Fare Akciğerlerinden Nadir Antijene Özgü T Hücrelerinin Peptit ile Tanımlanması: Majör Histouyumluluk Kompleksi Tetramerleri
Summary
Manyetik boncuk bazlı T hücresi zenginleştirmesi ve peptit: majör histouyumluluk kompleksi (MHC) tetramerleri aracılığıyla fare akciğerlerindeki nadir antijene özgü T hücresi popülasyonlarını izole etmek ve tanımlamak için ayrıntılı bir protokol sunuyoruz.
Abstract
Sağlık ve hastalık sırasında antijene özgü T hücrelerinin tanımlanması ve karakterizasyonu, immün patofizyoloji anlayışımızı geliştirmenin anahtarı olmaya devam etmektedir. Endojen T hücresi repertuarı içinde antijene özgü T hücresi popülasyonlarının izlenmesinin teknik zorlukları, peptit: MHC tetramer reaktiflerinin geliştirilmesiyle büyük ölçüde ilerlemiştir. Antijenik peptit epitoplarına kompleks oluşturan MHC sınıf I veya sınıf II moleküllerin bu floresan olarak etiketlenmiş çözünür multimerleri, karşılık gelen T hücresi reseptörü (TCR) özgüllüğü ile doğrudan T hücrelerine bağlanır ve bu nedenle, ex vivo tarafından indüklenen fonksiyonel bir yanıta gerek kalmadan antijene özgü T hücresi popülasyonlarını doğal durumlarında tanımlayabilir Uyarım. Son derece nadir popülasyonlar için, tetramere bağlı T hücreleri, tespitin hassasiyetini ve güvenilirliğini artırmak için manyetik olarak zenginleştirilebilir.
Dokuda yerleşik T hücresi bağışıklığının araştırılması derinleştikçe, lenfoid olmayan dokulara giden ve bu dokularda bulunan antijene özgü T hücrelerinin tanımlanması için acil bir ihtiyaç vardır. Bu protokolde, fare akciğerlerinde bulunan antijene özgü T hücrelerinin izolasyonu ve karakterizasyonu için ayrıntılı bir talimat seti sunuyoruz. Bu, T hücrelerinin sindirilmiş akciğer dokusundan izole edilmesini, ardından genel bir T hücresi manyetik zenginleştirme adımını ve akış sitometrisi analizi ve sıralaması için tetramer boyamayı içerir. Bu protokolde vurgulanan adımlar, ortak teknikleri ve hazır reaktifleri kullanır, bu da onu fare T hücresi immünolojisi ile uğraşan hemen hemen her araştırmacı için erişilebilir kılar ve akciğerlerde bulunan herhangi bir düşük frekanslı antijene özgü T hücresi popülasyonunun çeşitli aşağı akış analizleri için oldukça uyarlanabilir.
Introduction
Adaptif bağışıklık sisteminin kalbinde, bir T hücresinin belirli bir antijeni tanıma ve ona yanıt verme yeteneği yatar. Bir T hücresinin aynı kökenli antijene ne zaman ve nerede yanıt verdiği, enfeksiyon ve otoimmünite, homeostaz ve kanser, sağlık ve hastalıkdengesini belirler 1. T hücrelerinin belirli bir bağışıklık bağlamında çalışmasının, ilgili bir antijen için özgüllüğü olan hücrelere odaklanması gerektiği sonucu çıkar. Antijene özgü T hücresi popülasyonlarını karakterize etme yeteneğini büyük ölçüde artıran teknolojik gelişmeler arasında, daha çok “peptit:MHC tetramerleri” olarak bilinen, antijenik peptit epitoplarına kompleks haline getirilmiş majör histouyumluluk kompleksi (MHC) sınıf I veya sınıf II moleküllerin floresan olarak etiketlenmiş çözünür multimerleri (genellikle tetramerler) bulunmaktadır2,3,4,5. T hücresi antijen reseptörlerinin (TCR’ler) doğal ligandlarını temsil ederek, peptit: MHC sınıf I ve sınıf II tetramerler, bir testte antijen stimülasyonuna yanıt gerektirmeden bağışıklık sistemindeki T hücrelerinin endojen repertuarı içinde sırasıyla antijene özgü CD8 + ve CD4 + T hücrelerini doğrudan tanımlamak için bir araç sağlar. Tetramerler, antijene özgü T hücrelerinin incelenmesinde TCR transgenik T hücresi evlat edinici transfer modellerinden6 daha zarif bir yaklaşımı temsil eder ve hem deneysel fare modellerinde hem de insan hastalığında yabancı ve kendi kendine antijene özgü T hücresi popülasyonlarını tanımlamak için giderek daha fazla kullanılmaktadır 4,5.
