JoVE Journal > Medicine
Summary
Abstract
Introduction
Protocol
Results
Discussion
Disclosures
Acknowledgements
Materials
References
Türkçe

Automatically Generated
Please note that all translations are automatically generated. Click here for the English version.
Medicine

İnce ve Kalın Bağırsak Tek Katmanlı Arayüzleri Kullanılarak Sığır Organoid Teknolojisindeki Gelişmeler

Published: June 14, 2024
doi:
10.3791/67010
, ,
1Department of Veterinary Microbiology and Pathology, College of Veterinary Medicine,Washington State University, 2Department of Veterinary Clinical Sciences, College of Veterinary Medicine,Washington State University

Summary

Bu çalışma, organoidlerden sığır bağırsağı 2D tek tabakaları oluşturmak için bir protokol sunar ve konak-patojen etkileşimlerini incelemek için gelişmiş erişim sunar. Sığırların gastrointestinal fizyolojisini taklit eden in vitro modelleri geliştirerek membran bütünlüğünü ve işlevselliğini değerlendirmek için yöntemler içerir. Bu yaklaşım, gelişmiş tedavi stratejileri de dahil olmak üzere önemli biyomedikal ve tarımsal faydalar vaat etmektedir.

Abstract

Gastrointestinal fizyoloji ve hastalıkları hakkındaki bilgileri kritik bir şekilde geliştirmek, in vivo bağırsak dokularını aslına uygun olarak taklit eden kesin, türe özgü in vitro modellerin geliştirilmesine bağlıdır. Bu, ciddi halk sağlığı riskleri oluşturan patojenler için önemli rezervuarlar olan sığırlarda konak-patojen etkileşimlerini araştırmak için özellikle hayati önem taşır. Geleneksel 3D organoidler, bağırsak epitelinin apikal yüzeyine sınırlı erişim sunar, bu da 2D tek katmanlı kültürlerin ortaya çıkmasıyla üstesinden gelinen bir engeldir. Organoid hücrelerden türetilen bu kültürler, daha erişilebilir bir çalışma için açıkta kalan bir luminal yüzey sağlar. Bu araştırmada, sığır küçük ve kalın bağırsak organoidlerinin hücrelerinden 2D tek katmanlı kültürlerin oluşturulması ve sürdürülmesi için ayrıntılı bir protokol tanıtılmıştır. Bu yöntem, immünositokimya boyama tekniklerinin yanı sıra transepitelyal elektriksel direnç ve paraselüler geçirgenlik yoluyla membran bütünlüğünün değerlendirilmesi için protokolleri içerir. Bu protokoller, 2 boyutlu sığır tek katmanlı kültür sisteminin kurulması ve karakterize edilmesi için zemin hazırlamakta ve halk sağlığı açısından önem taşıyan biyomedikal ve translasyonel araştırmalarda bu yöntem uygulamalarının sınırlarını zorlamaktadır. Bu yenilikçi yaklaşımın kullanılması, sığır bağırsak fizyolojisinin hem normal hem de hastalıklı durumlarını araştırmak için fizyolojik olarak uygun in vitro modellerin geliştirilmesini sağlar. Biyomedikal ve tarımsal ilerlemeler üzerindeki etkileri derindir ve sığırlarda bağırsak rahatsızlıkları için daha etkili tedavilerin önünü açmakta ve böylece hem hayvan refahını hem de gıda güvenliğini artırmaktadır.

Introduction

Bağırsak organoidleri olarak bilinen üç boyutlu (3D) kültürlerde bağırsak epitel kök hücrelerinin kültürü, bağırsak fonksiyonlarını, beslenmeyi ve patojenlerle etkileşimleri araştırmak için in vitro teknolojide önemli bir ilerlemeye işaret etmektedir 1,2. Bu organoidler, in vivo bağırsak epitelinin karmaşık yapısını, kendi kendini çoğaltarak ve çeşitli bağırsak hücre soylarını kapsayan 3 boyutlu oluşumlar halinde düzenleyerektaklit eder 3. Bu özellik, bağırsak biyolojisi anlayışını ilerletmek için önemli potansiyellerini vurgulamaktadır.

Bağırsak organoid teknolojisinin çiftlik hayvanlarına uygulanmasına yönelik artan ilgi, kültür ve bakım tekniklerinin iyileştirilmesini gerektirmektedir 4,5. Bu teknolojinin alaka düzeyi, hayvan refahını ve işletme maliyetlerini etkileyerek üretkenliklerinde ve dolayısıyla gıda-hayvan endüstrisinin ekonomisinde kritik bir rol oynayan çiftlik hayvanlarının bağırsak sağlığını inceleme üzerindeki potansiyel etkisi ile vurgulanmaktadır 6,7. Özellikle, sığırların bağırsak fonksiyonunu araştırmak için bağırsak organoid kültürlerinin kullanılması, Salmonella spp. ve Escherichia coli (E. coli) O157:H78 gibi zoonotik enterik patojenler için rezervuar rolleri göz önüne alındığında büyük önem taşımaktadır. Bu patojenler bağırsağın belirli segmentlerinde lokalizedir, bu da çalışmalarda hassasiyeti artırmak için bağırsak organoid kültür yöntemlerini bağırsak segmentine göre ayırt etmeyi gerekli kılar9.

Bağırsak organoidlerinin çalışmasındaki önemli bir engel, epitel hücresinin apikal yüzeyine sınırlı erişimdir10. Hücre dışı bir matris (ECM) içinde kültürlendiğinde, hücreler doğal olarak kendilerini yönlendirir, böylece bazal yüzey dışa bakar ve apikal yüzey içe doğru yönlendirilir10. Bu zorluğun üstesinden gelmek için, 3D organoidlerin tek hücrelere ayrılmasını ve bunların yarı geçirgen hücre kültürü eklerine tohumlanmasını içeren yöntemler sunulmaktadır. Bu kurulum, apikal yüzey ile bir bazolateral bölme arasında bir arayüz oluşturur. Bu protokol, sığır bağırsak organoidlerinden türetilen hücrelerin, transepitelyal elektrik direnci (TEER) ölçümleri ve paraselüler geçirgenlik deneyleri ile kanıtlandığı gibi tutarlı bir 2D tek tabaka oluşturabileceğini göstermektedir. Ek olarak, organoidden türetilmiş 2D tek katmanlı hücrelerde fırça kenarları ve sıkı bağlantılar ile hücresel polaritenin gelişimi, in vivo bağırsak epitelinin özelliklerini yansıtan immünofloresan ve elektron mikroskobu ile doğrulanır.

Bu çalışmada, ileum ince bağırsak yolunu, rektum ise kalın bağırsak yolunu ifade eder. Bu seçimler, ileum11’i translokasyon edebilen Salmonella spp. ve sığırlarda esas olarak rektum9’u kolonize ettiği bilinen E. coli O157:H7 gibi ilgili enterik patojenlere dayanmaktadır. Bu spesifik bağırsak segmentlerinin seçimi, araştırmada hassasiyet için bağırsak organoid kültür yöntemlerinin bağırsak bölgesine göre uyarlanmasının gerekliliğini vurgulamaktadır. Bu yöntemler, sığır bağırsak sağlığını, patojen enfeksiyonlarını ve bağırsak mikrobiyomu ile konakçı arasındaki etkileşimleri keşfetmek için sağlam bir model sağlayarak, bu bağırsak segmentlerinden organoid türetilmiş 2D tek katmanlı bir arayüzün etkili bir şekilde kültürlenmesi prosedürünü detaylandırır.

