova o sobrenadante e lave com 100 μL de PBS 3x. Aplique 100 μL de anticorpo secundário diluído em 2% de BSA em PBS e incube em temperatura ambiente por 1 h ou durante a noite a 4 ° C.NOTA: Esta etapa pode ser ignorada se o anticorpo primário usado for conjugado com uma sonda de fluorescência. As concentrações de anticorpos secundários usados estão na Tabela de Materiais. A menos que especificado, as recomendações do fabricante são seguidas. Remova o sobrenadante e lave com 100 μL de PBS 3x. Opcional: Para contracoloração de F-actina e núcleos (DAPI), prepare misturando ambas as sondas na diluição apropriada (por recomendação do fabricante) em PBS, aplique 100 μL e incube em temperatura ambiente por 30 min. Remova o sobrenadante e lave com 100 μL de PBS 3x. Corte cuidadosamente a membrana de inserção de cultura de células com uma lâmina de bisturi e monte em uma lâmina de vidro com uma solução de montagem. Coloque uma lamínula e observe.

Representative Results

Este protocolo gera de forma confiável monocamadas 2D derivadas de organoides intestinais bovinos robustos do trato intestinal delgado e grosso, emulando a complexidade do epitélio intestinal in vivo . Este método utiliza organoides maduros desenvolvidos a partir de espécimes de cripta intestinal de bovinos saudáveis cultivados com condições otimizadas. Curiosamente, as condições bem-sucedidas e repetíveis para as monocamadas 2D derivadas de organoides são exclusivas do segmento do intestino (Tabela 1). Isso reforça a importância de ter técnicas de cultura otimizadas para o segmento intestinal de interesse. Um dia após a semeadura de organoides maduros dissociados em uma inserção de cultura de células, uma monocamada 2D pareceu se formar (Figura 2A). No entanto, apesar dessa aparência inicial, as medições de TEER para monocamadas ileais e retais permaneceram baixas nesta fase (Figura 1C). Além disso, um ensaio de permeabilidade paracelular revelou que a monocamada, após apenas 1 dia de cultura, permitiu a passagem de um traçador FITC-dextrano de 4 kDa através da camada celular (Figura 1C). No3º dia de cultivo, ambos os tipos de monocamadas 2D derivadas de organoides apresentaram maturação significativa, evidenciada pelo aumento dos valores de TEER e resistência ao traçador FITC-dextrano de 4 kDa, tendência que continuou até o 5º dia de cultivo. Particularmente notável é a variabilidade interespécies, onde, apesar dos valores mais baixos de TEER de culturas de monocamada 2D derivadas de organoides bovinos em relação às contrapartes humanas e caninas sob condições semelhantes 12,13,14,15, a integridade da membrana permanece intacta. Esta conclusão é tirada da resposta apropriada das monocamadas em ensaios de permeabilidade, sugerindo que baixos valores de TEER em amostras bovinas não refletem necessariamente a falta de função de barreira. Essa integridade é crucial para uma barreira epitelial funcional e é efetivamente demonstrada por meio da interpretação cuidadosa dos resultados do ensaio de permeabilidade juntamente com as medições TEER. Visualização da demarcação celular e microvilosidades bem desenvolvidas na superfície apical das monocamadas 2D com microscopia eletrônica de varredura, exibindo estruturas microanatômicas especializadas, reforçou ainda mais a maturação das monocamadas 2D derivadas de organoides ileais e retais (Figura 2B). Além disso, a coloração por imunofluorescência das monocamadas 2D confirmou a presença de borda em escova apical, junções de aderência basolateral e células caliciformes produtoras de muco em monocamadas 2D derivadas de organoides ileais (Figura 3A) e retais (Figura 3B). Esses resultados reforçam que a monocamada 2D desenvolvida é complexa em composição e formação, não apenas expressando características-chave de um epitélio intestinal intacto, mas sendo composta por uma população celular de várias linhagens. O desenvolvimento bem-sucedido da monocamada 2D depende da adesão das células à ECM e do crescimento à confluência para criar uma camada epitelial intacta. Notavelmente, uma distribuição desigual de ECM ou condições abaixo do ideal durante a incubação no inserto da cultura de células podem resultar no descolamento parcial da camada de células, particularmente perceptível ao longo de suas bordas ( Figura 4Ai ). Esse problema é ainda mais agravado se as células forem semeadas em densidade acima do ideal ou se as células de semeadura não forem distribuídas