Identification de lymphocytes T rares spécifiques de l’antigène dans des poumons de souris avec un peptide : tétramères du complexe majeur d’histocompatibilité

Au cœur du système immunitaire adaptatif se trouve la capacité d’un lymphocyte T à reconnaître et à répondre à un antigène spécifique. Le moment et l’endroit où un lymphocyte T répond à son antigène apparenté déterminent l’équilibre entre l’infection et l’auto-immunité, l’homéostasie et le cancer, la santé et la maladie¹. Il s’ensuit que l’étude des lymphocytes T dans un contexte spécifique d’immunité devrait se concentrer sur les cellules présentant une spécificité pour un antigène pertinent d’intérêt. Parmi les avancées technologiques qui ont considérablement amélioré la capacité à caractériser les populations de lymphocytes T spécifiques de l’antigène, on trouve des multimères solubles marqués par fluorescence (généralement des tétramères) de molécules de classe I ou de classe II de complexes majeurs d’histocompatibilité (CMH) complexées à des épitopes de peptides antigéniques, mieux connus sous le nom de « tétramères peptides :CMH »2,3,4,5 . En représentant les ligands naturels des récepteurs de l’antigène des lymphocytes T (TCR), les tétramères peptide :CMH de classe I et de classe II permettent d’identifier directement les lymphocytes T CD8⁺ et CD4⁺ spécifiques de l’antigène, respectivement, dans le répertoire endogène des lymphocytes T du système immunitaire sans qu’il soit nécessaire de répondre à la stimulation de l’antigène dans un essai. Les tétramères représentent une approche plus élégante de l’étude des lymphocytes T spécifiques de l’antigène que les modèles de transfert adoptif de lymphocytes T transgéniques TCR⁶, et ont été de plus en plus utilisés pour identifier les populations de lymphocytes T étrangers et auto-spécifiques de l’antigène dans des modèles murins expérimentaux et des maladies humaines ^4,5.

Alors que les tétramères peuvent facilement identifier les populations à haute fréquence de lymphocytes T qui se sont développées en réponse à la stimulation de l’antigène, leur utilisation pour les lymphocytes T naïfs, spécifiques de l’antigène ou mémoire est limitée par les très faibles fréquences de ces populations⁷. Notre groupe et d’autres ont développé et popularisé des stratégies d’enrichissement magnétique basées sur les tétramères qui augmentent la sensibilité de la détection pour permettre l’étude de ces populations cellulaires dans les tissus lymphoïdes de souris 8,9,10,11.

L’émergence des lymphocytes T résidents dans les tissus sur le terrain a mis l’accent sur le développement de nouvelles façons d’étudier les lymphocytes T dans l’espace non lymphoïde. Comme de nombreuses autres surfaces muqueuses, les lymphocytes T des poumons rencontrent une gamme d’antigènes propres et étrangers dérivés de l’épithélium de l’hôte, des microbes commensales et infectieux et des entités environnementales, y compris les allergènes. L’analyse transcriptionnelle des lymphocytes T prélevés dans des tissus non lymphoïdes (NLT) démontre un phénotype de type mémoire qui porte un destin et une fonction spécifiques aux tissus uniques, souvent dirigés vers le trafic et l’homéostasie tissulaire¹². De plus, les lymphocytes T mémoires (Trms) résidents des tissus ont tendance à être plus limités par le clonage que ceux en circulation¹³. Il est essentiel de déterminer comment et pourquoi les antigènes entraînent la résidence des lymphocytes T dans la NLT pour comprendre comment le système immunitaire protège contre les infections, maintient l’homéostasie tissulaire et, parfois, se transforme en auto-immunité. Cependant, il semble y avoir une plus grande attrition parmi les lymphocytes T résidents des tissus des poumons par rapport aux autres NLT¹⁴. En conséquence, la capacité d’identifier et de caractériser les lymphocytes T endogènes du poumon avec une spécificité antigénique donnée est limitée par leur rareté inhérente.

En combinant l’utilisation de techniques d’enrichissement cellulaire à base de billes magnétiques et la coloration peptide :CMH tétramère, nous avons réussi à détecter des cellules T spécifiques de l’antigène du soi élargies mais rares dans les poumons de souris^15,16. Nous présentons ici une description détaillée d’un protocole que nous avons optimisé pour isoler et caractériser de manière fiable toute population rare de lymphocytes T spécifiques de l’antigène présente dans les poumons de souris (Figure 1). Ce protocole comprend une étape de coloration des anticorps in vivo pour distinguer les cellules T résidentes des cellules T vasculaires¹⁷, suivie de deux méthodes différentes de traitement des tissus pulmonaires pour tenir compte de la disponibilité des ressources. S’ensuit une étape générale d’enrichissement magnétique des lymphocytes T, une coloration au tétramère et une analyse par cytométrie en flux. La viabilité cellulaire et la coloration des tétramères sont encore améliorées dans ce protocole par l’ajout d’aminoguanidine, qui bloque l’apoptose¹⁸ induite par l’activation des lymphocytes T induite par l’oxyde nitrique synthase (iNOS) et le dasatinib qui limite la régulation négative du TCR¹⁹. Les étapes mises en évidence dans ce protocole utilisent des techniques courantes et des réactifs facilement disponibles, ce qui le rend accessible à presque tous les chercheurs engagés dans l’immunologie des lymphocytes T de souris et est hautement adaptable à une variété d’analyses en aval. Bien qu’il soit peu probable que les lymphocytes T naïfs soient trouvés dans les poumons, nous pensons que ce protocole sera particulièrement utile pour l’étude des lymphocytes T spécifiques de l’antigène auto-spécifique et des Trms dans les poumons.

Figure 1 : Vue d’ensemble du flux de travail du protocole. Les poumons sont prélevés sur des souris et dissociés en cellules uniques. Les échantillons sont ensuite enrichis pour les lymphocytes T avant d’être colorés avec des tétramères peptide :CMH et des anticorps marqués par fluorescence pour l’analyse cytométrique en flux. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.