Protocol

Bağırsak kriptleri, yerel bir mezbahadan elde edilen fazla bağırsak örneklerinden temin edildi ve donörlerin sinyali Ek Tablo 1’de verilmiştir. Organoidler, bir mezbahada insancıl bir şekilde ötenazi yapılan hayvanlardan elde edilen dokular kullanılarak üretildi ve hayvanlar yalnızca bu araştırma için tedarik edilmedi; bu nedenle, bu çalışma IACUC incelemesinden muaftır ve bir etik beyanı geçerli değildir. 1. Organoidden türetilmiş 2D tek katmanlı kültür için hücre kültürü ekleri üzerinde ECM kaplaması NOT: Tüm işlemler bir biyogüvenlik kabininde sterilize edilmiş malzemeler ve aseptik teknikler kullanılarak gerçekleştirilir. Aksi belirtilmedikçe tüm reaktifler prosedür boyunca buz üzerinde tutulur. Bazal ortamı %2 (h/h) ECM bazlı hidrojel ile bir mikrotüp içinde iyice karıştırarak her 0,33 cm2 hücre kültürü ekini kaplamak için 100 μL ECM hazırlayın. Tek tek hücre kültürü ekini sterilize edilmiş forseps ile ambalajından çıkarın ve 24 oyuklu şeffaf, düz tabanlı bir hücre kültürü plakasının kuyucuklarına ayrı ayrı yerleştirin. Adım 1.1’de hazırlanan 100 μL ECM kaplamasını, adım 1.2’de hazırlanan her hücre kültürü ekinin apikal odasına uygulayın. Kapağı değiştirin ve kaplanmış hücre kültürü ek(ler)i içeren hücre kültürü plakasını nemlendirilmiş bir inkübatörde 37 °C ve %5 CO2’de 1 saat inkübe edin.İleal organoid hücreler için, ek parça 1 saatlik inkübasyondan sonra kullanıma hazırdır. Rektal organoid hücreler için, 1 saatlik inkübasyondan sonra, ECM kaplamasını rektal tek katmanlı kültür ortamı ile değiştirin ve gece boyunca inkübe edin (Tablo 1). TEER ölçümlerini gerçekleştirmesi amaçlanıyorsa, boş kontroller için ekstra hücre kültürü ekleri hazırlayın. Ileum Rektum ECM kaplama inkübasyon süresi 1 saat, 1 saat sonratek katmanlı kültür ortamında bir gecede TakviyelerOrganoid kültür ortamı CHIR99021 LY2157299 LY2157299 Y-27632 Serisi Y-27632 Serisi Fetal sığır serumu Fetal sığır serumu Hücre tohumlama yoğunluğu (hücreler/kuyu) 5 x 105 3 x 105 Tablo 1: Yetişkin sığır ileal ve rektal organoidlerinden türetilen 2D tek tabakalar oluşturmak için optimize edilmiş protokolün özeti. 2. Sığır ileal ve/veya rektal organoid hücre tohumlama ve 2D monotabaka kültürü NOT: Bu bölümde açıklanan protokol, tarif edilen teknikler5 kullanılarak 48 oyuklu plakalar üzerinde kültürlenen ve muhafaza edilen sığır ileal ve rektal organoidlerini kullanır. En iyi sonuçlar için, ilk kurulumdan sonra 3 kattan fazla pasaja uğramış ve en son pasajdan sonra 3 günden daha uzun süre kültürlenmiş, stabil bir şekilde korunan organoidlerin kullanılması tavsiye edilir. Olgun organoidler içeren ECM bazlı hidrojel kubbeyi bozmadan, bir vakum sistemine bağlı tek kullanımlık bir cam Pasteur pipeti kullanarak organoid kültür ortamını çıkarın ve oyuk başına 300 μL buz gibi soğuk ECM depolimerizasyon çözeltisi ekleyin. 4 °C’de en az 1 saat inkübe edin.NOT: Alternatif olarak, ECM depolimerizasyon çözeltisinin eklenmesinden sonra ECM içeren hidrojel kubbesini mekanik olarak bozun ve 15 °C’de inkübe etmeden önce 4 mL’lik konik bir tüpte süspansiyonu toplayın. Bu yöntem, 2D tek katmanlı kültür için kullanılması amaçlanmayan organoidler aynı plaka üzerinde aynı anda kültürlendiğinde önerilir. Organoid kültürlerin yoğunluğu, hücre kültürü eklerine optimum tohumlama için gerekli organoid kültür kuyularının sayısını önemli ölçüde etkiler.Yüksek yoğunluklu organoid kültürler için (Ek Şekil 1A), rektal hücre kültürü ekleri 1: 1 ila 1: 2 aralığında bir tohumlama oranı kullanır, yani bir kültür kuyusu bir ila iki kuyuyu tohumlayabilir. ileum için oranı 1:1’de tutun. Buna karşılık, daha düşük yoğunluklu kültürler (Ek Şekil 1B) daha fazla kültür kuyusu gerektirir; Bir rektal hücre kültürü eki (3-4: 1 oranında) için 3-4 rektal organoid kültür kuyucuğu ve bir ileal hücre kültürü eki (4-5: 1 oran) için 4-5 ileal organoid kültür kuyusu kullanın. ECM bazlı hidrojel çözünmesinin tam olup olmadığını görsel olarak inceleyin ve organoid süspansiyonu 15 mL’lik konik bir tüpe toplayın. 5 dakika boyunca 200 x g ve 4 ° C’de santrifüjleme ile pelet organoidleri Süpernatanı atın. 10 μM Y-27632 ile desteklenmiş 1 mL rekombinant hücre ayrışma enzim çözeltisi içinde peleti yeniden süspanse edin. Etkili organoid ayrışmayı kolaylaştırmak için organoid süspansiyonu 37 ° C’lik bir su banyosunda 10 dakika boyunca inkübe edin ve her 2-3 dakikada bir girdap ile 3-5 sn aralıklı çalkalayın. Enzimatik sindirimi takiben, 5 mL bazal ortam ekleyin ve organoidleri tek hücrelere daha fazla bozmak için bir P1000 mikropipet ile agresif bir şekilde pipetleyin. Süspansiyonda organoid topaklar olup olmadığını kontrol edin ve görsel olarak hala fark ediliyorsa, tek hücre ayrışmasını artırmak için pipetlemeyi tekrarlayın. 70 μm hücre süzgeci ile 50 mL’lik bir konik tüp hazırlayın. 1-2 mL bazal ortam uygulayarak süzgeci önceden ıslatın. Artık ECM bazlı hidrojel kalıntılarını ve büyük hücre kümelerini temizlemek için süzgeçten hücre süspansiyonunu filtreleyin. Orijinal 15 mL tüpü ve 70 μm hücre süzgecini ilave 10 mL bazal ortam ile durulayın.NOT: Hücre süspansiyonu bir süzgeçten kolayca geçemezse, eksik organoid ayrışmasının bir göstergesi olabilir. Toplanan hücre süspansiyonunun aynı 70 μm hücre süzgecinden tekrar geçirilmesi denenebilir. Ek enzimatik veya mekanik bozulma gerekli olabilir. 