Tetramerler, antijen stimülasyonuna yanıt olarak genişlemiş olan yüksek frekanslı T hücresi popülasyonlarını kolayca tanımlayabilirken, naif, kendi kendine antijene özgü veya hafıza T hücreleri için kullanımları, bu popülasyonların çok düşük frekansları ile sınırlıdır7. Grubumuz ve diğerleri, fare lenfoid dokularında bu hücre popülasyonlarının incelenmesini sağlamak için tespit hassasiyetini artıran tetramer tabanlı manyetik zenginleştirme stratejileri geliştirmiş ve popüler hale getirmiştir8,9,10,11.
Alanda dokuda yerleşik T hücrelerinin ortaya çıkması, lenfoid olmayan boşlukta T hücrelerini araştırmak için yeni yollar geliştirmeye daha fazla vurgu yapmıştır. Diğer birçok mukozal yüzey gibi, akciğerlerdeki T hücreleri de konak epiteli, kommensal ve enfeksiyöz mikroplar ve alerjenler dahil olmak üzere çevresel varlıklardan türetilen bir dizi öz ve yabancı antijenle karşılaşır. Lenfoid olmayan dokudan (NLT) toplanan T hücrelerinin transkripsiyonel analizi, genellikle kaçakçılık ve doku homeostazına yönelik, dokuya özgü benzersiz kader ve işlev taşıyan hafıza benzeri bir fenotip gösterir12. Ayrıca, dokuda yerleşik bellek T hücreleri (Trm’ler), dolaşımdakilere göre daha klonal olarak sınırlı olma eğilimindedir13. Antijenlerin NLT’de T hücresi ikametgahını nasıl ve neden yönlendirdiğini belirlemek, bağışıklık sisteminin enfeksiyona karşı nasıl koruduğunu, doku homeostazını nasıl koruduğunu ve bazen otoimmüniteye nasıl dönüştüğünü anlamak için kritik öneme sahiptir. Bununla birlikte, akciğerlerden gelen dokuda yerleşik T hücreleri arasında diğer NLT14’e kıyasla daha fazla aşınma olduğu görülmektedir. Buna göre, akciğerin endojen T hücrelerini belirli bir antijen özgüllüğü ile tanımlama ve karakterize etme yeteneği, doğal nadirlikleri ile sınırlıdır.
Manyetik boncuk bazlı hücre zenginleştirme tekniklerinin kullanımını ve peptit: MHC tetramer boyamayı birleştirerek, fare akciğerlerinde genişlemiş ancak nadir görülen kendi kendine antijene özgü T hücrelerini tespit etmeyi başardık15,16. Burada, fare akciğerlerinde bulunan herhangi bir nadir antijene özgü T hücresi popülasyonunu güvenilir bir şekilde izole etmek ve karakterize etmek için optimize ettiğimiz bir protokolün ayrıntılı bir tanımını sunuyoruz (Şekil 1). Bu protokol, dokuda yerleşik olanı vasküler T hücrelerinden17 ayırt etmek için bir in vivo antikor boyama adımını ve ardından kaynak kullanılabilirliğini sağlamak için akciğer dokusu işleme için iki farklı yöntemi içerir. Bunu daha sonra genel bir T hücresi manyetik zenginleştirme adımı, tetramer boyama ve akış sitometrisi ile analiz takip eder. Hücre canlılığı ve tetramer boyama, bu protokolde, indüklenebilir nitrik oksit sentaz (iNOS) aracılı T hücresi aktivasyonunun neden olduğu apoptozu18 bloke eden aminoguanidin ve TCR aşağı regülasyonunusınırlayan Dasatinib 19 ilavesiyle daha da geliştirilmiştir. Bu protokolde vurgulanan adımlar, ortak teknikleri ve hazır reaktifleri kullanır, bu da onu fare T hücresi immünolojisi ile uğraşan hemen hemen her araştırmacı için erişilebilir kılar ve çeşitli aşağı akış analizleri için oldukça uyarlanabilir. Her ne kadar naif T hücrelerinin akciğerlerde bulunma olasılığı düşük olsa da, bu protokolün akciğerlerdeki öz antijene özgü T hücreleri ve Trm’lerin incelenmesi için özellikle yararlı olacağına inanıyoruz.
