JoVE Journal > Medicine
Summary
Abstract
Introduction
Protocol
Results
Discussion
Disclosures
Acknowledgements
Materials
References
Nederlands

Automatically Generated
Please note that all translations are automatically generated. Click here for the English version.
Medicine

Vooruitgang in de organoïdetechnologie van runderen met behulp van monolaaginterfaces voor dunne en grote darmen

Published: June 14, 2024
doi:
10.3791/67010
, ,
1Department of Veterinary Microbiology and Pathology, College of Veterinary Medicine,Washington State University, 2Department of Veterinary Clinical Sciences, College of Veterinary Medicine,Washington State University

Summary

Deze studie presenteert een protocol voor het genereren van 2D-monolagen in de darm van runderen uit organoïden, en biedt verbeterde toegang voor het bestuderen van interacties tussen gastheer en ziekteverwekker. Het bevat methoden voor het beoordelen van de integriteit en functionaliteit van het membraan, het bevorderen van in vitro modellen die de gastro-intestinale fysiologie van runderen nabootsen. Deze aanpak belooft aanzienlijke biomedische en agrarische voordelen, waaronder verbeterde behandelingsstrategieën.

Abstract

De vooruitgang van de kennis van de gastro-intestinale fysiologie en haar ziekten hangt in kritische mate af van de ontwikkeling van nauwkeurige, soortspecifieke in vitro-modellen die in vivo darmweefsels getrouw nabootsen. Dit is met name van vitaal belang voor het onderzoeken van gastheer-pathogeen interacties bij runderen, die belangrijke reservoirs zijn voor pathogenen die ernstige risico’s voor de volksgezondheid met zich meebrengen. Traditionele 3D-organoïden bieden beperkte toegang tot het apicale oppervlak van het darmepitheel, een hindernis die wordt overwonnen door de komst van 2D-monolaagculturen. Deze culturen, afgeleid van organoïde cellen, bieden een blootgesteld luminaal oppervlak voor meer toegankelijk onderzoek. In dit onderzoek wordt een gedetailleerd protocol geïntroduceerd voor het maken en onderhouden van 2D-monolaagculturen uit cellen van runderorganoïden in de dunne en grote darm. Deze methode omvat protocollen voor het beoordelen van membraanintegriteit door middel van transepitheliale elektrische weerstand en paracellulaire permeabiliteit, naast immunocytochemische kleuringstechnieken. Deze protocollen leggen de basis voor het opzetten en karakteriseren van een 2D-monolaagkweeksysteem voor runderen, waarbij de grenzen van deze methodetoepassingen worden verlegd in biomedisch en translationeel onderzoek dat van belang is voor de volksgezondheid. Het gebruik van deze innovatieve benadering maakt de ontwikkeling mogelijk van fysiologisch relevante in vitro modellen voor het onderzoeken van zowel normale als zieke toestanden van de darmfysiologie van runderen. De implicaties voor de biomedische en agrarische vooruitgang zijn ingrijpend en maken de weg vrij voor effectievere behandelingen voor darmaandoeningen bij runderen, waardoor zowel het dierenwelzijn als de voedselveiligheid worden verbeterd.

Introduction

De cultuur van intestinale epitheliale stamcellen in driedimensionale (3D) culturen, bekend als darmorganoïden, markeert een aanzienlijke vooruitgang in de in-vitrotechnologie voor het onderzoeken van darmfuncties, voeding en interacties met ziekteverwekkers 1,2. Deze organoïden bootsen de complexe structuur van het in vivo darmepitheel na door zichzelf te repliceren en te organiseren in 3D-formaties die verschillende darmcellijnen omvatten3. Deze functie benadrukt hun aanzienlijke potentieel om het begrip van de darmbiologie vooruit te helpen.

De toenemende belangstelling voor het toepassen van darmorganoïdetechnologie op landbouwhuisdieren maakt verfijning van kweek- en onderhoudstechnieken noodzakelijk 4,5. De relevantie van deze technologie wordt onderstreept door de potentiële impact ervan op het bestuderen van de darmgezondheid van landbouwhuisdieren, die een cruciale rol speelt in hun productiviteit en bijgevolg in de economie van de voedsel-dierindustrie door het dierenwelzijn en de operationele kosten te beïnvloeden 6,7. In het bijzonder is het gebruik van intestinale organoïde culturen om de darmfunctie van runderen te onderzoeken van het grootste belang, gezien hun rol als reservoirs voor zoönotische darmpathogenen, zoals Salmonella spp. en Escherichia coli (E. coli) O157:H78. Deze ziekteverwekkers zijn gelokaliseerd in bepaalde segmenten van de darm, waardoor het essentieel is om darmorganoïde-kweekmethoden te differentiëren per darmsegment om de precisie in onderzoeken te verbeteren9.

Een belangrijk obstakel bij de studie van darmorganoïden is de beperkte toegang tot het apicale oppervlak van de epitheelcel10. Wanneer gekweekt in een extracellulaire matrix (ECM), oriënteren de cellen zich van nature zo dat het basale oppervlak naar buiten wijst en het apicale oppervlak naar binnen is gericht10. Om deze uitdaging aan te gaan, worden methoden gepresenteerd waarbij 3D-organoïden worden gedissocieerd in afzonderlijke cellen en deze worden gezaaid in semi-permeabele celcultuurinserts. Deze opstelling brengt een interface tot stand tussen het apicale oppervlak en een basolateraal compartiment. Dit protocol toont aan dat cellen afkomstig van darmorganoïden van runderen een coherente 2D-monolaag kunnen vormen, zoals blijkt uit metingen van transepitheliale elektrische weerstand (TEER) en paracellulaire permeabiliteitstests. Bovendien wordt de ontwikkeling van cellulaire polariteit met borstelranden en tight junctions in de organoïde-afgeleide 2D-monolaagcellen bevestigd door immunofluorescentie en elektronenmicroscopie, die de eigenschappen van het in vivo darmepitheel weerspiegelen.

In deze studie vertegenwoordigt het ileum het dunne darmkanaal en het rectum het grote darmkanaal. Deze selecties zijn gebaseerd op relevante darmpathogenen zoals Salmonella spp., die het ileum11 kan verplaatsen, en E. coli O157:H7 waarvan bekend is dat het voornamelijk het rectum9 bij runderen koloniseert. De selectie van deze specifieke darmsegmenten benadrukt de noodzaak om darmorganoïdekweekmethoden af te stemmen op het darmgebied voor precisie in onderzoek. Deze methoden beschrijven de procedure voor het effectief kweken van een organoïde-afgeleide 2D-monolaaginterface van deze darmsegmenten, en bieden een robuust model voor het onderzoeken van de darmgezondheid van runderen, pathogene infecties en interacties tussen het darmmicrobioom en de gastheer.

