ペプチド:主要組織適合遺伝子複合体四量体を用いたマウス肺由来の希少抗原特異的T細胞の同定

適応免疫系の中心には、T細胞が特定の抗原を認識して応答する能力があります。T細胞がいつ、どこでその同族抗原に応答するかによって、感染と自己免疫、恒常性と癌、健康と病気のバランスが決まります¹。したがって、免疫の特定の状況におけるT細胞の研究は、関心のある関連抗原に対する特異性を持つ細胞に焦点を当てるべきです。抗原特異的T細胞集団を特徴付ける能力を大幅に向上させた技術的進歩の中には、「ペプチド:MHC四量体」としてよく知られている抗原性ペプチドエピトープに複合体化された主要組織適合遺伝子複合体(MHC)クラスIまたはクラスII分子の蛍光標識可溶性多量体(通常は四量体)があります2,3,4,5 .ペプチド:MHCクラスIおよびクラスII四量体は、T細胞抗原受容体(TCR)の天然リガンドを発現することにより、免疫系のT細胞の内因性レパートリー内の抗原特異的CD8⁺およびCD4⁺ T細胞をそれぞれ直接同定する手段を提供します。四量体は、抗原特異的T細胞の研究において、TCRトランスジェニックT細胞養子導入モデル⁶よりもエレガントなアプローチであり、実験マウスモデルと^{ヒト疾患4,5}の両方で、外来および自己抗原特異的T細胞集団を同定するためにますます使用されています。

四量体は、抗原刺激に応答して増殖したT細胞の高頻度集団を容易に同定できますが、ナイーブT細胞、自己抗原特異的T細胞、またはメモリーT細胞への使用は、これらの集団の頻度が非常に低いために制限されます⁷。私たちのグループと他のグループは、マウスリンパ組織^8,9,10,11におけるこれらの細胞集団の研究を可能にするために、検出の感度を高める四量体ベースの磁気濃縮戦略を開発し、普及させました。

この分野での組織常在性T細胞の出現により、非リンパ性領域のT細胞を調査する新しい方法の開発にますます重点が置かれています。他の多くの粘膜表面と同様に、肺のT細胞は、宿主上皮、共生微生物および感染性微生物、およびアレルゲンを含む環境実体に由来するさまざまな自己抗原および外来抗原に遭遇します。非リンパ組織(NLT)から採取されたT細胞の転写解析は、しばしば人身売買と組織恒常性に向けられた、独特の組織特異的な運命と機能を持つ記憶のような表現型を示しています¹²。さらに、組織に常在するメモリーT細胞(Trms)は、循環中のT細胞よりもクローン性が制限される傾向がある¹³。NLTにおいて、抗原がどのように、そしてなぜT細胞の居住を促進するのかを明らかにすることは、免疫系がどのように感染から保護し、組織の恒常性を維持し、時には自己免疫に進化するかを理解するために重要です。しかし、肺からの組織常在性T細胞の消耗は、他のNLTと比較して大きいようです¹⁴。したがって、特定の抗原特異性を持つ肺の内因性T細胞を同定し、特徴付ける能力は、その固有の希少性によって制限されます。

磁気ビーズを用いた細胞濃縮技術とペプチド:MHC四量体染色を組み合わせることで、マウス肺において増殖しているがまれな自己抗原特異的T細胞を検出することに成功しました^15,16。ここでは、マウスの肺に存在する希少な抗原特異的T細胞集団を確実に単離し、特性評価するために最適化したプロトコールについて詳しく説明します(図1)。このプロトコールは、組織常在T細胞と血管T細胞を区別するためのin vivo抗体染色ステップ¹⁷と、それに続くリソースの利用可能性に対応するための肺組織処理のための2つの異なる方法を組み込んでいます。その後、一般的なT細胞磁気濃縮ステップ、四量体染色、フローサイトメトリーによる解析が行われます。このプロトコールでは、誘導性一酸化窒素合成酵素(iNOS)を介したT細胞活性化誘導性アポトーシスを阻害するアミノグアニジン¹⁸とTCRのダウンレギュレーションを制限するダサチニブ¹⁹を添加することにより、細胞生存率と四量体染色がさらに強化されます。このプロトコールで強調されているステップは、一般的な技術とすぐに利用できる試薬を利用しているため、マウスT細胞免疫学に従事するほぼすべての研究者がアクセスでき、さまざまなダウンストリーム分析に非常に適応性があります。ナイーブT細胞が肺に見つかる可能性は低いですが、このプロトコルは、肺の自己抗原特異的T細胞とTrmsの研究に特に役立つと考えています。

図1:プロトコルワークフローの概要。 肺はマウスから採取され、単一細胞に解離されます。その後、サンプルをT細胞に濃縮してから、ペプチド:MHC四量体および蛍光標識抗体で染色し、フローサイトメトリー分析を行います。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。