Şekil 1: Protokol iş akışına genel bakış. Akciğerler farelerden toplanır ve tek hücrelere ayrılır. Numuneler daha sonra peptit:MHC tetramerleri ve akış sitometrik analizi için floresan işaretli antikorlarla boyanmadan önce T hücreleri için zenginleştirilir. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Protocol
Representative Results
Discussion
Akciğerlerden alınan antijene özgü T hücrelerinin önceki karakterizasyonları, intranazal immünizasyon veya enfeksiyon gibi akut bir hazırlama olayını takiben genişleyen antijene özgü T hücrelerinin sağlam sayılarından yararlanmıştır 20,21,22. Bununla birlikte, kendi kendine antijene özgü T hücreleri veya dokuda yerleşik bellek T hücreleri gibi akciğerlerdeki daha nadir T hücresi popülasyonlarının, …
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Doku işleme ve tetramer üretimi ile ilgili teknik yardım için L. Kuhn’a teşekkür ederiz. Bu çalışma Ulusal Sağlık Enstitüleri (R01 AI107020 ve P01 AI165072 JJM, T32 AI007512 DSS), Massachusetts Patojen Hazırlık Konsorsiyumu (JJM) ve Massachusetts Genel Hastanesi Araştırma İcra Komitesi (JJM) tarafından finanse edilmiştir.
Materials
| 100 mm cell strainer | Fisher Scientific | 22-363-549 | |
| 10x PBS without Ca++ or Mg++ | Corning | 46-013-CM | |
| 1x PBS without Ca++ or Mg++ | Corning | 21-031-CV | |
| AccuCheck Counting Beads | Invitrogen | PCB100 | |
| Aminoguanidine Hemisulfate Salt | Sigma-Aldrich | A7009 | |
| CD90.2 microbeads, mouse | Miltenyi | 130-121-278 | |
| Cell separation magnet (MidiMACS Separator) | Miltenyi | 130-042-302 | Holds single LS column |
| Cell separation magnet (QuadroMACS Separator) | Miltenyi | 130-090-976 | Holds 4 LS columns |
| Dasatinib | Sigma-Aldrich | CDS023389 | |
| DNase I | Roche | 10104159001 | |
| Eagle’s Ham’s Amino Acids medium | Sigma-Aldrich | C5572 | |
| gentleMACS | Miltenyi | 130-093-235 | Automated tissue dissociator |
| gentleMACS C Tubes | Miltenyi | 130-093-237 | Automated tissue dissociator tubes |
| Hank's Balanced Salt Solution with Ca++ or Mg++ | Corning | 21-020-CM | |
| HEPES | Gibco | 15630080 | |
| Ketamine | Vedco | NDC 50989-996-06 | |
| Liberase TM | Roche | 5401119001 | |
| Pacific Blue anti-mouse CD45 antibody (Clone: 30-F11) | Biolegend | 103126 | |
| Paramagnetic cell separation columns (LS Columns) | Miltenyi | 130-042-401 | Comes with plunger |
| Purified anti mouse CD16/32 antibody (Clone: 93) | Biolegend | 101302 | |
| RPMI 1640 medium without L-glutamine | Corning | 15-040-CM | |
| Sodium Chloride 0.9% (Normal Saline) | Cytiva | Z1376 | |
| Xylazine | Pivetal | NDC 466066-750-02 |
References
- Sun, L., Su, Y., Jiao, A., Wang, X., Zhang, B. T cells in health and disease. Signal Transduct Target Ther. 8 (1), 235 (2023).
- Altman, J. D., et al. Phenotypic analysis of antigen-specific T lymphocytes. Science. 274 (5284), 94-96 (1996).
- Crawford, F., Kozono, H., White, J., Marrack, P., Kappler, J. Detection of antigen-specific T cells with multivalent soluble class II MHC covalent peptide complexes. Immunity. 8 (6), 675-682 (1998).
- Nepom, G. T., et al. HLA class II tetramers: tools for direct analysis of antigen-specific CD4 + T cells. Arthritis Rheum. 46 (1), 5-12 (2002).
- Davis, M. M., Altman, J. D., Newell, E. W. Interrogating the repertoire: broadening the scope of peptide-MHC multimer analysis. Nat Rev Immunol. 11 (8), 551-558 (2011).
- Moon, J. J., et al. Tracking epitope-specific T cells. Nat Protoc. 4 (4), 565-581 (2009).
- Jenkins, M. K., Moon, J. J. The role of naive T cell precursor frequency and recruitment in dictating immune response magnitude. J Immunol. 188 (9), 4135-4140 (2012).
- Moon, J. J., et al. Naive CD4(+) T cell frequency varies for different epitopes and predicts repertoire diversity and response magnitude. Immunity. 27 (2), 203-213 (2007).