Protocol

Darmcrypten werden verkregen uit overtollige darmmonsters afkomstig van een plaatselijk slachthuis, en de signalering van donoren wordt gegeven in aanvullende tabel 1. Organoïden werden gegenereerd met behulp van weefsels afkomstig van dieren die op humane wijze werden geëuthanaseerd in een slachthuis, en dieren werden niet alleen voor dit onderzoek aangeschaft; daarom is deze studie vrijgesteld van IACUC-beoordeling en is een ethische verklaring niet van toepassing. 1. ECM-coating op celcultuurinzetstukken voor organoïde-afgeleide 2D-monolaagcultuur OPMERKING: Alle procedures worden uitgevoerd met behulp van gesteriliseerde materialen en aseptische technieken in een bioveiligheidskast. Alle reagentia worden gedurende de hele procedure op het ijs bewaard, tenzij anders vermeld. Bereid 100 μL ECM voor op het coaten van elke 0,33 cm2-cels kweekinzet door basaal medium grondig te mengen met 2% (v/v) hydrogel op ECM-basis in een microbuisje. Haal het individuele celcultuurinzetstuk met een gesteriliseerde tang uit de verpakking en plaats het afzonderlijk in de putjes van een doorzichtige celkweekplaat met 24 putjes en platte bodem. Breng 100 μl ECM-coating aan die in stap 1.1 is voorbereid op de apicale kamer van elk celcultuurinzetstuk dat in stap 1.2 is voorbereid. Plaats het deksel terug en incubeer de celkweekplaat met gecoate celcultuurinzetstuk(ken) in een bevochtigde incubator bij 37 °C en 5% CO2 gedurende 1 uur.Voor ileale organoïde cellen is de insert na 1 uur incubatie klaar voor gebruik. Voor rectale organoïde cellen vervangt u na 1 uur incubatie de ECM-coating door rectaal monolaags kweekmedium en incubeert u ‘s nachts (tabel 1). Bereid extra celcultuurinzetstukken voor voor blanco-controles als deze bedoeld zijn om TEER-metingen uit te voeren. Kronkeldarm Endeldarm Incubatietijd van ECM-coating 1 uur 1 uur gevolgd door’s nachts in monolayer kweekmedia Aanvullingen oporganoïde kweek medium CHIR99021 LY2157299 LY2157299 Y-27632 Y-27632 Foetaal runderserum Foetaal runderserum Dichtheid van celzaaien (cellen/put) 5 x 105 3 x 105 Tabel 1: Samenvatting van het geoptimaliseerde protocol voor het maken van 2D-monolagen afgeleid van volwassen runderileale en rectale organoïden. 2. Zaaien van runderileum- en/of rectale organoïdecellen en 2D-monolaagcultuur OPMERKING: Het protocol dat in dit hoofdstuk wordt beschreven, maakt gebruik van runder-, ileale en rectale organoïden, die zijn gekweekt en onderhouden op platen met 48 putjes met behulp van de beschreven technieken5. Voor een optimaal resultaat wordt geadviseerd om stabiel onderhouden organoïden te gebruiken die meer dan 3x na de eerste vestiging zijn gepassageerd en langer dan 3 dagen na de meest recente passage zijn gekweekt. Zonder de op ECM gebaseerde hydrogelkoepel met rijpe organoïden te verstoren, verwijdert u de organoïde kweekmedia met behulp van een glazen wegwerppasteurpipet die aan een vacuümsysteem is bevestigd en voegt u 300 μL ijskoude ECM-depolymerisatieoplossing per putje toe. Incubeer gedurende ten minste 1 uur bij 4 °C.OPMERKING: U kunt ook de organoïde-bevattende hydrogelkoepel op basis van ECM mechanisch verstoren na toevoeging van ECM-depolymerisatieoplossing en suspensie opvangen in een conische buis van 15 ml voordat deze bij 4 °C wordt geïncubeerd. Deze methode wordt aanbevolen wanneer organoïden die niet bedoeld zijn om te worden gebruikt voor 2D-monolaagcultuur tegelijkertijd op dezelfde plaat worden gekweekt. De dichtheid van organoïde culturen heeft een aanzienlijke invloed op het aantal benodigde organoïde kweekputjes voor een optimale zaaiing naar celcultuurinserts.Voor organoïdeculturen met een hoge dichtheid (aanvullende figuur 1A) gebruiken rectale celcultuurinserts een zaaiverhouding in het bereik van 1:1 tot 1:2, wat betekent dat één kweekput één tot twee putjes kan zaaien. Voor ileum houdt u de verhouding op 1:1. Daarentegen hebben culturen met een lagere dichtheid (aanvullende figuur 1B) meer kweekputten nodig; Gebruik 3-4 rectale organoïde kweekputjes voor één rectale celcultuurinzet (verhouding 3-4:1) en 4-5 ileale organoïdekweekputjes voor één ileumcelcultuurinzetstuk (verhouding 4-5:1). Inspecteer visueel of hydrogel op basis van ECM volledig is opgelost en verzamel organoïdessuspensie in een conische buis van 15 ml. Pellet organoïden door centrifugatie bij 200 x g en 4 °C gedurende 5 min. Gooi het supernatant weg. Resuspendeer de pellet in 1 ml recombinante celdissociatie-enzymoplossing aangevuld met 10 μM Y-27632. Incubeer organoïde suspensie in een waterbad van 37 °C gedurende 10 minuten met intermitterend schudden van 3-5 s met een vortex om de 2-3 minuten om effectieve organoïde dissociatie te vergemakkelijken. Voeg na enzymatische vertering 5 ml basaal medium toe en pipetteer agressief met een P1000-micropipet om de organoïden naar afzonderlijke cellen verder te verstoren. Inspecteer de suspensie op organoïde klonten en, als het nog steeds visueel waarneembaar is, herhaal dan het pipetteren om de dissociatie van eencellige cellen te verbeteren. Bereid een conische buis van 50 ml voor met een celzeef van 70 μm. Maak de zeef nat door 1-2 ml basaal medium aan te brengen. Filtreer de celsuspensie door de zeef om achtergebleven hydrogelresten op basis van ECM en grote celklonten te verwijderen. Spoel de originele tube van 15 ml en de celzeef van 70 μm af met een extra 10 ml basaal medium.OPMERKING: Als de celsuspensie niet gemakkelijk door een zeef gaat, kan dit een indicatie zijn van onvolledige organoïde dissociatie. Er kan worden geprobeerd de verzamelde celsuspensie door dezelfde celzeef van 70 μm te leiden. Aanvullende enzymatische of