uniformemente pela superfície da cultura, um cenário geralmente decorrente da dissociação incompleta de organoides em uma única suspensão celular. Essa distribuição desigual pode levar à formação de lacunas dentro da monocamada e / ou morfogênese 3D em uma inserção de cultura de células ( Figura 4Aii ). Em contraste, a subssemeadura das células também pode resultar em desenvolvimento de monocamada malsucedido ou atrasado durante o período de cultura esperado, o que inadvertidamente afeta a eficiência de estudos subsequentes utilizando o sistema de monocamada 2D ( Figura 4Aiii ). Além disso, a contaminação do sistema de cultura também pode levar à formação de lacunas dentro da monocamada, interrompendo a monocamada confluente uma vez formada em um estágio posterior da cultura (Figura 4Aiv). Os valores sustentados de TEER e a resposta de permeabilidade paracelular podem ser afetados por distúrbios na camada celular devido a técnicas agressivas de lavagem ou manuseio, mesmo quando as causas potenciais de falha acima mencionadas não foram encontradas antes desses ensaios ( Figura 4B ). Assim, o manuseio cuidadoso das células e a avaliação da formação ou ruptura de monocamadas são fundamentais para o desenvolvimento bem-sucedido de monocamadas 2D derivadas de organoides por meio da aplicação eficaz de estratégias de solução de problemas. Figura 2: Caracterização microscópica das monocamadas 2D derivadas de organoides ileais e retais bovinos. (A) Imagens representativas de microscopia de contraste de fase de monocamadas 2D no dia 1 e no dia 3 (D1 e D3) da cultura em um inserto de cultura de células. Barra de escala = 100 μm. (B) Imagens representativas de microscopia eletrônica de varredura de monocamadas 2D com ampliações mais baixas (esquerda) e mais altas (direita). A estrutura detalhada da superfície celular, incluindo microvilosidades, pode ser apreciada em monocamadas ileais (superior) e retais (inferiores). Barra de escala esquerda = 10 μm, barra de escala direita = 2 μm. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura. Figura 3: Caracterização por imunofluorescência de monocamadas 2D derivadas de organoides ileais e retais. (A, B) O painel (A) mostra ileal e o painel (B) mostra organoides retais. À esquerda, as fibras de F-actina são destacadas com Faloidina (vermelho), ilustrando a arquitetura do citoesqueleto e a formação da borda em escova apical. A imagem do meio captura a localização basolateral das junções aderentes, marcadas por E-caderina (verde), indicativa de adesão célula-célula e integridade da monocamada. À direita, a presença de células caliciformes produtoras de mucina é identificada por SNA (verde), com uma imagem z-stack representando a secreção apical de mucina na monocamada ileal. Os núcleos em todas as imagens foram contracorados com DAPI (azul). Além disso, a imagem z-stack em todas as imagens demonstra ainda mais a formação de uma única camada de células dentro do inserto da cultura. Barra de escala = 25 μm. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura. Figura 4: Caracterização da formação de monocamada 2D abaixo do ideal. (A) Imagens representativas de contraste de fase demonstrando (i) o descolamento parcial da monocamada ao longo da borda do inserto de cultura de células; (ii) o desenvolvimento do crescimento 3D e a formação de lacunas dentro da monocamada; (iii) formação incompleta ou tardia de monocamada devido à densidade de semeadura inferior à ideal, observada como aderência irregular das células; e (iv) formação de lacunas dentro da monocamada 2D uma vez formada em estágio posterior, provavelmente resultante de suspeita de contaminação. Barras de escala = 100 μm. (B) O declínio das medições de TEER juntamente com o aumento dos perfis de permeabilidade após o dia 3 indica uma falha no estabelecimento de barreiras epiteliais estáveis e funcionais. Os resultados são apresentados como média ± erro padrão da média (EPM) de um único experimento com duas repetições técnicas. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura. Figura suplementar 1: Variações de densidade em culturas organoides intestinais bovinas em hidrogel à base de MEC. Organoides intestinais bovinos cultivados em hidrogel à base de MEC; (A) alta densidade e (B) baixa densidade. Barra de escala = 100 μm. Clique aqui para baixar este arquivo. Tabela Suplementar 1: Sinalizações resumidas do doador de tecido. Clique aqui para baixar este arquivo.