- Obar, J. J., Khanna, K. M., Lefrancois, L. Endogenous naive CD8+ T cell precursor frequency regulates primary and memory responses to infection. Immunity. 28 (6), 859-869 (2008).
- Kotturi, M. F., et al. Naive precursor frequencies and MHC binding rather than the degree of epitope diversity shape CD8+ T cell immunodominance. J Immunol. 181 (3), 2124-2133 (2008).
- Legoux, F. P., Moon, J. J. Peptide:MHC tetramer-based enrichment of epitope-specific T cells. J Vis Exp. 68, 4420 (2012).
- Szabo, P. A., Miron, M., Farber, D. L. Location, location, location: Tissue resident memory T cells in mice and humans. Sci Immunol. 4 (34), eaas9673 (2019).
- Poon, M. M. L., et al. Tissue adaptation and clonal segregation of human memory T cells in barrier sites. Nat Immunol. 24 (2), 309-319 (2023).
- Wakim, M. Z. M., Zheng, L. M. Tissue resident memory T cells in the respiratory tract. Mucosal Immunol. 15 (3), 379-388 (2022).
- Legoux, F. P., et al. CD4+ T cell tolerance to tissue-restricted self antigens is mediated by antigen-specific regulatory T Cells rather than deletion. Immunity. 43 (5), 896-908 (2015).
- Shin, D. S., et al. Lung injury induces a polarized immune response by self-antigen-specific CD4(+) Foxp3(+) regulatory T cells. Cell Rep. 42 (8), 112839 (2023).
- Anderson, K. G., et al. Intravascular staining for discrimination of vascular and tissue leukocytes. Nat Protoc. 9 (1), 209-222 (2014).
- Vig, M., et al. Inducible nitric oxide synthase in T cells regulates T cell death and immune memory. J Clin Invest. 113 (12), 1734-1742 (2004).
- Lissina, A., et al. Protein kinase inhibitors substantially improve the physical detection of T-cells with peptide-MHC tetramers. J Immunol Methods. 340 (1), 11-24 (2009).
- Hogan, R. J., et al. Protection from respiratory virus infections can be mediated by antigen-specific CD4(+) T cells that persist in the lungs. J Exp Med. 193 (8), 981-986 (2001).
- Hogan, R. J., et al. Activated antigen-specific CD8+ T cells persist in the lungs following recovery from respiratory virus infections. J Immunol. 166 (3), 1813-1822 (2001).
- Zhao, J., et al. Airway memory CD4(+) T cells mediate protective immunity against emerging respiratory coronaviruses. Immunity. 44 (6), 1379-1391 (2016).
- Hondowicz, B. D., et al. Interleukin-2-dependent allergen-specific tissue-resident memory cells drive asthma. Immunity. 44 (1), 155-166 (2016).
- Jungblut, M., Oeltze, K., Zehnter, I., Hasselmann, D., Bosio, A. Standardized preparation of single-cell suspensions from mouse lung tissue using the gentleMACS Dissociator. J Vis Exp. 29, 1266 (2009).
- Faustino, L. D., et al. Interleukin-33 activates regulatory T cells to suppress innate gammadelta T cell responses in the lung. Nat Immunol. 21 (11), 1371-1383 (2020).
- Atif, S. M., Gibbings, S. L., Jakubzick, C. V. Isolation and identification of interstitial macrophages from the lungs using different digestion enzymes and staining strategies. Methods Mol Biol. 1784, 69-76 (2018).
- Pape, K. A., Taylor, J. J., Maul, R. W., Gearhart, P. J., Jenkins, M. K. Different B cell populations mediate early and late memory during an endogenous immune response. Science. 331 (6021), 1203-1207 (2011).
- Naeher, D., et al. A constant affinity threshold for T cell tolerance. J Exp Med. 204 (11), 2553-2559 (2007).
- Moon, J. J., et al. Quantitative impact of thymic selection on Foxp3+ and Foxp3- subsets of self-peptide/MHC class II-specific CD4+ T cells. Proc Natl Acad Sci U S A. 108 (35), 14602-14607 (2011).
- Koehli, S., Naeher, D., Galati-Fournier, V., Zehn, D., Palmer, E. Optimal T-cell receptor affinity for inducing autoimmunity. Proc Natl Acad Sci U S A. 111 (48), 17248-17253 (2014).
- Zhang, Z., Legoux, F. P., Vaughan, S. W., Moon, J. J. Opposing peripheral fates of tissue-restricted self antigen-specific conventional and regulatory CD4(+) T cells. Eur J Immunol. 50 (1), 63-72 (2020).