5 dakika boyunca 200 x g ve 4 ° C’de santrifüjleme ile pelet tek hücreli süspansiyon. Süpernatanı çıkarın ve hücre sayımını gerçekleştirmek için hücreleri uygun hacimde bazal ortamla yeniden süspanse edin. Toplanan toplam hücre sayısını hesaplamak için tripan mavisi boyamayı takiben bir hemositometre ile canlı hücreleri sayın. 5 dakika boyunca 200 x g ve 4 ° C’de santrifüjleme ile pelet tek hücreli süspansiyon. Süpernatanı çıkarın ve hücreleri ilgili tek katmanlı kültür ortamında uygun tohumlama yoğunluğuna yeniden süspanse edin (Tablo 1).İleal organoid hücreler için, 500 nM LY2157299, 10 μM Y-27632 ve fetal sığır serumu (FBS) ile desteklenmiş organoid kültür ortamı olan 200 μL ileal tek katmanlı kültür ortamında hücre kültürü eki başına 5 x 105 hücrelik bir tohumlama yoğunluğu elde etmek için hücreleri 2.5 x 106 hücre / mL konsantrasyonuna yeniden süspanse edin. Rektal organoid hücreler için, 100 nM CHIR99021, 500 nM LY2157299, 10 μM Y-27632 ile desteklenmiş organoid kültür ortamı olan 200 μL rektal tek tabakalı kültür ortamında hücre kültürü eki başına 3 x 105 hücrelik bir tohumlama yoğunluğu elde etmek için hücreleri 1.5 x 106 hücre / mL konsantrasyonuna yeniden süspanse edin, ve FBS. ECM kaplı hücre kültürü ek(ler)i ile 24 oyuklu hücre kültürü plakasını alın ve kaplamayı bozmamak için hücre kültürü ekinin apikal odasını dikkatli bir vakum emme ile boşaltın. Adım 2.10’da hazırlanan 200 μL tek hücreli süspansiyonu hücre kültürü ekinin apikal odasına nazikçe uygulayın. Boş kontrol için, apikal odaya hücresiz 200 μL kültür ortamı ekleyin. Boş kontrol için, apikal odaya hücresiz 200 μL kültür ortamı ekleyin. Her bir oyuğun bazolateral odasına 500 μL uygun şekilde takviye edilmiş tek katmanlı kültür ortamı (ileal ve rektal hücrelere bağlı olarak) uygulayın. Hücre kültürü eki üzerinde birleşik bir 2D tek tabaka oluşturmak üzere hücre yapışmasını ve büyümesini kolaylaştırmak için 37 °C ve% 5 CO2’de nemlendirilmiş bir inkübatörde inkübe edin. Hücre tohumlamasından 48 saat sonra başlayarak hem apikal hem de bazolateral odalarda kültür ortamını değiştirin. Boş kontrol ve hücre içeren ek parça için eşit inkübasyon süresi sağlayın. 3. TEER ölçümü NOT: Burada açıklanan yöntem, bir çift Ag / AgCl elektrotlu epitelyal voltohmmetre olarak bilinen, ticari olarak temin edilebilen bir manuel TEER ölçüm sistemi kullanır (Şekil 1A). 2D tek tabaka boyunca TEER’in belirlenmesi, boş kuyuların ölçümünü gerektirir. Boş okumanın numune ile aynı şekilde alındığından emin olun. Organoidden türetilmiş 2D tek tabaka(lar) ile hücre kültürü eklerini içeren plakayı alın ve inkübatörden boşaltın. Plakanın yaklaşık 10 dakika oda sıcaklığına gelmesine izin verin. Elektrotları% 70 etanol ile dezenfekte edin ve tamamen kurumasını bekleyin. Kısa ucu apikal haznede ve uzun ucu bazolateral haznede olacak şekilde elektrotları dikkatlice yerleştirin (Şekil 1A).NOT: Hücre tek tabakasını bozmamak için ekstra dikkatli olunması gerekmektedir. Okumanın dengelenmesine izin verin ve stabilize olduğunda değeri ohm cinsinden kaydedin.NOT: Voltohmmetrenin hassasiyeti, elektriksel direnç ölçümü yapılırken ohm değerinde dalgalanmalar meydana gelecek şekildedir. Ölçümler stabilize olduğunda ve tutarlı bir şekilde bir plato değeri etrafında gezindiğinde güvenilir bir okuma elde edilir. Aşağıdaki formülle 2B tek katmanın TEER’ini belirleyin:TEER (Ω xcm2) = hücre kültürü eklerinin yüzey alanı (cm2) x Net elektrik direnciNet elektrik direncinin, hücre tek katmanlı ekin ölçülen direnci eksi boş ekin ölçülen direncine eşit olduğu durumlarda. 24 oyuklu plakalar için hücre kültürü ekleri 0.33cm2’lik bir yüzey alanına sahiptir. Şekil 1: Sığır bağırsağı organoid türevli 2D tek tabakanın epitel bariyer bütünlüğü değerlendirmesi. (A) TEER ölçümleri için bir hücre kültürü ekinin apikal ve bazolateral odaları içinde elektrotların uygun konumlandırılmasının şeması. Kısa elektrot apikal odaya yerleştirilir ve uzun elektrot, zar ile teması önlemek için dikkatli bir şekilde bazolateral odaya yerleştirilir. (B) Geçirgenlik tahlil işleminin şeması. Hücre kültürü odaları 2 kez ısıtılmış PBS ile yıkanır ve apikal odaya PBS içinde çözündürülen 0.5 mg/mL 4 kDa FITC-dekstran izleyici uygulanır. Bazolateral odadan tekrarlanan 50 μL’lik alikotlar, inkübasyon süresi boyunca bazolateral odadaki toplam hacmi korumak için eşit hacimde PBS’nin değiştirilmesiyle örneklenir. Alikotun floresan yoğunluğu, hücre tek tabakası boyunca 4 kDa FITC-dekstran izleyicinin difüzyonunu ölçmek için bir mikroplaka okuyucu kullanılarak ölçülür. (C) Zaman içinde ileal ve rektal monotabakalar içindeki bariyer bütünlüğünün dinamik gelişimi, TEER ölçümleri (ileum için kapalı daireler ve rektum için kapalı kareler ile temsil edilir) ve geçirgenlik testleri (ileum için açık daireler ve rektum için açık kareler ile gösterilir) kullanılarak 4 kDa FITC-dekstran izleyici ile değerlendirildi. Kültürün 3. gününe gelindiğinde, her iki tek tabaka türü, ilgili TEER ve geçirgenlik profilleri ile kanıtlandığı gibi, stabil ve fonksiyonel epitel bariyerlerinin oluşumunu sergiledi. Sonuçlar, iki teknik kopya ile en az iki bağımsız deneyin ortalamasıdır. Hata çubukları, ölçümlerin SEM’ini temsil eder. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın. 4. Paraselüler geçirgenlik deneyi NOT: Bu test, floresein izotiyosiyanat (FITC)-dekstranın apikal odadan bazolateral odaya 120 dakika boyunca 2D tek tabakalar boyunca difüzyonundan kaynaklanan floresan yoğunluğunun belirlenmesini içerir (Şekil 1B). Optimum sonuçlar için, test sırasında ışığa maruz kalmanın en aza indirilmesi ve floresansın herhangi bir şekilde azalmasını veya söndürülmesini önlemek için her numune alımından hemen sonra bir mikroplaka okuyucuda ölçüm yapılması tavsiye edilir. Her kuyucuk yalnızca bir kez kullanılabilir ve sonraki tahlillerde tekrar kullanılamaz. Her tahlil için teknik kopya olarak hizmet etmek üzere en az 2 kuyu hazırlayın. Örneğin, Şekil 1C’de sunulan sonuçları elde etmek için toplam 6 kuyuya ihtiyaç vardır, burada tahliller 3 farklı zaman noktasında (kültürün 1, 3 ve 5. günleri) iki kez çalıştırılmıştır. Fosfat tamponlu salin (PBS) içinde 4 kDa FITC-dekstran ile standart eğri seyreltme serisi hazırlayın. Her seyreltme için, üç kopya halinde 96 oyuklu bir plakaya 50 μL pipetleyin.NOT: 0 ila 0,5 mg/mL arasında değişen bir dizi 5-7 seyreltme oluşturulması önerilir. 495 nm’lik bir uyarma dalga boyunda ve 535 nm’lik emisyon dalga boyunda önceden kalibre edilmiş bir mikroplaka okuyucuda standartların floresan yoğunluğunu belirleyin. Standart bir eğri oluşturmak için floresan yoğunluğu sonuçlarıyla doğrusal regresyonu hesaplayın. İnkübatörden organoidden türetilmiş 2D tek tabaka(lar)a sahip hücre kültürü eklerini içeren plakayı alın. Değerlendirilecek organoidden türetilmiş 2D tek tabakayı içeren hücre kültürü ekinin apikal ve bazolateral odasından tek tabakalı kültür ortamını çıkarın. Her bir odayı 2x sırasıyla 200 μL (apikal oda) ve 500 μL (bazolateral oda) önceden ısıtılmış PBS ile nazikçe yıkayın. Yıkama solüsyonunu apikal hazneden çıkarın ve PBS’de 200 μL 0.5 mg / mL 4 kDa FITC-dekstran izleyiciyi hücre kültürü ekinin apikal odasına uygulayın. Nemlendirilmiş bir inkübatörde 37 °C ve% 5 CO2’de 20 dakika inkübe edin. İnkübe edilmiş 24 oyuklu plakanın bazolateral odasından 50 μL numune alın ve mikroplaka okuyucu uyumlu 96 oyuklu bir plakaya aktarın. Numune alınan kuyucuğun bazolateral haznesindeki 50 μL taze PBS’yi değiştirin. Hemen 495 nm uyarma dalga boyunda ve 535 nm emisyon dalga boyunda önceden kalibre edilmiş bir mikroplaka okuyucuda floresan yoğunluğu ölçümü yapın. 4.6-4.10 arasındaki adımları her 20 dakikada bir 120 dakikaya kadar tekrarlayın. Testin sonunda, 2D tek tabakanın korunması isteniyorsa, hem apikal hem de bazolateral odayı taze PBS 2x ile durulayın, taze tek tabakalı kültür ortamı ile değiştirin ve inkübe edin.NOT: 2D tek katmanların daha fazla değerlendirilmesi yapılabilir, yani TEER ölçümleri, immünofloresan boyama, vb.; Bununla birlikte, artık floresan izleyici muhtemel olduğundan ve analizi etkileyebileceğinden önerilmez. Aşağıdaki formülle görünür geçirgenlik katsayısını (Puygulaması) belirleyin:ΔQ / Δt = belirli bir süre boyunca tek tabakayı hücre kültürü ekinin bazolateral odasına geçiren, floresan yoğunluğu ile ölçülen ve standart eğri aracılığıyla μg/mL’ye tahmin edilen floresan izleyici konsantrasyonuA = hücre kültürü eklerinin yüzey alanıCo = hücre kültürü ekinin apikal odasına eklenen floresan izleyicinin μg/mL cinsinden konsantrasyonu 5. Organoid türevli 2D tek tabakanın immünofloresan boyaması Tek katmanlı kültür ortamını vakum emme ile hücre kültürü ekinden çıkarın ve 200 μL %4 paraformaldehit (PFA) ekleyin. Hücre fiksasyonu için oda sıcaklığında 15-30 dakika inkübe edin. PFA’yı vakumlu emişle çıkarın ve 100 μL PBS 2x ile yıkayın. PBS’de %2 sığır serum albümini (BSA) içinde 100 μL %0.3 Triton X-100 ile hücreleri oda sıcaklığında 10 dakika inkübe ederek geçirgen hale getirin. Süpernatanı vakumlu emme ile çıkarın ve 100 μL PBS 2x ile yıkayın. Süpernatanı çıkarın ve PBS’de% 2 BSA ile değiştirin ve bloke etmek için oda sıcaklığında 1 saat inkübe edin. Süpernatanı çıkarın, PBS’de% 2 BSA ile seyreltilmiş 100 μL primer antikor uygulayın ve oda sıcaklığında 1 saat veya gece boyunca 4 ° C’de inkübe edin.NOT: Kullanılan primer antikorların konsantrasyonları Malzeme Tablosunda yer almaktadır. Belirtilmedikçe, üreticinin tavsiyelerine uyulur. Süpernatanı çıkarın ve 100 μL PBS 3x ile yıkayın. PBS’de% 2 BSA içinde seyreltilmiş 100 μL ikincil antikor uygulayın ve oda sıcaklığında 1 saat veya gece boyunca 4 ° C’de inkübe edin.NOT: Kullanılan birincil antikor bir floresan probu ile konjuge edilmişse bu adım atlanabilir. Kullanılan ikincil antikorların konsantrasyonları Malzeme Tablosunda yer almaktadır. Belirtilmedikçe, üreticinin tavsiyelerine uyulur. Süpernatanı çıkarın ve 100 μL PBS 3x ile yıkayın. İsteğe bağlı: F-aktin ve çekirdeklerin (DAPI) karşı boyanması için, her iki probu PBS’de uygun seyreltmede (üreticinin tavsiyesine göre) karıştırarak hazırlayın, 100 μL uygulayın ve oda sıcaklığında 30 dakika inkübe edin. Süpernatanı çıkarın ve 100 μL PBS 3x ile yıkayın. Hücre kültürü yerleştirme zarını bir neşter bıçağıyla dikkatlice kesin ve bir montaj solüsyonu ile bir cam slayt üzerine monte edin. Bir kapak fişi yerleştirin ve gözlemleyin.