mechanische verstoring kan nodig zijn. Pellet eencellige suspensie door centrifugeren bij 200 x g en 4 °C gedurende 5 min. Verwijder het supernatans en resuspendeer de cellen met een geschikt volume basaal medium om het celgetal uit te voeren. Tel levensvatbare cellen met een hemocytometer na trypanblauwe kleuring om het totale aantal verzamelde cellen te berekenen. Pellet eencellige suspensie door centrifugeren bij 200 x g en 4 °C gedurende 5 min. Verwijder het supernatans en resuspendeer de cellen tot de juiste zaaidichtheid in het respectieve monolaagse kweekmedium (tabel 1).Resuspendeer voor ileale organoïde cellen tot een concentratie van 2,5 x 106 cellen/ml om een zaaidichtheid van 5 x 105 cellen per celcultuurinsert te bereiken in 200 μL ileale monolaagkweekmedium, dat is het organoïde kweekmedium aangevuld met 500 nM LY2157299, 10 μM Y-27632 en 20% foetaal runderserum (FBS). Resuspendeer voor rectale organoïde cellen tot een concentratie van 1,5 x 106 cellen/ml om een zaaidichtheid van 3 x 105 cellen per celcultuurinsert te bereiken in 200 μl rectaal monolaagcultuurmedium, dat is het organoïde kweekmedium aangevuld met 100 nM CHIR99021, 500 nM LY2157299, 10 μM Y-27632, en 20% FBS. Pak de 24-wells celkweekplaat met ECM-gecoate celcultuurinzetstuk(ken) en leeg de apicale kamer van het celcultuurinzetstuk met zorgvuldige vacuümzuiging om de coating niet te verstoren. Breng 200 μl eencellige suspensie die in stap 2.10 is bereid voorzichtig aan op de apicale kamer van het celcultuurinzetstuk. Voeg voor de blanco-controle 200 μL kweekmedia zonder cellen toe in de apicale kamer. Voeg voor de blanco-controle 200 μL kweekmedia zonder cellen toe in de apicale kamer. Breng 500 μL van op de juiste manier aangevuld monolaags kweekmedium (afhankelijk van ileale versus rectale cellen) aan op de basolaterale kamer van elk putje. Incubeer in een bevochtigde incubator bij 37 °C en 5% CO2 om de celhechting en -groei te vergemakkelijken en zo een confluente 2D-monolaag op het celcultuurinzetstuk te vormen. Vervang de kweekmedia in zowel de apicale als de basolaterale kamers om de dag vanaf 48 uur na het zaaien van de cellen. Zorg voor een gelijke incubatietijd voor de blanco-controle en de celbevattende inzet. 3. TEER-meting OPMERKING: De hier beschreven methode maakt gebruik van een in de handel verkrijgbaar handmatig TEER-meetsysteem dat bekend staat als een epitheliale voltohmmeter met een paar Ag/AgCl-elektroden (Figuur 1A). Bepaling van TEER over een 2D-monolaag vereist de meting van lege putten. Zorg ervoor dat de blanco-meting op dezelfde manier wordt uitgevoerd als het monster. Haal de plaat met celcultuurinzetstukken met van organoïden afgeleide 2D-monolaag(en) en blanco uit de incubator. Laat de plaat ongeveer 10 minuten op kamertemperatuur komen. Desinfecteer de elektroden met 70% ethanol en laat ze volledig drogen. Breng de elektroden voorzichtig met het korte uiteinde in de apicale kamer en het lange uiteinde in de basolaterale kamer (Figuur 1A).OPMERKING: Extra voorzichtigheid is geboden om de monolaag van de cel niet te verstoren. Laat de meting in evenwicht zijn en noteer de waarde in ohm wanneer deze stabiliseert.OPMERKING: De gevoeligheid van de voltohmmeter is zodanig dat er fluctuaties van de ohm-waarde zullen optreden tijdens het uitvoeren van de elektrische weerstandsmeting. Een betrouwbare meting wordt verkregen wanneer de metingen stabiliseren en consequent rond een plateauwaarde zweven. Bepaal de TEER van de 2D monolaag met de volgende formule:TEER (Ω x cm2) = oppervlakte van de celcultuurinzetstukken (cm2) x Netto elektrische weerstandWaarbij de netto elektrische weerstand gelijk is aan de gemeten weerstand van de monolaaginzet van de cel minus de gemeten weerstand van de blanco inzet. Celcultuurinzetstukken voor platen met 24 putjes hebben een oppervlakte van 0,33cm2. Figuur 1: Evaluatie van de integriteit van de epitheliale barrière van runder-darmorganoïde-afgeleide 2D-monolaag. (A) Schema van de juiste positionering van elektroden in de apicale en basolaterale kamers van een celcultuurinzetstuk voor TEER-metingen. De korte elektrode wordt in de apicale kamer ingebracht en de lange elektrode wordt voorzichtig in de basolaterale kamer geplaatst om contact met het membraan te vermijden. (B) Schema van het permeabiliteitsbepalingsproces. Celkweekkamers worden 2x gewassen met verwarmd PBS en 0,5 mg/ml 4 kDa FITC-dextraan-tracer opgelost in PBS wordt op de apicale kamer aangebracht. Herhaalde aliquots van 50 μl uit de basolaterale kamer worden bemonsterd met vervanging van een gelijk volume PBS om het totale volume in de basolaterale kamer gedurende de incubatieperiode te behouden. De fluorescentie-intensiteit van het aliquot wordt gemeten met behulp van een microplaatlezer om de diffusie van 4 kDa FITC-dextran-tracer over de celmonolaag te kwantificeren. (C) De dynamische ontwikkeling van de barrière-integriteit binnen ileale en rectale monolagen in de loop van de tijd werd geëvalueerd met behulp van TEER-metingen (weergegeven door gesloten cirkels voor het ileum en gesloten vierkanten voor het rectum) en permeabiliteitstesten (aangeduid door open cirkels voor het ileum en open vierkanten voor het rectum) met een 4 kDa FITC-dextran tracer. Op dag 3 van de kweek vertoonden beide soorten monolagen de vorming van stabiele en functionele epitheliale barrières, zoals blijkt uit hun respectieve TEER- en permeabiliteitsprofielen. De resultaten zijn het gemiddelde van ten minste twee onafhankelijke experimenten met twee technische replicaten. Foutbalken geven de SEM van de metingen weer. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken. 4. Analyse van de paracellulaire permeabiliteit OPMERKING: Deze test omvat de bepaling van de fluorescentie-intensiteit als gevolg van diffusie van fluoresceïne-isothiocyanaat (FITC)-dextran van de apicale kamer naar de basolaterale kamer over 2D-monolagen gedurende 120 minuten (Figuur 1B). Voor optimale resultaten wordt geadviseerd om de blootstelling aan licht tijdens de test tot een minimum te beperken en onmiddellijk na elke bemonstering metingen uit te voeren in een microplaatlezer om afname of doven van de fluorescentie te voorkomen. Elk putje kan slechts één keer worden gebruikt en kan niet opnieuw worden gebruikt in volgende tests. Bereid ten minste 2 putjes voor om als technische replicaten voor elke test te dienen. Er zijn bijvoorbeeld in totaal 6 putjes nodig om de resultaten te verkrijgen die worden gepresenteerd in figuur 1C, waarbij de tests in tweevoud werden uitgevoerd op 3 verschillende tijdstippen (dag 1, 3 en 5 van de kweek). Bereid standaard curve-verdunningsreeksen met 4 kDa FITC-dextran in fosfaatgebufferde zoutoplossing (PBS). Pipetteer voor elke verdunning 50 μl in drievoud op een plaat met 96 putjes.OPMERKING: Het wordt aanbevolen om een reeks van 5-7 verdunningen te maken, variërend van 0 tot 0,5 mg/ml. Bepaal de fluorescentie-intensiteit van de standaarden in een vooraf gekalibreerde microplaatlezer bij een excitatiegolflengte van 495 nm en een emissiegolflengte van 535 nm. Bereken de lineaire regressie met de resultaten van de fluorescentie-intensiteit om een standaardcurve te maken. Haal de plaat met celcultuurinzetstukken met van organoïden afgeleide 2D-monolaag(en) uit de incubator. Verwijder de monolaagse kweekmedia uit de apicale en basolaterale kamer van het celcultuurinzetstuk dat de van organoïden afgeleide 2D-monolaag bevat die moet worden beoordeeld. Was elke kamer 2x voorzichtig met respectievelijk 200 μL (apicale kamer) en 500 μL (basolaterale kamer) voorverwarmde PBS. Verwijder de wasoplossing uit de apicale kamer en breng 200 μl van 0,5 mg/ml 4 kDa FITC-dextran-tracer in PBS aan op de apicale kamer van het celcultuurinzetstuk. Incubeer in een bevochtigde incubator bij 37 °C en 5% CO2 gedurende 20 min. Bemonster 50 μl uit de basolaterale kamer van de geïncubeerde plaat met 24 putjes en breng deze over naar een plaat met 96 putjes die compatibel is met een microplaatlezer. Vervang 50 μL verse PBS in de basolaterale kamer van het bemonsterde putje. Voer onmiddellijk een fluorescentie-intensiteitsmeting uit in een vooraf gekalibreerde microplaatlezer bij een excitatiegolflengte van 495 nm en een emissiegolflengte van 535 nm. Herhaal stap 4.6-4.10 elke 20 min tot 120 min. Aan het einde van de test, als behoud van de 2D-monolaag gewenst is, spoelt u zowel de apicale als de basolaterale kamer met verse PBS 2x, vervangt u deze door vers monolaag-kweekmedium en incubeert.OPMERKING: Verdere evaluatie van 2D-monolagen kan worden uitgevoerd, d.w.z. TEER-metingen, immunofluorescentiekleuring, enz.; Het wordt echter niet aanbevolen, omdat resterende fluorescerende tracer waarschijnlijk is en de analyse kan beïnvloeden. Bepaal de schijnbare permeabiliteitscoëfficiënt (P-app) met de volgende formule:ΔQ / Δt = concentratie van fluorescerende tracer die de monolaag gedurende de specifieke tijdsduur naar de basolaterale kamer van het celcultuurinzetstuk heeft geleid, gemeten aan de hand van de fluorescentie-intensiteit en geëxtrapoleerd naar μg/ml via de standaardcurveA = oppervlakte van de inzetstukken van de celcultuurCo = concentratie van fluorescerende tracer toegevoegd aan de apicale kamer van het celcultuurinzetstuk in μg/ml 5. Immunofluorescentiekleuring van organoïde-afgeleide 2D-monolaag Verwijder de monolaagse kweekmedia van het celcultuurinzetstuk met vacuümzuiging en voeg 200 μL 4% paraformaldehyde (PFA) toe. Incubeer bij kamertemperatuur gedurende 15-30 minuten voor celfixatie. PFA verwijderen met vacuümzuiging en wassen met 100 μL PBS 2x. Permeabiliseer cellen met 100 μL 0,3% Triton X-100 in 2% runderserumalbumine (BSA) in PBS door 10 minuten bij kamertemperatuur te incuberen. Bovendrijvend middel verwijderen met vacuümzuiging en wassen met 100 μL PBS 2x. Verwijder het supernatans en vervang het door 2% BSA in PBS en incubeer bij kamertemperatuur gedurende 1 uur om te blokkeren. Verwijder het antilichaam, breng 100 μl primair antilichaam verdund in 2% BSA aan in PBS en incubeer bij kamertemperatuur gedurende 1 uur of een nacht bij 4 °C.OPMERKING: Concentraties van primaire antilichamen die worden gebruikt, staan in de Tabel met materialen. Tenzij anders vermeld, worden de aanbevelingen van de fabrikant opgevolgd. Verwijder het supernatans en was met 3x 100 μL PBS. Breng 100 μL secundair antilichaam verdund in 2% BSA aan in PBS en incubeer bij kamertemperatuur gedurende 1 uur, of een nacht bij 4 °C.OPMERKING: Deze stap kan worden overgeslagen als het gebruikte primaire antilichaam wordt geconjugeerd met een fluorescentiesonde. De gebruikte concentraties van secundaire antilichamen staan in de tabel met materialen. Tenzij anders vermeld, worden de aanbevelingen van de fabrikant opgevolgd. Verwijder het supernatans en was met 3x 100 μL PBS. Optioneel: Voor tegenkleuring van F-actine en kernen (DAPI), bereid u voor door beide sondes te mengen met de juiste verdunning (volgens de aanbeveling van de fabrikant) in PBS, breng 100 μL aan en incubeer gedurende 30 minuten bij kamertemperatuur. Verwijder het supernatans en was met 3x 100 μL PBS. Snijd het insteekmembraan van de celcultuur voorzichtig uit met een scalpelmesje en monteer het op een glasplaatje met een montageoplossing. Plaats een afdekglaasje en observeer.