Discussion

A saúde do trato intestinal é fundamental tanto para a produtividade quanto para o bem-estar geral do gado16. Aproveitando a tecnologia de monocamada 2D derivada de organoide, os cientistas agora podem imitar com mais precisão a estrutura complexa do epitélio intestinal bovino em um ambiente in vitro 5. Essa abordagem inovadora não apenas reproduz a composição celular diversificada do revestimento intestinal, incluindo suas linhagens multicelulares, mas também captura as principais características funcionais, como secreção de muco e presença de microvilosidades, essenciais para a compreensão da fisiologia e patologia intestinal3. O desenvolvimento de protocolos de cultura personalizados para segmentos do íleo e do reto deu origem a uma plataforma avançada que aumenta significativamente a capacidade de estudar a saúde intestinal bovina. Essa abordagem sofisticada permite investigações detalhadas sobre as interações entre patógenos zoonóticos e o ambiente intestinal bovino. A capacidade de replicar e estudar de perto os aspectos únicos do ecossistema intestinal bovino in vitro é um passo significativo para o desenvolvimento de estratégias direcionadas para melhorar a saúde do gado e mitigar a propagação de doenças zoonóticas.

No entanto, para garantir o desenvolvimento bem-sucedido da monocamada 2D usando organoides intestinais bovinos, é fundamental manter a saúde e a vitalidade dos organoides e de suas células individuais dissociadas. O manuseio cuidadoso e a minimização do estresse são fundamentais para preservar a integridade e a funcionalidade das células, essenciais para o crescimento efetivo dos organoides e a subsequente criação de uma monocamada funcional. Além disso, a obtenção de uma monocamada uniforme depende da dissociação bem-sucedida de organoides em células únicas sem formar grandes aglomerados. Esses aglomerados podem interromper a distribuição celular e comprometer a estrutura da monocamada. Portanto, o emprego de técnicas precisas para uma dissociação suave é crucial, resultando em uma suspensão unicelular consistente. Além disso, minimizar os distúrbios durante a adesão celular e ao lavar o excesso de células não aderentes torna-se benéfico. Essa abordagem é particularmente importante para resolver possíveis problemas com a morfogênese 3D, melhorando assim a qualidade geral da monocamada.

Um desafio notável com hidrogéis à base de ECM de origem biológica é a variação de lote para lote na composição17. Embora isso não tenha sido observado usando os protocolos e materiais descritos, as variações de lote para lote na composição do ECM podem representar desafios para o desenvolvimento bem-sucedido da monocamada. Se a formação de monocamada for comprometida quando os produtos, marcas ou números de lote do ECM mudarem, as etapas de otimização podem ser necessárias para determinar a concentração apropriada do ECM necessária para revestir as inserções da cultura de células.