Representative Results

Bu protokol, in vivo bağırsak epitelinin karmaşıklığını taklit ederek, ince ve kalın bağırsak yolundan güvenilir bir şekilde sağlam sığır bağırsağı organoidinden türetilmiş 2D tek tabakalar oluşturur. Bu yöntem, optimize edilmiş koşullarla kültürlenmiş sağlıklı sığırların bağırsak kript örneklerinden geliştirilen olgun organoidleri kullanır. İlginç bir şekilde, organoid türevli 2D tek tabakalar için başarılı ve tekrarlanabilir koşullar, bağırsak segmentine özgüdür (Tablo 1). Bu, ilgilenilen bağırsak segmenti için optimize edilmiş kültür tekniklerine sahip olmanın önemini pekiştirir. Ayrışmış olgun organoidlerin bir hücre kültürü ekine tohumlanmasından 1 gün sonra, 2 boyutlu bir tek tabakanın oluştuğu görülmüştür (Şekil 2A). Bununla birlikte, bu ilk görünüme rağmen, hem ileal hem de rektal monotabakalar için TEER ölçümleri bu aşamada düşük kalmıştır (Şekil 1C). Ayrıca, bir paraselüler geçirgenlik testi, tek tabakanın, sadece 1 günlük kültürden sonra, hücre tabakası boyunca 4 kDa FITC-dekstran izleyicinin geçişine izin verdiğini ortaya koydu (Şekil 1C). Kültürün 3. gününe gelindiğinde, her iki organoid türevi 2D tek tabaka türü, artan TEER değerleri ve kültürün 5. gününe kadar devam eden bir eğilim olan 4 kDa FITC-dekstran izleyiciye karşı direnç ile kanıtlanan önemli olgunlaşma gösterdi. Benzer koşullar altında insan ve köpek muadillerine göre sığır organoidinden türetilmiş 2D tek katmanlı kültürlerin daha düşük TEER değerlerine rağmen 12,13,14,15 zarın bütünlüğünün bozulmadan kaldığı türler arası değişkenlik özellikle dikkate değerdir. Bu sonuç, tek tabakaların geçirgenlik deneylerindeki uygun tepkisinden çıkarılmıştır, bu da sığır örneklerindeki düşük TEER değerlerinin mutlaka bir bariyer fonksiyonu eksikliğini yansıtmadığını düşündürmektedir. Bu bütünlük, fonksiyonel bir epitel bariyeri için çok önemlidir ve TEER ölçümlerinin yanı sıra geçirgenlik testi sonuçlarının dikkatli bir şekilde yorumlanmasıyla etkili bir şekilde gösterilir. Taramalı elektron mikroskobu ile 2D tek tabakaların apikal yüzeyinde hücresel sınırın ve iyi gelişmiş mikrovillusların görselleştirilmesi, özel mikroanatomik yapıların görüntülenmesi, hem ileal hem de rektal organoid türevli 2D monotabakaların olgunlaşmasının daha da güçlendirilmesi (Şekil 2B). Ek olarak, 2D tek tabakaların immünofloresan boyaması, hem ileal (Şekil 3A) hem de rektal (Şekil 3B) organoid türevli 2D tek tabakalarda apikal fırça sınırı, bazolateral yapışma bağlantıları ve mukus üreten goblet hücrelerinin varlığını doğruladı. Bu sonuçlar, geliştirilen 2D tek tabakanın bileşim ve oluşum açısından karmaşık olduğunu, sadece sağlam bir bağırsak epitelinin temel özelliklerini ifade etmekle kalmayıp, aynı zamanda çok soylu bir hücresel popülasyondan oluştuğunu güçlendirmektedir. Başarılı 2D tek tabaka geliştirme, hücrelerin ECM’ye yapışmasına ve sağlam bir epitel tabakası oluşturmak için birleşme noktasına kadar büyümesine dayanır. Özellikle, hücre kültürü eki üzerindeki inkübasyon sırasında eşit olmayan bir ECM dağılımı veya yetersiz koşullar, hücre tabakasının, özellikle kenarları boyunca fark edilir şekilde kısmi ayrılmasına neden olabilir (Şekil 4Ai). Hücreler optimal yoğunluktan daha yüksek bir yoğunlukta tohumlanırsa veya tohumlama hücreleri kültür yüzeyi boyunca eşit olarak dağılmazsa, bu sorun daha da artar, bu senaryo genellikle organoidlerin tek bir hücre süspansiyonuna eksik ayrışmasından kaynaklanır. Bu tür eşit olmayan dağılım, tek tabaka içinde boşlukların oluşmasına ve/veya bir hücre kültürü ekinde 3D morfogeneze yol açabilir (Şekil 4Aii). Buna karşılık, hücrelerin yetersiz tohumlanması, beklenen kültür periyodu boyunca başarısız veya gecikmiş tek tabaka gelişimine neden olabilir, bu da istemeden 2D monotabaka sistemini kullanan sonraki çalışmaların verimliliğini etkiler (Şekil 4Aiii). Ayrıca, kültür sisteminin kirlenmesi, tek tabaka içinde boşlukların oluşmasına da yol açabilir ve bir zamanlar oluşan birleşik monotabakayı kültürün daha sonraki bir aşamasında bozabilir (Şekil 4Aiv). Sürekli TEER değerleri ve paraselüler geçirgenlik tepkisi, bu tahlillerden önce yukarıda belirtilen potansiyel başarısızlık nedenleriyle karşılaşılmamış olsa bile, agresif yıkama veya işleme tekniklerinden kaynaklanan hücre tabakasındaki bozulmalardan etkilenebilir (Şekil 4B). Bu nedenle, hücrelerin dikkatli bir şekilde ele alınması ve tek tabaka oluşumunun veya bozulmalarının değerlendirilmesi, sorun giderme stratejilerinin etkili bir şekilde uygulanması yoluyla organoid türevli 2D tek tabakaların başarılı bir şekilde geliştirilmesi için çok önemlidir. Şekil 2: Sığır ileal ve rektal organoid türevli 2D tek tabakaların mikroskobik karakterizasyonu. (A) Bir hücre kültürü eki üzerinde kültürün 1. ve 3. günlerinde (D1 ve D3) 2D tek tabakaların temsili faz kontrast mikroskobu görüntüleri. Ölçek çubuğu = 100 μm. (B) Alt (sol) ve daha yüksek (sağ) büyütmelere sahip 2B tek katmanların temsili taramalı elektron mikroskobu görüntüleri. Mikrovillus dahil olmak üzere ayrıntılı hücre yüzey yapısı, hem ileal (üst) hem de rektal (alt) tek tabakalarda takdir edilebilir. Sol ölçek çubuğu = 10 μm, sağ ölçek çubuğu = 2 μm. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın. Şekil 3: İleal ve rektal organoidlerden türetilen 2D tek tabakaların immünofloresan karakterizasyonu. (A, B) Panel (A) ileal, panel (B) ise rektal organoidleri gösterir. Solda, F-aktin lifleri, hücre iskeleti mimarisini ve apikal fırça kenarı oluşumunu gösteren Phalloidin (kırmızı) ile vurgulanmıştır. Ortadaki görüntü, hücre-hücre yapışmasının ve tek tabaka bütünlüğünün göstergesi olan E-kaderin (yeşil) ile işaretlenmiş adherens bağlantılarının bazolateral lokalizasyonunu yakalar. Sağda, müsin üreten kadeh hücrelerinin varlığı, ileal monotabakadaki müsinin apikal salgılanmasını gösteren bir z-yığını görüntüsü ile SNA (yeşil) ile tanımlanır. Tüm görüntülerdeki çekirdekler DAPI (mavi) ile boyandı. Ek olarak, tüm görüntülerdeki z-yığını görüntüleme, kültür eki içinde tek bir hücre katmanının oluşumunu daha da gösterir. Ölçek çubuğu = 25 μm. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın. Şekil 4: Optimal olmayan 2D tek tabaka oluşumunun karakterizasyonu. (A) (i) hücre kültürü ekinin kenarı boyunca tek tabakanın kısmi ayrılmasını gösteren temsili faz kontrast görüntüleri; (ii) 3D büyümenin gelişmesi ve tek tabaka içinde boşlukların oluşması; (iii) hücrelerin düzensiz yapışması olarak belirtilen optimal tohumlama yoğunluğundan daha düşük olması nedeniyle eksik veya gecikmiş tek tabaka oluşumu; ve (iv) daha sonraki aşamada, muhtemelen şüpheli kontaminasyondan kaynaklanan, bir kez oluşturulmuş 2D tek tabaka içinde boşlukların oluşması. Ölçek çubukları = 100 μm. (B) 3. günden sonra artan geçirgenlik profilleri ile birlikte azalan TEER ölçümleri, stabil ve fonksiyonel epitel bariyerlerinin oluşturulamadığını gösterir. Sonuçlar, iki teknik kopya ile yapılan tek bir deneyden elde edilen ortalamanın (SEM) ortalama ± standart hatası olarak sunulur. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın. Ek Şekil 1: ECM bazlı hidrojelde sığır bağırsağı organoid kültürlerinde yoğunluk değişimleri. ECM bazlı bir hidrojel içinde kültürlenen sığır bağırsak organoidleri; (A) yüksek yoğunluklu ve (B) düşük yoğunluklu. Ölçek çubuğu = 100 μm. Bu Dosyayı indirmek için lütfen buraya tıklayın. Ek Tablo 1: Özetlenmiş doku donör sinyalleri. Bu dosyayı indirmek için lütfen buraya tıklayın.

