小腸および大腸単分子膜界面を用いたウシオルガノイド技術の進歩

腸内陰窩は、地元の食肉処理場で調達された余剰の腸内標本から調達され、ドナーの信号は 補足表1に記載されています。オルガノイドは、屠殺場で人道的に安楽死させた動物に由来する組織を用いて作製したものであり、この研究のためだけに動物を調達したわけではありません。したがって、この研究は IACUC レビューから免除され、倫理ステートメントは適用されません。 1. オルガノイド由来の2D単分子膜培養のための細胞培養インサートへのECMコーティング 注:すべての手順は、バイオセーフティキャビネット内の滅菌材料と無菌技術を使用して実行されます。すべての試薬は、特に明記されていない限り、手順全体を通して氷上に保管されます。 0.33 cm2 細胞培養インサート各100 μLをコーティングするために、基礎培地と2%(v/v)ECMベースのハイドロゲルをマイクロチューブ内で完全に混合して、ECMを調製します。 滅菌した鉗子でパッケージから個々の細胞培養インサートを取り出し、24ウェルの透明で平底の細胞培養プレートのウェルに個別に入れます。 ステップ1.1で調製したECMコーティング100μLを、ステップ1.2で調製した各細胞培養インサートのアピカルチャンバーに塗布します。 蓋を元に戻し、コーティングされた細胞培養インサートを含む細胞培養プレートを加湿インキュベーターで37°Cおよび5%CO2 で1時間インキュベートします。回腸オルガノイド細胞の場合、インサートは1時間のインキュベーション後にすぐに使用できます。直腸オルガノイド細胞の場合、1時間のインキュベーション後、ECMコーティングを直腸単層培養培地に交換し、一晩インキュベートします(表1)。TEER測定を実行する場合は、ブランクコントロール用の追加の細胞培養インサートを準備します。 回腸 直腸 ECMコーティングのインキュベーション時間 1時間 1 時間後に単層培養培地で一晩 サプリメントオルガノイド培地 CHIR99021 LY2157299 LY2157299 Y-27632 Y-27632 ウシ胎児血清 ウシ胎児血清 細胞播種密度(細胞/ウェル) 5×105 3×105 表1:成体ウシ回腸オルガノイドおよび直腸オルガノイドに由来する2D単分子膜を作成するための最適化されたプロトコルの要約。 2. ウシ回腸オルガノイドおよび/または直腸オルガノイド細胞の播種と2D単層培養 注:このセクションで説明するプロトコルは、記載されている技術5を使用して48ウェルプレート上で培養および維持されたウシ回腸および直腸オルガノイドを使用します。最適な結果を得るには、最初の樹立から3回以上経過し、直近の継代から3日以上経過して培養された、安定して維持されたオルガノイドを使用することが推奨されます。 成熟オルガノイドを含むECMベースのハイドロゲルドームを乱さずに、真空システムに取り付けられた使い捨てガラスパスツールピペットを使用してオルガノイド培養培地を取り出し、ウェルあたり300 μLの氷冷ECM解重合溶液を加えます。4°Cで少なくとも1時間インキュベートします。注:あるいは、ECM解重合溶液を添加した後、ECMベースのハイドロゲルドームを含むオルガノイドを機械的に破壊し、4°Cでインキュベートする前に15mLのコニカルチューブに懸濁液を回収します。 この方法は、2D単層培養に使用しないオルガノイドを同じプレート上で同時に培養する場合に推奨されます。オルガノイド培養の密度は、細胞培養インサートへの最適な播種に必要なオルガノイド培養ウェルの数に大きく影響します。高密度オルガノイド培養(補足図1A)の場合、直腸細胞培養インサートは1:1〜1:2の範囲の播種比を使用します。これは、1つの培養ウェルで1〜2ウェルの播種が可能であることを意味します。回腸の場合は、比率を1:1に保ちます。対照的に、低密度の培養(補足図1B)では、より多くの培養ウェルが必要です。1つの直腸細胞培養インサート(3-4:1の比率)には3-4の直腸オルガノイド培養ウェルを使用し、1つの回腸細胞培養インサート(4-5:1の比率)には4-5回の回腸オルガノイド培養ウェルを使用します。 