Além disso, ajustar o meio de cultura à temperatura ambiente antes de fazer qualquer alteração é uma etapa crítica que ajuda a mitigar o choque térmico, proteger a saúde celular e manter a qualidade das culturas organoides e monocamadas. Práticas de lavagem suaves também são fundamentais para manter a integridade da monocamada durante sua formação e ensaios subsequentes, e evitar interrupções pode evitar imprecisões nos resultados. A substituição do PBS pela Solução Salina Balanceada de Hank (HBSS) pareceu útil para minimizar o descolamento da monocamada quando se tornou um problema durante a lavagem repetida ou exposição prolongada ao PBS, como nos ensaios de permeabilidade paracelular. Finalmente, adaptar o meio de cultura para atender às necessidades específicas de células de diferentes segmentos do trato intestinal, como íleo e reto, é essencial para replicar com precisão as condições in vivo . Essa especificidade garante a saúde e a funcionalidade ideais das células, facilitando a modelagem precisa da fisiologia intestinal do gado e as interações com patógenos, destacando assim essas etapas críticas na pesquisa de organoides.

Além de empregar uma prática suave de manuseio de células, a construção de uma boa competência técnica associada à contagem de células e medições TEER é crucial para o desenvolvimento bem-sucedido de uma monocamada 2D funcional. Uma vez que as densidades de semeadura muito baixas e muito altas resultantes da contagem excessiva ou insuficiente das células, respectivamente, podem levar ao comprometimento do crescimento da monocamada. É recomendável revisar cuidadosamente as contagens de células e garantir a densidade de semeadura apropriada em ocasiões em que haja suspeita de densidades de semeadura imprecisas. Além disso, técnicas inadequadas de medição TEER podem resultar na ruptura da monocamada por arranhões inadvertidos com os eletrodos. A introdução cuidadosa dos eletrodos na câmara apical e a atenção especial à manutenção de sua orientação vertical em relação à superfície da membrana podem ajudar a mitigar o risco de danos acidentais às monocamadas.

Os métodos de ensaio de permeabilidade paracelular aqui descritos foram adaptados de um protocolo anterior18. Modificações no protocolo relatado, que incluem várias amostragens ao longo de 120 min e substituição da alíquota amostrada por quantidades iguais de PBS, são feitas para melhorar a precisão e a confiabilidade dos resultados. Manter o volume total dentro da câmara é fundamental por vários motivos: preserva o equilíbrio osmótico, garante a integridade celular, mantém o gradiente de concentração essencial para uma avaliação precisa da permeabilidade e evita alterações na pressão hidrostática que podem afetar as taxas de transporte. Essa prática de reabastecer a câmara basolateral com PBS fresco equivalente ao volume do PBS contendo traçador fluorescente amostrado é fundamental para preservar essas condições, permitindo avaliações precisas e significativas da permeabilidade da monocamada. O ensaio de permeabilidade paracelular serve como um complemento à medição TEER, avaliando o movimento de moléculas traçadoras através da monocamada diretamente. Além disso, a comparação dos valores de TEER em vários laboratórios pode não produzir informações relevantes, pois esses valores podem ser afetados por inúmeras variáveis, como temperatura e condições específicas sob as quais as células são cultivadas, incluindo tipos de células, números de passagem e composição do meio de cultura19. O ensaio de permeabilidade paracelular fornece uma avaliação funcional in vitro da expressão efetiva de aderentes e junções apertadas dentro de uma barreira epitelial20.

Embora o desenvolvimento de monocamadas 2D a partir de organoides 3D represente um avanço significativo na tecnologia de cultura, é importante reconhecer as limitações associadas às monocamadas 2D. Uma grande desvantagem é que este continua sendo um sistema de cultura estático, sem a estimulação dinâmica encontrada no ambiente in vivo . Além disso, modificar o conteúdo de oxigênio dentro do sistema de cultura apresenta desafios devido à sua configuração aberta envolvendo placas de cultura com tampas, tornando-o menos adequado para co-cultura de longo prazo com bactérias anaeróbicas. Essas limitações poderiam ser potencialmente abordadas com a adoção de plataformas de cultura mais dinâmicas, como sistemas microfluídicos21, que oferecem um ambiente mais controlado e fisiologicamente relevante. Além disso, é crucial reconhecer que, embora as condições atuais de cultivo sejam ricas em nutrientes benéficos para manter o crescimento das células-tronco, elas podem não ser ideais para induzir a diferenciação fisiológica das células epiteliais. Essa discrepância destaca a necessidade de otimização em pesquisas futuras para imitar de perto as condições in vivo e apoiar o processo de diferenciação. Ao abordar essas limitações e refinar essas abordagens, a utilidade e a aplicabilidade das tecnologias de cultura organoide são aprimoradas, aproximando-se da replicação da dinâmica complexa e das interações do trato gastrointestinal in vitro.