Representative Results

Dit protocol genereert op betrouwbare wijze robuuste boviene darmorganoïde-afgeleide 2D-monolagen uit het dunne en grote darmkanaal, waarbij de complexiteit van het in vivo darmepitheel wordt nagebootst. Deze methode maakt gebruik van volwassen organoïden die zijn ontwikkeld uit intestinale crypte-monsters van gezond vee die onder geoptimaliseerde omstandigheden zijn gekweekt. Interessant is dat de succesvolle en herhaalbare omstandigheden voor de organoïde-afgeleide 2D-monolagen uniek zijn voor het segment van de darm (Tabel 1). Dit versterkt het belang van geoptimaliseerde kweektechnieken voor het darmsegment van interesse. 1 dag na het zaaien van gedissocieerde rijpe organoïden op een celcultuurinsert, leek zich een 2D-monolaag te vormen (Figuur 2A). Ondanks dit eerste uiterlijk bleven de TEER-metingen voor zowel ileale als rectale monolagen in dit stadium echter laag (Figuur 1C). Bovendien bleek uit een paracellulaire permeabiliteitstest dat de monolaag, na slechts 1 dag kweken, de doorgang van een 4 kDa FITC-dextraan-tracer over de cellaag mogelijk maakte (Figuur 1C). Tegen de 3edag van de kweek vertoonden beide soorten organoïde-afgeleide 2D-monolagen een significante rijping, wat blijkt uit verhoogde TEER-waarden en resistentie tegen de 4 kDa FITC-dextran-tracer, een trend die zich voortzette tot dag 5 van de kweek. Bijzonder opmerkelijk is de variabiliteit tussen soorten, waarbij ondanks lagere TEER-waarden van van runderorganoïden afgeleide 2D-monolaagculturen ten opzichte van menselijke en hondentegenhangers onder vergelijkbare omstandigheden 12,13,14,15, de integriteit van het membraan intact blijft. Deze conclusie wordt getrokken uit de passende respons van de monolagen in permeabiliteitstests, wat suggereert dat lage TEER-waarden in rundermonsters niet noodzakelijkerwijs een gebrek aan barrièrefunctie weerspiegelen. Deze integriteit is cruciaal voor een functionele epitheliale barrière en wordt effectief aangetoond door de zorgvuldige interpretatie van permeabiliteitstestresultaten naast TEER-metingen. Visualisatie van cellulaire afbakening en goed ontwikkelde microvilli op het apicale oppervlak van de 2D-monolagen met scanning-elektronenmicroscopie, waarbij gespecialiseerde micro-anatomische structuren worden weergegeven, verder versterkte maturatie van zowel ileale als rectale organoïde-afgeleide 2D-monolagen (Figuur 2B). Bovendien bevestigde immunofluorescentiekleuring van de 2D-monolagen de aanwezigheid van apicale borstelrand, basolaterale adherence-juncties en slijmproducerende bekercellen in zowel ileale (Figuur 3A) als rectale (Figuur 3B) organoïde-afgeleide 2D-monolagen. Deze resultaten versterken dat de ontwikkelde 2D-monolaag complex is in samenstelling en vorming, niet alleen de belangrijkste kenmerken van een intact darmepitheel tot expressie brengt, maar ook bestaat uit een cellulaire populatie met meerdere afstammingslijnen. Succesvolle ontwikkeling van 2D-monolagen is afhankelijk van de hechting van cellen aan ECM en groei aan samenvloeiing om een intacte epitheellaag te creëren. Met name een ongelijke ECM-verdeling of suboptimale omstandigheden tijdens de incubatie op het celcultuurinzetstuk kunnen leiden tot gedeeltelijke loslating van de cellaag, vooral merkbaar langs de randen (Figuur 4Ai). Dit probleem wordt nog verergerd als de cellen met een hogere dichtheid dan optimaal worden gezaaid of als de zaaicellen niet gelijkmatig over het kweekoppervlak zijn verdeeld, een scenario dat vaak voortkomt uit de onvolledige dissociatie van organoïden in een enkele celsuspensie. Een dergelijke ongelijke verdeling kan leiden tot de vorming van openingen in de monolaag en/of 3D-morfogenese op een celcultuurinzetstuk (Figuur 4Aii). Daarentegen kan onderzaaiing van de cellen ook leiden tot een mislukte of vertraagde ontwikkeling van monolagen gedurende de verwachte kweekperiode, wat onbedoeld van invloed is op de efficiëntie van latere studies waarbij gebruik wordt gemaakt van het 2D-monolaagsysteem (Figuur 4Aiii). Bovendien kan contaminatie van het kweeksysteem ook leiden tot de vorming van openingen in de monolaag, waardoor de eenmaal gevormde confluente monolaag in een later stadium van de cultuur wordt verstoord (Figuur 4Aiv). Aanhoudende TEER-waarden en paracellulaire permeabiliteitsrespons kunnen worden beïnvloed door verstoringen in de cellaag door agressieve was- of hanteringstechnieken, zelfs wanneer de bovengenoemde mogelijke oorzaken van falen niet waren aangetroffen vóór deze tests (Figuur 4B). Zorgvuldige celbehandeling en evaluatie van de vorming of verstoringen van monolagen zijn dus van het grootste belang voor de succesvolle ontwikkeling van organoïde-afgeleide 2D-monolagen door de effectieve toepassing van strategieën voor probleemoplossing. Figuur 2: Microscopische karakterisering van de boviene ileale en rectale organoïde-afgeleide 2D-monolagen. (A) Representatieve fasecontrastmicroscopiebeelden van 2D-monolagen op dag 1 en dag 3 (D1 en D3) van de kweek op een celcultuurinsert. Schaalbalk = 100 μm. (B) Representatieve scanning elektronenmicroscopiebeelden van 2D monolagen met lagere (links) en hogere (rechts) vergrotingen. Gedetailleerde celoppervlaktestructuur, inclusief microvilli, kan worden gewaardeerd in zowel ileale (boven) als rectale (onder) monolagen. Linker schaalbalk = 10 μm, rechter schaalbalk = 2 μm. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken. Figuur 3: Immunofluorescentiekarakterisering van 2D-monolagen afgeleid van ileale en rectale organoïden. (A, B) Het paneel (A) toont ileaal en het paneel (B) toont rectale organoïden. Aan de linkerkant zijn F-actinevezels gemarkeerd met phalloidine (rood), wat de cytoskeletarchitectuur en de vorming van apicale borstelranden illustreert. Het middelste beeld legt de basolaterale lokalisatie van adherens-juncties vast, gemarkeerd door E-cadherine (groen), een indicatie van cel-celadhesie en monolaagintegriteit. Aan de rechterkant wordt de aanwezigheid van mucine-producerende bekercellen geïdentificeerd door SNA (groen), met een z-stack-afbeelding die de apicale secretie van mucine in de ileale monolaag weergeeft. Kernen in alle afbeeldingen werden tegengekleurd met DAPI (blauw). Bovendien toont z-stack-beeldvorming over alle beelden de vorming van een enkele cellaag binnen het kweekinzetstuk verder aan. Schaalbalk = 25 μm. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken. Figuur 4: Karakterisering van suboptimale 2D monolaagvorming. (A) Representatieve beelden van fasecontrasten die aantonen (i) de gedeeltelijke loslating van de monolaag langs de rand van het inzetstuk van de celcultuur; (ii) de ontwikkeling van 3D-uitgroei en de vorming van openingen in de monolaag; (iii) onvolledige of vertraagde vorming van een monolaag als gevolg van een lager dan optimale zaaidichtheid die wordt opgemerkt als fragmentarische hechting van cellen; en (iv) vorming van openingen in de eenmaal gevormde 2D-monolaag in een later stadium, waarschijnlijk als gevolg van vermoedelijke verontreiniging. Schaalbalken = 100 μm. (B) Dalende TEER-metingen in combinatie met stijgende permeabiliteitsprofielen na dag 3 duiden op het falen om stabiele en functionele epitheliale barrières tot stand te brengen. De resultaten worden gepresenteerd als gemiddelde ± standaardfout van het gemiddelde (SEM) van een enkel experiment met twee technische replicaten. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken. Aanvullende figuur 1: Dichtheidsvariaties in darmorganoïdeculturen van runderen in hydrogel op basis van ECM. Intestinale organoïden van runderen gekweekt in een hydrogel op basis van ECM; (A) hoge dichtheid en (B) lage dichtheid. Schaalbalk = 100 μm. Klik hier om dit bestand te downloaden. Aanvullende tabel 1: Samengevatte signalen van weefseldonoren. Klik hier om dit bestand te downloaden.

Discussion

De gezondheid van het darmkanaal is van het grootste belang voor zowel de productiviteit als het algehele welzijn van runderen16. Door gebruik te maken van organoïde-afgeleide 2D-monolaagtechnologie kunnen wetenschappers nu de complexe structuur van het runderdarmepitheel nauwkeuriger nabootsen in een in vitro-setting 5. Deze innovatieve benadering reproduceert niet alleen de diverse cellulaire samenstelling van de darmwand, inclusief de meercellige afstammingslijnen, maar legt ook belangrijke functionele kenmerken vast, zoals slijmafscheiding en de aanwezigheid van microvilli, essentieel voor het begrijpen van darmfysiologie en pathologie3. De ontwikkeling van op maat gemaakte kweekprotocollen voor segmenten van het ileum en het rectum heeft geleid tot een geavanceerd platform dat de capaciteit om de darmgezondheid van runderen te bestuderen aanzienlijk verbetert. Deze uitgekiende aanpak maakt gedetailleerd onderzoek mogelijk naar de interacties tussen zoönotische pathogenen en het darmmilieu van runderen. Het vermogen om de unieke aspecten van het darmecosysteem van runderen in vitro nauwkeurig te repliceren en te bestuderen, is een belangrijke stap in de richting van de ontwikkeling van gerichte strategieën om de gezondheid van vee te verbeteren en de verspreiding van zoönotische ziekten te beperken.