Discussion

Bağırsak sisteminin sağlığı, sığırların hem üretkenliği hem de genel refahı için çok önemlidir16. Organoidden türetilmiş 2D tek tabaka teknolojisinden yararlanan bilim adamları, artık sığır bağırsağı epitelinin karmaşık yapısını in vitro bir ortamda daha doğru bir şekilde taklit edebilirler5. Bu yenilikçi yaklaşım, çok hücreli soyları da dahil olmak üzere bağırsak astarının çeşitli hücresel bileşimini yeniden üretmekle kalmaz, aynı zamanda bağırsak fizyolojisini ve patolojisini anlamak için gerekli olan mukus salgısı ve mikrovillusun varlığı gibi temel fonksiyonel özellikleri de yakalar3. İleum ve rektum segmentleri için özel kültür protokollerinin geliştirilmesi, sığır bağırsak sağlığını inceleme kapasitesini önemli ölçüde artıran gelişmiş bir platformun ortaya çıkmasına neden olmuştur. Bu sofistike yaklaşım, zoonotik patojenler ve sığır bağırsak ortamı arasındaki etkileşimlerin ayrıntılı olarak araştırılmasını sağlar. Sığır bağırsak ekosisteminin benzersiz yönlerini in vitro olarak yakından çoğaltma ve inceleme yeteneği, hayvan sağlığını iyileştirmek ve zoonotik hastalıkların yayılmasını azaltmak için hedefli stratejiler geliştirmeye yönelik önemli bir adımdır.

Bununla birlikte, sığır bağırsak organoidlerini kullanarak başarılı bir 2D tek tabaka gelişimi sağlamak için, hem organoidlerin hem de ayrışmış tek hücrelerinin sağlığını ve canlılığını korumak çok önemlidir. Dikkatli kullanım ve stresin en aza indirilmesi, organoidlerin etkili bir şekilde büyümesi ve ardından işleyen bir tek tabakanın oluşturulması için gerekli olan hücre bütünlüğünün ve işlevselliğinin korunmasında çok önemlidir. Ayrıca, tek tip bir tek tabaka elde etmek, organoidlerin büyük kümeler oluşturmadan tek hücrelere başarılı bir şekilde ayrışmasına dayanır. Bu tür kümeler hücre dağılımını bozabilir ve tek tabakanın yapısını tehlikeye atabilir. Bu nedenle, düzgün ayrışma için kesin teknikler kullanmak çok önemlidir ve bu da tutarlı bir tek hücreli süspansiyon ile sonuçlanır. Ek olarak, hücre yapışması sırasında ve fazla yapışmayan hücreleri yıkarken bozuklukları en aza indirmek faydalı olur. Bu yaklaşım, 3D morfogenez ile ilgili potansiyel sorunları ele almak ve böylece tek katmanın genel kalitesini artırmak için özellikle önemlidir.

Biyolojik kökenli ECM bazlı hidrojellerle ilgili kayda değer bir zorluk, bileşim17’deki partiden partiye varyasyondur. Bu, açıklanan protokoller ve malzemeler kullanılarak gözlemlenmemiş olsa da, ECM bileşimindeki partiden partiye varyasyonlar, başarılı tek katmanlı geliştirme için zorluklar doğurabilir. ECM ürünleri, markaları veya lot numaraları değiştiğinde tek tabaka oluşumu tehlikeye girerse, hücre kültürü eklerini kaplamak için gereken uygun ECM konsantrasyonunu belirlemek için optimizasyon adımları gerekli olabilir.

Ayrıca, herhangi bir değişiklik yapmadan önce kültür ortamını oda sıcaklığına ayarlamak, termal şoku azaltmaya, hücre sağlığını korumaya ve hem organoid hem de tek katmanlı kültürlerin kalitesini korumaya yardımcı olan kritik bir adımdır. Nazik yıkama uygulamaları, oluşumu ve sonraki tahliller sırasında tek tabakanın bütünlüğünün korunmasında da çok önemlidir ve bozulmalardan kaçınmak, sonuçlardaki yanlışlıkları önleyebilir. PBS’nin Hank’in Dengeli Tuz Çözeltisi (HBSS) ile ikame edilmesi, paraselüler geçirgenlik deneylerinde olduğu gibi, tekrar yıkama veya PBS’ye uzun süre maruz kalma sırasında bir sorun haline geldiğinde tek tabaka ayrılmasını en aza indirmede yardımcı göründü. Son olarak, kültür ortamının, ileum ve rektum gibi bağırsak sisteminin farklı segmentlerinden gelen hücrelerin özel ihtiyaçlarını karşılayacak şekilde uyarlanması, in vivo koşulların doğru bir şekilde çoğaltılması için gereklidir. Bu özgüllük, sığır bağırsak fizyolojisinin ve patojenlerle etkileşimlerin hassas bir şekilde modellenmesini kolaylaştırarak optimal hücre sağlığı ve işlevselliği sağlar, böylece organoid araştırmalarındaki bu kritik adımları vurgular.

Nazik bir hücre işleme uygulaması kullanmanın yanı sıra, hücre sayımı ve TEER ölçümleriyle ilişkili iyi bir teknik yeterlilik oluşturmak, işleyen bir 2D tek katmanın başarılı bir şekilde geliştirilmesi için çok önemlidir. Hücrelerin sırasıyla fazla veya az sayılmasından kaynaklanan hem çok düşük hem de çok yüksek tohumlama yoğunlukları, tek katmanlı büyümenin bozulmasına neden olabilir. Yanlış tohumlama yoğunluklarından şüphelenilen durumlarda hücre sayımlarının dikkatli bir şekilde gözden geçirilmesi ve uygun tohumlama yoğunluğunun sağlanması teşvik edilir. Ek olarak, yetersiz TEER ölçüm teknikleri, elektrotlarla yanlışlıkla çizikler nedeniyle tek tabakanın bozulmasına neden olabilir. Elektrotları apikal odaya dikkatlice sokmak ve membran yüzeyine göre dikey yönelimlerini korumaya özellikle dikkat etmek, tek tabakaların kazara hasar görme riskini azaltmaya yardımcı olabilir.

Burada tarif edilen paraselüler geçirgenlik deneyi yöntemleri, önceki bir protokoldenuyarlanmıştır 18. Sonuçların doğruluğunu ve güvenilirliğini artırmak için 120 dakika boyunca birden fazla numune almayı ve numune alınan alikotun eşit miktarda PBS ile değiştirilmesini içeren rapor edilen protokolde yapılan değişiklikler yapılır. Hazne içindeki toplam hacmin korunması birkaç nedenden dolayı kritik öneme sahiptir: ozmotik dengeyi korur, hücre bütünlüğünü sağlar, doğru geçirgenlik değerlendirmesi için gerekli olan konsantrasyon gradyanını korur ve taşıma hızlarını etkileyebilecek hidrostatik basınçtaki değişiklikleri önler. Bazolateral odanın, örneklenen floresan izleyici içeren PBS’nin hacmine eşdeğer taze PBS ile doldurulması uygulaması, bu koşulların korunması için çok önemlidir ve tek tabaka geçirgenliğinin doğru ve anlamlı bir şekilde değerlendirilmesini sağlar. Paraselüler geçirgenlik testi, izleyici moleküllerin doğrudan tek tabaka boyunca hareketini değerlendirerek TEER ölçümünün bir tamamlayıcısı olarak hizmet eder. Ayrıca, TEER değerlerinin çeşitli laboratuvarlarda karşılaştırılması, bu değerler sıcaklık ve hücre tipleri, geçiş sayıları ve kültür ortamının bileşimi dahil olmak üzere hücrelerin kültürlendiği spesifik koşullar gibi çok sayıda değişkenden etkilenebileceğinden, ilgili bilgiler vermeyebilir19. Paraselüler geçirgenlik testi, bir epitel bariyeri20 içindeki aderenlerin ve sıkı bağlantıların etkili ekspresyonunun işlevsel bir in vitro değerlendirmesini sağlar.