O protocolo para geração de monocamadas 2D a partir de tecidos ileais e retais bovinos oferece aos pesquisadores um valioso modelo in vitro da interface luminal do epitélio do intestino delgado e grosso. Este modelo abre vastas possibilidades de aplicação em estudos fundamentais de nutrição animal, particularmente no exame de como os nutrientes são absorvidos em várias condições. Uma área notável de interesse é a investigação da síndrome do intestino permeável, caracterizada por um aumento anormal da permeabilidade gastrointestinal, muitas vezes desencadeada por mudanças na dieta e temperaturas ambientais extremas22,23. Além disso, este modelo serve como uma ferramenta essencial para explorar as complexas interações entre o microbioma intestinal e seu hospedeiro. Permite o estudo de como os microrganismos comensais podem afetar a saúde do organismo hospedeiro, abordando um aspecto crucial da ciência veterinária e médica 1,24. Além disso, patógenos de origem alimentar humana são freqüentemente encontrados como comensais em diferentes segmentos do intestino de bovinos 8,9,25, este protocolo permite estudos detalhados das condições específicas que permitem que esses agentes zoonóticos prosperem em seus respectivos nichos.

Ao longo deste estudo, observou-se que as monocamadas derivadas de organoides retais e ileais requerem condições diferentes para o desenvolvimento bem-sucedido. Especificamente, quando monocamadas derivadas de organoides retais foram inicialmente semeadas em inserções de cultura de células preparadas com hidrogel à base de ECM a 2% em meio basal por 1 h, grandes orifícios e descamação celular foram observados. Esse problema foi resolvido mudando para um meio de cultura de monocamada retal especializado e estendendo o período de incubação para durante a noite antes da semeadura, enquanto as monocamadas derivadas de organoides ileais foram desenvolvidas com sucesso usando um protocolo de preparação mais curto. Além disso, a adição de CHIR99021 ao meio de cultura melhorou consistentemente o estabelecimento de monocamadas retais26 , mas não foi necessária para monocamadas ileais27. Além disso, as monocamadas ileais exigiram uma densidade celular mais alta para um desenvolvimento bem-sucedido em comparação com os organoides retais27. Essas condições otimizadas (Tabela 1) desenvolveram repetidamente monocamadas que mantêm a integridade da barreira resistente, ressaltando a importância de adaptar as condições de cultura ao segmento intestinal específico.

O acesso a um modelo que reflita com precisão a complexidade da linhagem multicelular do intestino in vivo é fundamental para essas investigações. Ele permite que os pesquisadores imitem de perto as condições naturais do ambiente intestinal, fornecendo uma base mais confiável para experimentos. Com este protocolo, os investigadores estão equipados com um modelo robusto que aprimora suas capacidades de pesquisa, potencialmente levando a descobertas inovadoras em seus campos de estudo. Essa abordagem não apenas contribui para a compreensão da saúde e das doenças intestinais, mas também auxilia no desenvolvimento de estratégias para melhorar o manejo do gado e a segurança alimentar.

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Este estudo foi apoiado em parte pelo Gabinete do Diretor dos Institutos Nacionais de Saúde (K01OD030515 e R21OD031903 para YMA) e WSU VCS Resident and Graduate Student Research Grant (para GDD). Os autores gostariam de agradecer ao matadouro participante pelo fornecimento de gado doador.