Om een succesvolle ontwikkeling van 2D-monolagen met behulp van darmorganoïden van runderen te garanderen, is het echter van cruciaal belang om de gezondheid en vitaliteit van zowel de organoïden als hun gedissocieerde afzonderlijke cellen te behouden. Zorgvuldige behandeling en het minimaliseren van stress zijn van het grootste belang voor het behoud van de celintegriteit en -functionaliteit, die essentieel zijn voor de effectieve groei van organoïden en de daaropvolgende creatie van een functionerende monolaag. Bovendien is het bereiken van een uniforme monolaag afhankelijk van de succesvolle dissociatie van organoïden tot afzonderlijke cellen zonder grote klonten te vormen. Dergelijke klonten kunnen de celverdeling verstoren en de structuur van de monolaag in gevaar brengen. Daarom is het gebruik van nauwkeurige technieken voor soepele dissociatie cruciaal, wat resulteert in een consistente eencellige suspensie. Bovendien wordt het nuttig om verstoringen tijdens celadhesie en bij het wegspoelen van overtollige niet-hechtende cellen tot een minimum te beperken. Deze aanpak is vooral belangrijk voor het aanpakken van mogelijke problemen met 3D-morfogenese, waardoor de algehele kwaliteit van de monolaag wordt verbeterd.

Een bekende uitdaging met op ECM gebaseerde hydrogels die van biologische oorsprong zijn, is de variatie in samenstelling van batch tot batch17. Hoewel dit niet werd waargenomen met behulp van de beschreven protocollen en materialen, kunnen batch-tot-batch-variaties in ECM-samenstelling uitdagingen vormen voor een succesvolle ontwikkeling van monolagen. Als de vorming van een monolaag in het gedrang komt wanneer ECM-producten, -merken of -lotnummers veranderen, kunnen optimalisatiestappen nodig zijn om de juiste ECM-concentratie te bepalen die nodig is voor het coaten van de celcultuurinserts.

Bovendien is het aanpassen van het kweekmedium aan kamertemperatuur voordat er wijzigingen worden aangebracht een cruciale stap die helpt thermische schokken te verminderen, de gezondheid van cellen te beschermen en de kwaliteit van zowel de organoïde- als de monolaagculturen te behouden. Zachte waspraktijken zijn ook van het grootste belang om de integriteit van de monolaag te behouden tijdens de vorming en daaropvolgende tests, en het vermijden van verstoringen kan onnauwkeurigheden in de resultaten voorkomen. Het vervangen van PBS door Hank’s Balanced Salt Solution (HBSS) leek nuttig bij het minimaliseren van het loskomen van de monolaag wanneer het een probleem werd tijdens herhaaldelijk wassen of langdurige blootstelling aan PBS, zoals in de paracellulaire permeabiliteitstests. Ten slotte is het essentieel om het kweekmedium af te stemmen op de specifieke behoeften van cellen uit verschillende segmenten van het darmkanaal, zoals het ileum en het rectum, om de omstandigheden in vivo nauwkeurig na te bootsen. Deze specificiteit zorgt voor een optimale gezondheid en functionaliteit van de cellen, waardoor een nauwkeurige modellering van de darmfysiologie van runderen en interacties met ziekteverwekkers mogelijk wordt, waardoor deze cruciale stappen in organoïdenonderzoek worden benadrukt.

Naast het toepassen van een zachte celbehandelingspraktijk, is het opbouwen van een goede technische competentie in verband met celtelling en TEER-metingen cruciaal voor de succesvolle ontwikkeling van een functionerende 2D-monolaag. Omdat zowel een te lage als een te hoge zaaidichtheid als gevolg van respectievelijk over- of ondertelling van de cellen kan leiden tot een aangetaste groei van de monolaag. Het wordt aangemoedigd om het aantal cellen zorgvuldig te controleren en te zorgen voor de juiste zaaidichtheid in gevallen waarin onnauwkeurige zaaidichtheden worden vermoed. Bovendien kunnen ontoereikende TEER-meettechnieken leiden tot verstoring van de monolaag door onbedoelde krassen met de elektroden. Door de elektroden voorzichtig in de apicale kamer te plaatsen en bijzondere aandacht te besteden aan het behouden van hun verticale oriëntatie ten opzichte van het membraanoppervlak, kan het risico op onbedoelde schade aan de monolagen worden verkleind.

De hier beschreven methoden voor de paracellulaire permeabiliteitstest zijn overgenomen van een eerder protocol18. Wijzigingen in het gerapporteerde protocol, waaronder meerdere bemonsteringen gedurende 120 minuten en vervanging van het bemonsterde aliquot door gelijke hoeveelheden PBS, worden aangebracht om de nauwkeurigheid en betrouwbaarheid van de resultaten te verbeteren. Het handhaven van het totale volume in de kamer is om verschillende redenen van cruciaal belang: het behoudt het osmotische evenwicht, zorgt voor celintegriteit, handhaaft de concentratiegradiënt die essentieel is voor een nauwkeurige beoordeling van de permeabiliteit en voorkomt veranderingen in de hydrostatische druk die de transportsnelheden kunnen beïnvloeden. Deze praktijk van het aanvullen van de basolaterale kamer met verse PBS die gelijk is aan het volume van de fluorescerende tracer-bevattende PBS die is bemonsterd, is van cruciaal belang voor het behoud van deze omstandigheden, waardoor nauwkeurige en zinvolle evaluaties van de permeabiliteit van de monolaag mogelijk worden. De paracellulaire permeabiliteitstest dient als aanvulling op de TEER-meting door de beweging van tracermoleculen door de monolaag rechtstreeks te beoordelen. Bovendien levert het vergelijken van TEER-waarden in verschillende laboratoria mogelijk geen relevante inzichten op, aangezien deze waarden kunnen worden beïnvloed door tal van variabelen, zoals temperatuur en de specifieke omstandigheden waaronder cellen worden gekweekt, waaronder celtypen, passagenummers en de samenstelling van het kweekmedium19. De paracellulaire permeabiliteitstest biedt een functionele in vitro beoordeling van de effectieve expressie van adherens en tight junctions binnen een epitheliale barrière20.

Hoewel de ontwikkeling van 2D-monolagen uit 3D-organoïden een aanzienlijke vooruitgang betekent in de kweektechnologie, is het belangrijk om de beperkingen van 2D-monolagen te erkennen. Een groot nadeel is dat dit een statisch kweeksysteem blijft, zonder de dynamische stimulatie die in de in vivo omgeving wordt aangetroffen. Bovendien brengt het wijzigen van het zuurstofgehalte in het kweeksysteem uitdagingen met zich mee vanwege de open opstelling met kweekplaten met deksels, waardoor het minder geschikt is voor langdurige co-cultuur met anaërobe bacteriën. Deze beperkingen kunnen mogelijk worden aangepakt door meer dynamische cultuurplatforms in te voeren, zoals microfluïdische systemen21, die een meer gecontroleerde en fysiologisch relevante omgeving bieden. Bovendien is het van cruciaal belang om te erkennen dat, hoewel de huidige kweekomstandigheden rijk zijn aan voedingsstoffen die gunstig zijn voor het behoud van de groei van stamcellen, ze mogelijk niet optimaal zijn voor het induceren van fysiologische differentiatie van de epitheelcellen. Deze discrepantie benadrukt de noodzaak van optimalisatie in toekomstig onderzoek om de in vivo omstandigheden nauwkeurig na te bootsen en het differentiatieproces te ondersteunen. Door deze beperkingen aan te pakken en deze benaderingen te verfijnen, worden het nut en de toepasbaarheid van organoïdekweektechnologieën verbeterd, waardoor de complexe dynamiek en interacties van het maagdarmkanaal in vitro dichter bij het repliceren komen.