ECMベースのハイドロゲルが完全に溶解するかどうかを目視検査し、オルガノイド懸濁液を15 mLのコニカルチューブに回収します。 オルガノイドを200 x g 、4°Cで5分間遠心分離し、上清を捨てます。ペレットを10 μM Y-27632を添加した組換え細胞解離酵素溶液1 mLに再懸濁します。 オルガノイド懸濁液を37°Cの水浴で10分間インキュベートし、3〜5秒を断続的に振とうし、2〜3分ごとに渦を巻き起こして、効果的なオルガノイドの解離を促進します。 酵素消化後、5 mLの基礎培地を加え、P1000マイクロピペットで積極的にピペットでピペット操作を行い、オルガノイドをさらに破壊して単一細胞にします。懸濁液にオルガノイドの塊がないか検査し、それでも視覚的に確認できる場合は、ピペッティングを繰り返して単一細胞の解離を促進します。 50 mLのコニカルチューブと70 μmのセルストレーナーを調製します。1〜2mLの基礎培地を塗布して、ストレーナーを事前に濡らします。 ストレーナを介して細胞懸濁液をろ過し、残留ECMベースのヒドロゲル破片や大きな細胞塊を除去します。元の15 mLチューブと70 μmセルストレーナーを、さらに10 mLの基礎培地ですすいでください。注:細胞懸濁液がストレーナを容易に通過しない場合は、オルガノイドの不完全な解離を示している可能性があります。回収した細胞懸濁液を同じ70 μmの細胞ストレーナに再通過させることを試みることができます。追加の酵素的または機械的な混乱が必要になる場合があります。. ペレット単細胞懸濁液を200 x g および4°Cで5分間遠心分離します。上清を除去し、細胞を適切な量の基礎培地で再懸濁して細胞数を計数します。 トリパンブルー染色後に血球計算盤で生細胞をカウントし、収集された細胞の総数を計算します。 ペレット単細胞懸濁液を200 x g および4°Cで5分間遠心分離します。上清を除去し、細胞をそれぞれの単層培養培地で適切な播種密度に再懸濁します(表1)。回腸オルガノイド細胞については、500 nM LY2157299、10 μM Y-27632、および20%ウシ胎児血清(FBS)を添加したオルガノイド培地である200 μLの回腸単層培養培地で、細胞培養インサートあたり5 x 105細胞/mLの播種密度を達成するために、細胞を2.5 x 106細胞/mLの濃度に再懸濁します。 直腸オルガノイド細胞の場合、100 nM CHIR99021、500 nM LY2157299、10 μM Y-27632を添加したオルガノイド培養培地である200 μLの直腸単層培養培地で、細胞培養インサートあたり3 x 105細胞/mLの播種密度を達成するために、細胞を1.5 x 106細胞/ mLの濃度に再懸濁します。 および20S。 ECMコーティングされた細胞培養インサートを備えた24ウェル細胞培養プレートを取り出し、コーティングを乱さないように慎重に真空吸引して細胞培養インサートの頂端チャンバーを空にします。 ステップ2.10で調製した200 μLのシングルセル懸濁液を、細胞培養インサートの頂端チャンバーに穏やかに適用します。ブランクコントロールには、アピカルチャンバーに細胞を含まない200 μLの培養培地を加えます。ブランクコントロールには、アピカルチャンバーに細胞を含まない200 μLの培養培地を加えます。 適切に補充した単層培地500μL(回腸細胞と直腸細胞によって異なります)を各ウェルの基底外側チャンバーに適用します。 加湿インキュベーターで37°C、5%CO2 のインキュベートを行い、細胞の接着と増殖を促進し、細胞培養インサート上にコンフルエントな2D単分子膜を形成します。 細胞播種から48時間後から、頂端室と基底外側室の両方で培養培地を隔日で交換します。ブランクコントロールと細胞含有インサートのインキュベーション時間を均等にします。 3. TEERの測定 注:ここで説明する方法では、一対のAg/AgCl電極を備えた上皮ボルトHM計として知られる市販の手動TEER測定システムを使用します(図1A)。2D単分子膜全体のTEERを測定するには、ブランクウェルの測定が必要です。