Materials

Basal Medium
Advanced DMEM/F12 (1X) Gibco 12634-010 n/a
GlutaMAX-I (100X) Gibco 35050-061 2 mM
HEPES (1M) Gibco 15630-080 10 mM
Pen Strep Glutamine (100X) Gibco 10378-016 1X
Organoid Culture Medium (Supplements to Basal Medium)
A-83-01 Sigma-Aldrich SML0788-5MG 500 nM
B27 Supplement (50X) Gibco 17504-001 1X
[Leu15]-Gastrin I human Sigma-Aldrich G9145-.5MG 10 nM
Murine EGF PeproTech 315-09-500UG 50 ng/mL
Murine Wnt-3a PeproTech 315-20-10UG 100 ng/mL
N-Acetyl-L-cysteine MP Biomedicals 194603 1 mM
N-2 MAX Media Supplement (100X) R&D Systems AR009 1X
Nicotinamide Sigma-Aldrich N0636-100G 10 mM
Noggin Conditioned Medium n/a n/a 10 vol/vol %
Primocin InvivoGen ant-pm-2 100 µg/mL
R-Spondin-1 Conditioned Medium n/a n/a 20 vol/vol %
SB202190 Sigma-Aldrich S7067-25MG 10 µM
Monolayer Culture Medium (Supplements to Organoid Culture Medium)
CHIR99021 Sigma-Aldrich SML1046-5MG 2.5 µM
HI FBS Gibco 10438-034 20 vol/vol %
LY2157299 Sigma-Aldrich SML2851-5MG 500 nM
Y-27632 StemCellTechnologies 72308 10 µM
Reagents
Alexa Fluor 488 Mouse anti-E-cadherin BD Biosciences 560061 1:200 dilution
Alexa Fluor 647 Phalloidin Invitrogen A22287 1:400 dilution
BSA Cytiva SH30574.02 2 w/vol %
Cell Recovery Solution Corning 354253 n/a
DAPI Solution (1 mg/mL) Thermo Scientific 62248 1:1000 dilution
DPBS (1X) Gibco 14190-144 n/a
Fluorescein Isothiocyanate–Dextran Sigma-Aldrich FD4-100MG 0.5 mg/mL
Matrigel Matrix Corning 354234 n/a
Paraformaldehyde Solution (4%) Thermo Scientific J19943K2 n/a
ProLong Gold antifade reagent Invitrogen P36930 n/a
SNA, EBL, Fluorescein Vector Laboratories FL-1301 1:100 dilution
Triton X-100 Thermo Scientific A16046.AE 0.3 vol/vol %
TrypLE Express Gibco 12605-028 n/a
Trypan Blue Solution, 0.4% VWR Life Science K940-100ML n/a
Materials and Equipment
0.4 µm Cell Culture Insert Falcon 353095
24-well Cell Culture Plate Corning 3524
48-well Cell Culture Plate Thermo Scientific 150687
70 µm Sterile Cell Strainer Fisher Scientific 22-363-548
96-well Cell Culture Plate Greiner Bio-One 655086
Centrifuge Eppendorf 5910Ri
CO2 Incubator Thermo Scientific 370
Epithelial Volt-Ohm Meter Millipore Millicell ERS-2
Hemocytometer LW Scientific CTL-HEMM-GLDR
Inverted Confocal Microscope Leica Microsystems SP8-X
Inverted Phase-Contrast Microscope Leica Microsystems DMi1
Microscope Cover Glass Fisher Scientific 12-540-B
Microplate Reader Molecular Devices SpecrtraMax i3x
Microscope Slides Fisher Scientific 22-034-486
Pasteur Pipets Fisher Scientific 13-678-20C
Scalpel Blade iMed Scientific – #11 carbon steel
Vortex Mixer Scientific Industries SI-0236
Software
LAS X imaging software Leica Microsystems LAS X 3.7.6.25997
Microplate Reader software Molecular Devces SoftMax Pro 7.1.2
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References

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Dykstra, G. D., Kawasaki, M., Ambrosini, Y. M. Advancements in Bovine Organoid Technology Using Small and Large Intestinal Monolayer Interfaces. J. Vis. Exp. (208), e67010, doi:10.3791/67010 (2024).
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