Het protocol voor het genereren van 2D-monolagen uit runder-, ileum- en rectumweefsels biedt onderzoekers een waardevol in vitro model van de luminale interface van zowel dunne als dikke darmepitheel. Dit model opent enorme mogelijkheden voor toepassing in fundamentele diervoedingsstudies, met name om te onderzoeken hoe voedingsstoffen onder verschillende omstandigheden worden opgenomen. Een opmerkelijk aandachtsgebied is het onderzoek naar het lekkende darmsyndroom, gekenmerkt door een abnormale toename van de gastro-intestinale permeabiliteit, vaak veroorzaakt door voedingsveranderingen en extreme omgevingstemperaturen22,23. Bovendien dient dit model als een essentieel hulpmiddel voor het onderzoeken van de complexe interacties tussen het darmmicrobioom en zijn gastheer. Het maakt het mogelijk om te bestuderen hoe commensale micro-organismen de gezondheid van het gastheerorganisme kunnen beïnvloeden, waarbij een cruciaal aspect van de veterinaire en medische wetenschap wordt aangepakt 1,24. Bovendien worden door voedsel overgedragen door mensen overgedragen ziekteverwekkers vaak aangetroffen als commensalen in verschillende segmenten van de darm vanrunderen 8,9,25, dit protocol maakt gedetailleerde studies mogelijk van de specifieke omstandigheden waardoor deze zoönotische agentia kunnen gedijen in hun respectievelijke niches.

Tijdens deze studie werd waargenomen dat rectale en ileale organoïde-afgeleide monolagen verschillende voorwaarden vereisen voor een succesvolle ontwikkeling. Met name toen rectale organoïde-afgeleide monolagen aanvankelijk werden gezaaid op celcultuurinserts die waren bereid met 2% ECM-gebaseerde hydrogel in basale media gedurende 1 uur, werden grote gaten en celvervelling opgemerkt. Dit probleem werd opgelost door over te schakelen op een gespecialiseerd rectaal monolaagkweekmedium en de incubatietijd te verlengen tot ‘s nachts voor het zaaien, terwijl ileale organoïde-afgeleide monolagen met succes werden ontwikkeld met behulp van een korter voorbereidingsprotocol. Bovendien verbeterde de toevoeging van CHIR99021 aan het kweekmedium consequent de vorming van rectale monolagen26 , maar was het niet noodzakelijk voor ileale monolagen27. Bovendien hadden ileale monolagen een hogere celdichtheid nodig voor een succesvolle ontwikkeling in vergelijking met rectale organoïden27. Deze geoptimaliseerde omstandigheden (Tabel 1) hebben herhaaldelijk monolagen ontwikkeld die de resistente barrière-integriteit behouden, wat het belang onderstreept van het afstemmen van kweekomstandigheden op het specifieke darmsegment.

Toegang tot een model dat de complexiteit van de meercellige afstamming van de in vivo darm nauwkeurig weergeeft, is van cruciaal belang voor deze onderzoeken. Het stelt onderzoekers in staat om de natuurlijke omstandigheden van het darmmilieu nauwkeurig na te bootsen, wat een betrouwbaardere basis voor experimenten biedt. Met dit protocol zijn onderzoekers uitgerust met een robuust model dat hun onderzoekscapaciteiten verbetert, wat mogelijk kan leiden tot baanbrekende ontdekkingen in hun vakgebied. Deze benadering draagt niet alleen bij aan het begrijpen van darmgezondheid en -ziekten, maar helpt ook bij de ontwikkeling van strategieën om het veebeheer en de voedselveiligheid te verbeteren.

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Deze studie werd gedeeltelijk ondersteund door het Office of the Director National Institutes of Health (K01OD030515 en R21OD031903 aan YMA) en WSU VCS Resident and Graduate Student Research Grant (aan GDD). De auteurs willen het deelnemende slachthuis bedanken voor het leveren van donorvee.