ブランクの読み取り値がサンプルと同じ方法で取得されていることを確認してください。 オルガノイド由来の2D単分子膜とブランクの細胞培養インサートを含むプレートをインキュベーターから取り出します。プレートを室温に戻して約10分間待ちます。 電極を70%エタノールで消毒し、完全に乾燥させます。 短い方の端を頂端チャンバーに、長い方の端を基底外側チャンバーに含めて電極を慎重に導入します(図1A)。注:細胞単層を乱さないように、特に注意が必要です。 読み取り値を平衡化させ、値が安定したらオーム単位で記録します。注意: 電圧抵抗計の感度は、電気抵抗測定中にオーム値の変動が発生するようなものです。信頼性の高い読み取り値は、測定値が安定し、一貫してプラトー値付近で推移しているときに得られます。 次の式で2D単層のTEERを決定します。TEER(Ω x cm2)=細胞培養インサートの表面積(cm2)x正味の電気抵抗ここで、正味の電気抵抗は、セル単層インサートの測定された抵抗からブランクインサートの測定された抵抗を差し引いたものに等しくなります。24ウェルプレート用の細胞培養インサートの表面積は0.33 cm2です。 図1:ウシ腸管オルガノイド由来の2D単分子膜の上皮バリア完全性評価。 (A)TEER測定用の細胞培養インサートの頂端室および基底外側チャンバー内の電極の適切な配置の概略図。短い電極は頂端室に挿入され、長い電極はメンブレンとの接触を避けるために注意して基底外側のチャンバーに配置されます。(B)透過性アッセイプロセスの概略図。細胞培養チャンバーを温めたPBSで2回洗浄し、PBSに溶解した0.5 mg/mL 4 kDaのFITC-デキストラントレーサーをアピカルチャンバーに塗布します。ベースラテラルチャンバーから50μLのアリコートを繰り返し採取し、等量のPBSを置換してサンプリングし、インキュベーション期間中、ベースラテラルチャンバー内の総容量を維持します。アリコートの蛍光強度は、マイクロプレートリーダーを使用して測定され、細胞単層全体での4 kDaのFITC-デキストラントレーサーの拡散を定量化します。(C)回腸および直腸単層内のバリアインテグリティの経時的な動的発達は、TEER測定(回腸の閉じた円と直腸の閉じた正方形で表される)と透過性アッセイ(回腸の白丸と直腸の白四角で示される)を使用して評価されました4 kDa FITC-デキストラントレーサー。培養の3日目までに、両方のタイプの単層は、それぞれのTEERおよび透過性プロファイルによって証明されるように、安定で機能的な上皮バリアの確立を示しました。結果は、2つの技術的反復による少なくとも2つの独立した実験の平均です。エラーバーは、測定値のSEMを表します。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。 4. パラセルファーマル透過性アッセイ 注:このアッセイには、フルオレセインイソチオシアネート(FITC)-デキストランが頂端チャンバーから基底外側チャンバーに120分間にわたって2D単分子膜を横切って拡散することに起因する蛍光強度の測定が含まれます(図1B)。最適な結果を得るには、アッセイ中の光への曝露を最小限に抑え、蛍光の減少や消光を防ぐために、各サンプリングの直後にマイクロプレートリーダーで測定を行うことをお勧めします。各ウェルは一度しか使用できず、その後のアッセイで再利用することはできません。各アッセイのテクニカルレプリケートとして機能するように、少なくとも2つのウェルを準備します。例えば、 図 1C に示されている結果を得るには、合計 6 つのウェルが必要であり、アッセイは 3 つの異なる時点 (培養の 1、3、5 日目) で重複して実行されました。 リン酸緩衝生理食塩水(PBS)に4 kDa FITC-デキストランで標準曲線希釈シリーズを調製します。希釈するごとに、50 μLを96ウェルプレートに3回ピペットで移します。注:0〜0.5 mg / mLの範囲の一連の5〜7希釈液を作成することをお勧めします。 