Identificazione di rare cellule T antigene-specifiche da polmoni di topo con tetrameri del complesso peptide:istocompatibilità maggiore

Al centro del sistema immunitario adattativo c’è la capacità di una cellula T di riconoscere e rispondere a un antigene specifico. Quando e dove una cellula T risponde al suo antigene affine determina l’equilibrio tra infezione e autoimmunità, omeostasi e cancro, salute e malattia¹. Ne consegue che lo studio delle cellule T in un contesto specifico di immunità dovrebbe concentrarsi sulle cellule con specificità per un antigene rilevante di interesse. Tra i progressi tecnologici che hanno notevolmente migliorato la capacità di caratterizzare popolazioni di cellule T antigene-specifiche vi sono multimeri solubili marcati in fluorescenza (solitamente tetrameri) di molecole di complesso maggiore di istocompatibilità (MHC) di classe I o di classe II complessate a epitopi peptidici antigenici, meglio noti come “tetrameri peptide:MHC”2,3,4,5 . Rappresentando i ligandi naturali dei recettori dell’antigene delle cellule T (TCR), i tetrameri peptide:MHC di classe I e II forniscono un mezzo per identificare direttamente le cellule T CD8⁺ e CD4⁺ antigene-specifiche, rispettivamente, all’interno del repertorio endogeno delle cellule T nel sistema immunitario senza la necessità di una risposta alla stimolazione dell’antigene in un test. I tetrameri rappresentano un approccio più elegante allo studio delle cellule T antigene-specifiche rispetto ai modelli di trasferimento adottivo delle cellule T transgeniche TCR⁶ e sono stati sempre più utilizzati per identificare popolazioni di cellule T estranee e auto-antigene-specifiche sia in modelli murini sperimentali che in malattie umane ^4,5.

Mentre i tetrameri possono facilmente identificare popolazioni ad alta frequenza di cellule T che si sono espanse in risposta alla stimolazione dell’antigene, il loro uso per le cellule T naive, auto-antigene-specifiche o di memoria è limitato dalle frequenze molto basse di queste popolazioni⁷. Il nostro gruppo e altri hanno sviluppato e reso popolari strategie di arricchimento magnetico basate su tetrameri che aumentano la sensibilità di rilevamento per consentire studi di queste popolazioni cellulari nei tessuti linfoidi di topo 8,9,10,11.

L’emergere di cellule T residenti nei tessuti in questo campo ha posto una maggiore enfasi sullo sviluppo di nuovi modi per studiare le cellule T nello spazio non linfoide. Come molte altre superfici mucose, le cellule T nei polmoni incontrano una serie di antigeni propri ed estranei derivati dall’epitelio ospite, dai microbi commensali e infettivi e dalle entità ambientali, compresi gli allergeni. L’analisi trascrizionale delle cellule T raccolte da tessuto non linfoide (NLT) dimostra un fenotipo simile alla memoria che ha un destino e una funzione tessuto-specifici unici, spesso diretti al traffico e all’omeostasi tissutale¹². Inoltre, le cellule T di memoria residenti nei tessuti (Trms) tendono ad essere più limitate clonalmente rispetto a quelle in circolazione¹³. Determinare come e perché gli antigeni guidano la residenza delle cellule T nella NLT è fondamentale per capire come il sistema immunitario protegge dalle infezioni, mantiene l’omeostasi dei tessuti e, a volte, si trasforma in autoimmunità. Tuttavia, sembra esserci un maggiore attrito tra le cellule T residenti nei tessuti dai polmoni rispetto ad altri NLT¹⁴. Di conseguenza, la capacità di identificare e caratterizzare le cellule T endogene del polmone con una data antigene-specificità è limitata dalla loro rarità intrinseca.

Combinando l’uso di tecniche di arricchimento cellulare basate su biglie magnetiche e la colorazione con tetramero peptide:MHC, siamo riusciti a rilevare cellule T auto-antigene specifiche espanse ma rare nei polmoni di topo^15,16. Qui, presentiamo una descrizione dettagliata di un protocollo che abbiamo ottimizzato per isolare e caratterizzare in modo affidabile qualsiasi rara popolazione di cellule T antigene-specifiche presente nei polmoni di topo (Figura 1). Questo protocollo incorpora una fase di colorazione degli anticorpi in vivo per distinguere le cellule T vascolari residenti nel tessuto¹⁷, seguita da due diversi metodi per l’elaborazione del tessuto polmonare per soddisfare la disponibilità di risorse. Questo è quindi seguito da una fase generale di arricchimento magnetico delle cellule T, dalla colorazione del tetramero e dall’analisi mediante citometria a flusso. La vitalità cellulare e la colorazione del tetramero sono ulteriormente migliorate in questo protocollo dall’aggiunta di aminoguanidina, che blocca l’apoptosi indotta dall’attivazione delle cellule T¹⁸ mediata dall’ossido nitrico sintasi (iNOS) e Dasatinib che limita la sottoregolazione del TCR¹⁹. Le fasi evidenziate in questo protocollo utilizzano tecniche comuni e reagenti prontamente disponibili, rendendolo accessibile a quasi tutti i ricercatori impegnati nell’immunologia delle cellule T di topo ed è altamente adattabile per una varietà di analisi a valle. Sebbene non sia probabile che le cellule T naive si trovino nei polmoni, riteniamo che questo protocollo sarà particolarmente utile per lo studio delle cellule T auto-antigene-specifiche e dei Trm nei polmoni.

Figura 1: Panoramica del flusso di lavoro del protocollo. I polmoni vengono prelevati dai topi e dissociati in singole cellule. I campioni vengono successivamente arricchiti per le cellule T prima della colorazione con tetrameri peptide:MHC e anticorpi marcati con fluorescenza per l’analisi citofluorimetrica. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.