Materials

Basal Medium
Advanced DMEM/F12 (1X) Gibco 12634-010 n/a
GlutaMAX-I (100X) Gibco 35050-061 2 mM
HEPES (1M) Gibco 15630-080 10 mM
Pen Strep Glutamine (100X) Gibco 10378-016 1X
Organoid Culture Medium (Supplements to Basal Medium)
A-83-01 Sigma-Aldrich SML0788-5MG 500 nM
B27 Supplement (50X) Gibco 17504-001 1X
[Leu15]-Gastrin I human Sigma-Aldrich G9145-.5MG 10 nM
Murine EGF PeproTech 315-09-500UG 50 ng/mL
Murine Wnt-3a PeproTech 315-20-10UG 100 ng/mL
N-Acetyl-L-cysteine MP Biomedicals 194603 1 mM
N-2 MAX Media Supplement (100X) R&D Systems AR009 1X
Nicotinamide Sigma-Aldrich N0636-100G 10 mM
Noggin Conditioned Medium n/a n/a 10 vol/vol %
Primocin InvivoGen ant-pm-2 100 µg/mL
R-Spondin-1 Conditioned Medium n/a n/a 20 vol/vol %
SB202190 Sigma-Aldrich S7067-25MG 10 µM
Monolayer Culture Medium (Supplements to Organoid Culture Medium)
CHIR99021 Sigma-Aldrich SML1046-5MG 2.5 µM
HI FBS Gibco 10438-034 20 vol/vol %
LY2157299 Sigma-Aldrich SML2851-5MG 500 nM
Y-27632 StemCellTechnologies 72308 10 µM
Reagents
Alexa Fluor 488 Mouse anti-E-cadherin BD Biosciences 560061 1:200 dilution
Alexa Fluor 647 Phalloidin Invitrogen A22287 1:400 dilution
BSA Cytiva SH30574.02 2 w/vol %
Cell Recovery Solution Corning 354253 n/a
DAPI Solution (1 mg/mL) Thermo Scientific 62248 1:1000 dilution
DPBS (1X) Gibco 14190-144 n/a
Fluorescein Isothiocyanate–Dextran Sigma-Aldrich FD4-100MG 0.5 mg/mL
Matrigel Matrix Corning 354234 n/a
Paraformaldehyde Solution (4%) Thermo Scientific J19943K2 n/a
ProLong Gold antifade reagent Invitrogen P36930 n/a
SNA, EBL, Fluorescein Vector Laboratories FL-1301 1:100 dilution
Triton X-100 Thermo Scientific A16046.AE 0.3 vol/vol %
TrypLE Express Gibco 12605-028 n/a
Trypan Blue Solution, 0.4% VWR Life Science K940-100ML n/a
Materials and Equipment
0.4 µm Cell Culture Insert Falcon 353095
24-well Cell Culture Plate Corning 3524
48-well Cell Culture Plate Thermo Scientific 150687
70 µm Sterile Cell Strainer Fisher Scientific 22-363-548
96-well Cell Culture Plate Greiner Bio-One 655086
Centrifuge Eppendorf 5910Ri
CO2 Incubator Thermo Scientific 370
Epithelial Volt-Ohm Meter Millipore Millicell ERS-2
Hemocytometer LW Scientific CTL-HEMM-GLDR
Inverted Confocal Microscope Leica Microsystems SP8-X
Inverted Phase-Contrast Microscope Leica Microsystems DMi1
Microscope Cover Glass Fisher Scientific 12-540-B
Microplate Reader Molecular Devices SpecrtraMax i3x
Microscope Slides Fisher Scientific 22-034-486
Pasteur Pipets Fisher Scientific 13-678-20C
Scalpel Blade iMed Scientific – #11 carbon steel
Vortex Mixer Scientific Industries SI-0236
Software
LAS X imaging software Leica Microsystems LAS X 3.7.6.25997
Microplate Reader software Molecular Devces SoftMax Pro 7.1.2
DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Min, S., Kim, S., Cho, S. W. Gastrointestinal tract modeling using organoids engineered with cellular and microbiota niches. Exp Mol Med. 52 (2), 227-237 (2020).
  2. Fitzgerald, S. F., et al. Shiga toxin sub-type 2a increases the efficiency of Escherichia coli O157 transmission between animals and restricts epithelial regeneration in bovine enteroids. PLoS Pathogens. 15 (10), e1008003 (2019).
  3. Dutta, D., Heo, I., Clevers, H. Disease modeling in stem cell-derived 3D organoid systems. Trend Mol Med. 23 (5), 393-410 (2017).
  4. Beaumont, M., et al. Intestinal organoids in farm animals. Vet Res. 52 (1), 33 (2021).
  5. Kawasaki, M., Dykstra, G. D., McConnel, C. S., Burbick, C. R., Ambrosini, Y. M. Adult bovine-derived small and large intestinal organoids: In vitro development and maintenance. J Tissue Eng Regene Med. 2023, e3095002 (2023).
  6. Kvidera, S. K., et al. Intentionally induced intestinal barrier dysfunction causes inflammation, affects metabolism, and reduces productivity in lactating Holstein cows. J Dairy Sci. 100 (5), 4113-4127 (2017).
  7. Crawford, C. K., et al. Inflammatory cytokines directly disrupt the bovine intestinal epithelial barrier. Sci Rep. 12 (1), 14578 (2022).
  8. Heredia, N., García, S. Animals as sources of food-borne pathogens: A review. Animal Nutri. 4 (3), 250-255 (2018).
  9. Naylor, S. W., et al. Lymphoid follicle-dense mucosa at the terminal rectum is the principal site of colonization of enterohemorrhagic Escherichia coli O157:H7 in the bovine host. Infect Immun. 71 (3), 1505-1512 (2003).
  10. Co, J. Y., et al. Controlling epithelial polarity: A human enteroid model for host-pathogen interactions. Cell Rep. 26 (9), 2509-2520.e4 (2019).
  11. Pullinger, G. D., et al. Systemic translocation of Salmonella enterica Serovar Dublin in cattle occurs predominantly via efferent lymphatics in a cell-free niche and requires type III secretion system 1 (T3SS-1) but not T3SS-2. Infect Immun. 75 (11), 5191-5199 (2007).
  12. Nickerson, K. P., et al. A versatile human intestinal organoid-derived epithelial monolayer model for the study of enteric pathogens. Microbiol Spectr. 9 (1), e0000321 (2021).
  13. Varani, J., McClintock, S. D., Aslam, M. N. Cell-matrix interactions contribute to barrier function in human colon organoids. Front Med. 9, 838975 (2022).
  14. Freire, R., et al. Human gut derived-organoids provide model to study gluten response and effects of microbiota-derived molecules in celiac disease. Sci Rep. 9, 7029 (2019).
  15. Ambrosini, Y. M., et al. Recapitulation of the accessible interface of biopsy-derived canine intestinal organoids to study epithelial-luminal interactions. PLoS ONE. 15 (4), e0231423 (2020).
  16. Kogut, M. H., Arsenault, R. J. Editorial: Gut health: The new paradigm in food animal production. Front Vet Sci. 3, 71 (2016).
  17. Lingard, E., et al. Optimising a self-assembling peptide hydrogel as a Matrigel alternative for 3-dimensional mammary epithelial cell culture. Biomater Adv. 160, 213847 (2024).
  18. Turksen, K. . Permeability Barrier: Methods and Protocols. , (2011).
  19. Srinivasan, B., et al. TEER measurement techniques for in vitro barrier model systems. J Lab Autom. 20 (2), 107-126 (2015).
  20. Frost, T. S., Jiang, L., Lynch, R. M., Zohar, Y. Permeability of epithelial/endothelial barriers in Transwells and microfluidic bilayer devices. Micromachines. 10 (8), 533 (2019).
  21. Bein, A., et al. Microfluidic organ-on-a-chip models of human intestine. Cell Mol Gastroenterol Hepatol. 5 (4), 659 (2018).
  22. Sanz-Fernandez, M. V., et al. Targeting the hindgut to improve health and performance in cattle. Animals. 10 (10), 1817 (2020).
  23. Gressley, T. F., Hall, M. B., Armentano, L. E. Ruminant nutrition symposium: Productivity, digestion, and health responses to hindgut acidosis in ruminants. J Anim Sci. 89 (4), 1120-1130 (2011).
  24. O’Hara, E., Neves, A. L. A., Song, Y., Guan, L. L. The role of the gut microbiome in cattle production and health: Driver or passenger. Ann Rev Animal Biosci. 8 (2020), 199-220 (2020).
  25. Beach, J. C., Murano, E. A., Acuff, G. R. Prevalence of Salmonella and Campylobacter in beef cattle from transport to slaughter. J Food Protect. 65 (11), 1687-1693 (2002).
  26. Kawasaki, M., Ambrosini, Y. M. Accessible luminal interface of bovine rectal organoids generated from cryopreserved biopsy tissues. PLoS One. 19 (3), e0301079 (2024).
  27. Kawasaki, M., McConnel, C. S., Burbick, C. R., Ambrosini, Y. M. Pathogen-epithelium interactions and inflammatory responses in Salmonella Dublin infections using ileal monolayer models derived from adult bovine organoids. Scientific Reports. 14 (1), 11479 (2024).

Tags

BovineOrganoidIntestinalMonolayerGastrointestinalIn Vitro ModelEpitheliumTransepithelialPermeabilityImmunocytochemistryPhysiologyPublic HealthBiomedicalTranslational ResearchAgricultureAnimal WelfareFood Safety

Play Video
PDF
DOI
DOWNLOAD MATERIALS LIST
Cite This Article
Dykstra, G. D., Kawasaki, M., Ambrosini, Y. M. Advancements in Bovine Organoid Technology Using Small and Large Intestinal Monolayer Interfaces. J. Vis. Exp. (208), e67010, doi:10.3791/67010 (2024).
Download Citation
Reprints and Permissions

View Video

✖

To prove you're not a robot, please enter the text in the image below

CAPTCHA Image
Play CAPTCHA Audio
Refresh Image