事前にキャリブレーションされたマイクロプレートリーダーで、励起波長495 nm、発光波長535 nmのスタンダードの蛍光強度を測定します。 蛍光強度の結果を使用して線形回帰を計算し、標準曲線を作成します。 オルガノイド由来の2D単分子膜を含む細胞培養インサートを含むプレートをインキュベーターから取り出します。評価対象のオルガノイド由来の2D単分子膜を含む細胞培養インサートの頂端および基底外側チャンバーから単層培養培地を取り出します。 各チャンバーを200μL(アピカルチャンバー)と500μL(基底外側チャンバー)の予熱済みPBSでそれぞれ2回穏やかに洗浄します。 アピカルチャンバーから洗浄液を取り出し、PBS中の0.5 mg/mL 4 kDaのFITC-デキストラントレーサー200 μLを細胞培養インサートのアピカルチャンバーにアプライします。 加湿インキュベーターで37°C、5%CO2 で20分間インキュベートします。 インキュベートした24ウェルプレートの基底外側チャンバーから50 μLをサンプル化し、マイクロプレートリーダー対応の96ウェルプレートに移します。 サンプリングしたウェルの基底外側チャンバー内の50 μLの新鮮なPBSを交換します。 すぐに、事前にキャリブレーションされたマイクロプレートリーダーで、励起波長495 nm、発光波長535 nmの蛍光強度測定を行います。 手順4.6〜4.10を20分ごとに120分ごとに繰り返します。アッセイの最後に、2D単分子膜の保存が必要な場合は、頂端チャンバーと基底外側チャンバーの両方を新鮮なPBS 2xですすぎ、新鮮な単層培養培地と交換してインキュベートします。注:2D単分子膜のさらなる評価、すなわちTEER測定、免疫蛍光染色などを行うことができます。ただし、残留蛍光トレーサーが存在する可能性が高く、分析に影響を与える可能性があるため、推奨されません。 見かけの透過係数 (Papp) を次の式で求めます。ΔQ / Δt = 特定の時間にわたって細胞培養インサートの基底外側チャンバーに単層を通過した蛍光トレーサーの濃度を、蛍光強度で測定し、標準曲線を介してμg/mLに外挿A = 細胞培養インサートの表面積Co = 細胞培養インサートの頂端チャンバーに添加した蛍光トレーサーの濃度(μg/mL) 5. オルガノイド由来の2D単分子膜の免疫蛍光染色 真空吸引で細胞培養インサートから単層培養培地を取り出し、200 μLの4%パラホルムアルデヒド(PFA)を加えます。細胞固定のために室温で15〜30分間インキュベートします。 真空吸引でPFAを除去し、100μLのPBS 2xで洗浄します。 PBS中の2%ウシ血清アルブミン(BSA)中の0.3% Triton X-100 100 μLで細胞を透過処理し、室温で10分間インキュベートします。 真空吸引で上澄みを取り除き、PBS 2×100μLで洗浄します。 上清を取り除き、PBS中の2% BSAと交換し、室温で1時間インキュベートしてブロッキングします。 上清を取り除き、2% BSAで希釈した一次抗体100 μLをPBSにアプライし、室温で1時間、または4°Cで一晩インキュベートします。注:使用した一次抗体の濃度は 、材料の表に記載されています。指定のない限り、メーカーの推奨事項に従います。 上清を取り除き、100 μLのPBS 3xで洗浄します。 2% BSAで希釈した二次抗体100 μLをPBS溶液に適用し、室温で1時間、または4°Cで一晩インキュベートします。注:使用する一次抗体が蛍光プローブと標識されている場合は、この手順を省略できます。使用した二次抗体の濃度は 、材料表に記載されています。指定のない限り、メーカーの推奨事項に従います。 上清を取り除き、100 μLのPBS 3xで洗浄します。 オプション:F-アクチンおよび核(DAPI)の対比染色では、PBSで両方のプローブを適切な希釈度(メーカーの推奨による)で混合して調製し、100 μLを適用し、室温で30分間インキュベートします。上清を取り除き、100 μLのPBS 3xで洗浄します。 細胞培養インサートメンブレンはメスブレードで慎重に切り出し、マウント溶液でスライドガラスにマウントします。カバースリップを敷いて観察します。