3D organoidlerden 2D tek katmanların geliştirilmesi, kültür teknolojisinde önemli bir ilerlemeyi temsil etse de, 2D tek katmanlarla ilişkili sınırlamaları kabul etmek önemlidir. En büyük dezavantajlardan biri, bunun in vivo ortamda bulunan dinamik stimülasyondan yoksun statik bir kültür sistemi olarak kalmasıdır. Ek olarak, kültür sistemi içindeki oksijen içeriğinin değiştirilmesi, kapaklı kültür plakalarını içeren açık kurulumu nedeniyle zorluklar sunar ve bu da onu anaerobik bakterilerle uzun süreli ko-kültür için daha az uygun hale getirir. Bu sınırlamalar, daha kontrollü ve fizyolojik olarak ilgili bir ortam sunan mikroakışkan sistemler21 gibi daha dinamik kültür platformlarının benimsenmesiyle potansiyel olarak ele alınabilir. Ayrıca, mevcut kültür koşullarının kök hücre büyümesini sürdürmek için faydalı besinler açısından zengin olmasına rağmen, epitel hücrelerinin fizyolojik farklılaşmasını indüklemek için optimal olmayabileceğini kabul etmek çok önemlidir. Bu tutarsızlık, in vivo koşulları yakından taklit etmek ve farklılaşma sürecini desteklemek için gelecekteki araştırmalarda optimizasyon ihtiyacını vurgulamaktadır. Bu sınırlamaları ele alarak ve bu yaklaşımları geliştirerek, organoid kültür teknolojilerinin faydası ve uygulanabilirliği arttırılmakta ve gastrointestinal sistemin karmaşık dinamiklerini ve etkileşimlerini in vitro olarak çoğaltmaya daha da yaklaşmaktadır.

Sığır ileal ve rektal dokulardan 2D tek tabakalar oluşturma protokolü, araştırmacılara hem ince hem de kalın bağırsak epitelinin luminal arayüzünün değerli bir in vitro modelini sunar. Bu model, temel hayvan besleme çalışmalarında, özellikle besin maddelerinin çeşitli koşullar altında nasıl emildiğinin incelenmesinde uygulama için geniş olanaklar sunmaktadır. Dikkate değer bir ilgi alanı, gastrointestinal geçirgenlikte anormal bir artış ile karakterize edilen, genellikle diyet değişimleri ve aşırı çevresel sıcaklıklar tarafından tetiklenen sızdıran bağırsak sendromunun araştırılmasıdır22,23. Ayrıca bu model, bağırsak mikrobiyomu ile konakçısı arasındaki karmaşık etkileşimleri keşfetmek için önemli bir araç olarak hizmet eder. Kommensal mikroorganizmaların konakçı organizmanın sağlığını nasıl etkileyebileceğinin araştırılmasına izin vererek, veterinerlik ve tıp biliminin çok önemli bir yönünü ele alır 1,24. Ek olarak, insan gıda kaynaklı patojenler sıklıkla sığır bağırsağının farklı segmentlerinde kommensal olarak bulunur 8,9,25, bu protokol, bu zoonotik ajanların kendi nişlerinde gelişmesine izin veren spesifik koşulların ayrıntılı olarak incelenmesini sağlar.

Bu çalışma boyunca, rektal ve ileal organoid türevli tek tabakaların başarılı bir gelişim için farklı koşullara ihtiyaç duyduğu gözlendi. Spesifik olarak, rektal organoid türevli tek tabakalar başlangıçta 1 saat boyunca bazal ortamda %2 ECM bazlı hidrojel ile hazırlanan hücre kültürü ekleri üzerine eklendiğinde, büyük delikler ve hücre soyulması kaydedildi. Bu sorun, özel bir rektal monotabaka kültür ortamına geçilerek ve inkübasyon süresi tohumlamadan önceki gece boyunca uzatılarak çözülürken, ileal organoid türevli monotabakalar daha kısa bir hazırlık protokolü kullanılarak başarılı bir şekilde geliştirildi. Ayrıca, kültür ortamına CHIR99021 eklenmesi, rektal tek tabakaların26 oluşumunu sürekli olarak iyileştirdi, ancak ileal tek tabakalar27 için gerekli değildi. Ek olarak, ileal tek tabakalar, rektal organoidlere kıyasla başarılı bir gelişim için daha yüksek bir hücre yoğunluğu gerektiriyordu27. Bu optimize edilmiş koşullar (Tablo 1), kültür koşullarının spesifik bağırsak segmentine göre uyarlanmasının önemini vurgulayan, dirençli bariyer bütünlüğünü koruyan tek tabakaları tekrar tekrar geliştirmiştir.

İn vivo bağırsağın çok hücreli soy karmaşıklığını doğru bir şekilde yansıtan bir modele erişim, bu araştırmalar için kritik öneme sahiptir. Araştırmacıların bağırsak ortamının doğal koşullarını yakından taklit etmelerine olanak tanıyarak deneyler için daha güvenilir bir temel sağlar. Bu protokol ile araştırmacılar, araştırma yeteneklerini geliştiren ve potansiyel olarak çalışma alanlarında çığır açan keşiflere yol açan sağlam bir modelle donatılmıştır. Bu yaklaşım sadece bağırsak sağlığı ve hastalığının anlaşılmasına katkıda bulunmakla kalmaz, aynı zamanda hayvancılık yönetimi ve gıda güvenliğini iyileştirmek için stratejilerin geliştirilmesine de yardımcı olur.

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Bu çalışma kısmen Ulusal Sağlık Enstitüleri Direktörü Ofisi (K01OD030515 ve YMA’ya R21OD031903) ve WSU VCS Yerleşik ve Lisansüstü Öğrenci Araştırma Bursu (GDD’ye) tarafından desteklenmiştir. Yazarlar, katılımcı mezbahaya donör sığır tedarik ettiği için teşekkür eder.

Materials

Basal Medium
Advanced DMEM/F12 (1X) Gibco 12634-010 n/a
GlutaMAX-I (100X) Gibco 35050-061 2 mM
HEPES (1M) Gibco 15630-080 10 mM
Pen Strep Glutamine (100X) Gibco 10378-016 1X
Organoid Culture Medium (Supplements to Basal Medium)
A-83-01 Sigma-Aldrich SML0788-5MG 500 nM
B27 Supplement (50X) Gibco 17504-001 1X
[Leu15]-Gastrin I human Sigma-Aldrich G9145-.5MG 10 nM
Murine EGF PeproTech 315-09-500UG 50 ng/mL
Murine Wnt-3a PeproTech 315-20-10UG 100 ng/mL
N-Acetyl-L-cysteine MP Biomedicals 194603 1 mM
N-2 MAX Media Supplement (100X) R&D Systems AR009 1X
Nicotinamide Sigma-Aldrich N0636-100G 10 mM
Noggin Conditioned Medium n/a n/a 10 vol/vol %
Primocin InvivoGen ant-pm-2 100 µg/mL
R-Spondin-1 Conditioned Medium n/a n/a 20 vol/vol %
SB202190 Sigma-Aldrich S7067-25MG 10 µM
Monolayer Culture Medium (Supplements to Organoid Culture Medium)
CHIR99021 Sigma-Aldrich SML1046-5MG 2.5 µM
HI FBS Gibco 10438-034 20 vol/vol %
LY2157299 Sigma-Aldrich SML2851-5MG 500 nM
Y-27632 StemCellTechnologies 72308 10 µM
Reagents
Alexa Fluor 488 Mouse anti-E-cadherin BD Biosciences 560061 1:200 dilution
Alexa Fluor 647 Phalloidin Invitrogen A22287 1:400 dilution
BSA Cytiva SH30574.02 2 w/vol %
Cell Recovery Solution Corning 354253 n/a
DAPI Solution (1 mg/mL) Thermo Scientific 62248 1:1000 dilution
DPBS (1X) Gibco 14190-144 n/a
Fluorescein Isothiocyanate–Dextran Sigma-Aldrich FD4-100MG 0.5 mg/mL
Matrigel Matrix Corning 354234 n/a
Paraformaldehyde Solution (4%) Thermo Scientific J19943K2 n/a
ProLong Gold antifade reagent Invitrogen P36930 n/a
SNA, EBL, Fluorescein Vector Laboratories FL-1301 1:100 dilution
Triton X-100 Thermo Scientific A16046.AE 0.3 vol/vol %
TrypLE Express Gibco 12605-028 n/a
Trypan Blue Solution, 0.4% VWR Life Science K940-100ML n/a
Materials and Equipment
0.4 µm Cell Culture Insert Falcon 353095
24-well Cell Culture Plate Corning 3524
48-well Cell Culture Plate Thermo Scientific 150687
70 µm Sterile Cell Strainer Fisher Scientific 22-363-548
96-well Cell Culture Plate Greiner Bio-One 655086
Centrifuge Eppendorf 5910Ri
CO2 Incubator Thermo Scientific 370
Epithelial Volt-Ohm Meter Millipore Millicell ERS-2
Hemocytometer LW Scientific CTL-HEMM-GLDR
Inverted Confocal Microscope Leica Microsystems SP8-X
Inverted Phase-Contrast Microscope Leica Microsystems DMi1
Microscope Cover Glass Fisher Scientific 12-540-B
Microplate Reader Molecular Devices SpecrtraMax i3x
Microscope Slides Fisher Scientific 22-034-486
Pasteur Pipets Fisher Scientific 13-678-20C
Scalpel Blade iMed Scientific – #11 carbon steel
Vortex Mixer Scientific Industries SI-0236
Software
LAS X imaging software Leica Microsystems LAS X 3.7.6.25997
Microplate Reader software Molecular Devces SoftMax Pro 7.1.2
DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Min, S., Kim, S., Cho, S. W. Gastrointestinal tract modeling using organoids engineered with cellular and microbiota niches. Exp Mol Med. 52 (2), 227-237 (2020).
  2. Fitzgerald, S. F., et al. Shiga toxin sub-type 2a increases the efficiency of Escherichia coli O157 transmission between animals and restricts epithelial regeneration in bovine enteroids. PLoS Pathogens. 15 (10), e1008003 (2019).
  3. Dutta, D., Heo, I., Clevers, H. Disease modeling in stem cell-derived 3D organoid systems. Trend Mol Med. 23 (5), 393-410 (2017).
  4. Beaumont, M., et al. Intestinal organoids in farm animals. Vet Res. 52 (1), 33 (2021).
  5. Kawasaki, M., Dykstra, G. D., McConnel, C. S., Burbick, C. R., Ambrosini, Y. M. Adult bovine-derived small and large intestinal organoids: In vitro development and maintenance. J Tissue Eng Regene Med. 2023, e3095002 (2023).
  6. Kvidera, S. K., et al. Intentionally induced intestinal barrier dysfunction causes inflammation, affects metabolism, and reduces productivity in lactating Holstein cows. J Dairy Sci. 100 (5), 4113-4127 (2017).
  7. Crawford, C. K., et al. Inflammatory cytokines directly disrupt the bovine intestinal epithelial barrier. Sci Rep. 12 (1), 14578 (2022).
  8. Heredia, N., García, S. Animals as sources of food-borne pathogens: A review. Animal Nutri. 4 (3), 250-255 (2018).
  9. Naylor, S. W., et al. Lymphoid follicle-dense mucosa at the terminal rectum is the principal site of colonization of enterohemorrhagic Escherichia coli O157:H7 in the bovine host. Infect Immun. 71 (3), 1505-1512 (2003).
  10. Co, J. Y., et al. Controlling epithelial polarity: A human enteroid model for host-pathogen interactions. Cell Rep. 26 (9), 2509-2520.e4 (2019).
  11. Pullinger, G. D., et al. Systemic translocation of Salmonella enterica Serovar Dublin in cattle occurs predominantly via efferent lymphatics in a cell-free niche and requires type III secretion system 1 (T3SS-1) but not T3SS-2. Infect Immun. 75 (11), 5191-5199 (2007).
  12. Nickerson, K. P., et al. A versatile human intestinal organoid-derived epithelial monolayer model for the study of enteric pathogens. Microbiol Spectr. 9 (1), e0000321 (2021).
  13. Varani, J., McClintock, S. D., Aslam, M. N. Cell-matrix interactions contribute to barrier function in human colon organoids. Front Med. 9, 838975 (2022).
  14. Freire, R., et al. Human gut derived-organoids provide model to study gluten response and effects of microbiota-derived molecules in celiac disease. Sci Rep. 9, 7029 (2019).
  15. Ambrosini, Y. M., et al. Recapitulation of the accessible interface of biopsy-derived canine intestinal organoids to study epithelial-luminal interactions. PLoS ONE. 15 (4), e0231423 (2020).
  16. Kogut, M. H., Arsenault, R. J. Editorial: Gut health: The new paradigm in food animal production. Front Vet Sci. 3, 71 (2016).
  17. Lingard, E., et al. Optimising a self-assembling peptide hydrogel as a Matrigel alternative for 3-dimensional mammary epithelial cell culture. Biomater Adv. 160, 213847 (2024).
  18. Turksen, K. . Permeability Barrier: Methods and Protocols. , (2011).
  19. Srinivasan, B., et al. TEER measurement techniques for in vitro barrier model systems. J Lab Autom. 20 (2), 107-126 (2015).
  20. Frost, T. S., Jiang, L., Lynch, R. M., Zohar, Y. Permeability of epithelial/endothelial barriers in Transwells and microfluidic bilayer devices. Micromachines. 10 (8), 533 (2019).
  21. Bein, A., et al. Microfluidic organ-on-a-chip models of human intestine. Cell Mol Gastroenterol Hepatol. 5 (4), 659 (2018).
  22. Sanz-Fernandez, M. V., et al. Targeting the hindgut to improve health and performance in cattle. Animals. 10 (10), 1817 (2020).
  23. Gressley, T. F., Hall, M. B., Armentano, L. E. Ruminant nutrition symposium: Productivity, digestion, and health responses to hindgut acidosis in ruminants. J Anim Sci. 89 (4), 1120-1130 (2011).
  24. O’Hara, E., Neves, A. L. A., Song, Y., Guan, L. L. The role of the gut microbiome in cattle production and health: Driver or passenger. Ann Rev Animal Biosci. 8 (2020), 199-220 (2020).
  25. Beach, J. C., Murano, E. A., Acuff, G. R. Prevalence of Salmonella and Campylobacter in beef cattle from transport to slaughter. J Food Protect. 65 (11), 1687-1693 (2002).
  26. Kawasaki, M., Ambrosini, Y. M. Accessible luminal interface of bovine rectal organoids generated from cryopreserved biopsy tissues. PLoS One. 19 (3), e0301079 (2024).
  27. Kawasaki, M., McConnel, C. S., Burbick, C. R., Ambrosini, Y. M. Pathogen-epithelium interactions and inflammatory responses in Salmonella Dublin infections using ileal monolayer models derived from adult bovine organoids. Scientific Reports. 14 (1), 11479 (2024).

Tags

BovineOrganoidIntestinalMonolayerGastrointestinalIn Vitro ModelEpitheliumTransepithelialPermeabilityImmunocytochemistryPhysiologyPublic HealthBiomedicalTranslational ResearchAgricultureAnimal WelfareFood Safety

Play Video
PDF
DOI
DOWNLOAD MATERIALS LIST
Cite This Article
Dykstra, G. D., Kawasaki, M., Ambrosini, Y. M. Advancements in Bovine Organoid Technology Using Small and Large Intestinal Monolayer Interfaces. J. Vis. Exp. (208), e67010, doi:10.3791/67010 (2024).
Download Citation
Reprints and Permissions

View Video

✖

To prove you're not a robot, please enter the text in the image below

CAPTCHA Image
Play CAPTCHA Audio
Refresh Image