Identificación de células T raras específicas de antígeno de pulmones de ratón con tetrámeros del complejo de histocompatibilidad peptídico:principal

En el corazón del sistema inmunitario adaptativo se encuentra la capacidad de una célula T para reconocer y responder a un antígeno específico. El momento y el lugar en que una célula T responde a su antígeno afín determina el equilibrio de la infección y la autoinmunidad, la homeostasis y el cáncer, la salud y^{la enfermedad.} De ello se deduce que el estudio de las células T en un contexto específico de inmunidad debe centrarse en las células con especificidad para un antígeno relevante de interés. Entre los avances tecnológicos que han mejorado en gran medida la capacidad de caracterizar las poblaciones de linfocitos T específicos de antígeno se encuentran los multímeros solubles marcados con fluorescencia (generalmente tetrámeros) de moléculas de clase I o clase II del complejo mayor de histocompatibilidad (MHC) complejadas con epítopos de péptidos antigénicos, más conocidos como “tetrámeros péptido:MHC”2,3,4,5 . Al representar los ligandos naturales de los receptores de antígenos de células T (TCR), los tetrámeros de clase I y clase II de péptido:MHC proporcionan un medio para identificar directamente las células T CD8⁺ y CD4⁺ específicas del antígeno, respectivamente, dentro del repertorio endógeno de células T en el sistema inmunitario sin necesidad de una respuesta a la estimulación del antígeno en un ensayo. Los tetrámeros representan un enfoque más elegante para el estudio de los linfocitos T específicos de antígeno que los modelos de transferencia adoptivos de linfocitos T transgénicos TCR⁶, y se han utilizado cada vez más para identificar poblaciones de linfocitos T extraños y autoespecíficos de antígeno tanto en modelos experimentales de ratón como en enfermedades humanas ^4,5.

Si bien los tetrámeros pueden identificar fácilmente poblaciones de alta frecuencia de células T que se han expandido en respuesta a la estimulación de antígenos, su uso para células T ingenuas, autoespecíficas de antígeno o de memoria está limitado por las frecuencias muy bajas de^{estas poblaciones}. Nuestro grupo y otros han desarrollado y popularizado estrategias de enriquecimiento magnético basadas en tetrámeros que aumentan la sensibilidad de la detección para permitir estudios de estas poblaciones celulares en tejidos linfoides de ratón 8,9,10,11.

La aparición de células T residentes en tejidos en el campo ha puesto un mayor énfasis en el desarrollo de nuevas formas de investigar las células T en el espacio no linfoide. Al igual que muchas otras superficies mucosas, las células T de los pulmones se encuentran con una serie de antígenos propios y extraños derivados del epitelio del huésped, microbios comensales e infecciosos, y entidades ambientales, incluidos los alérgenos. El análisis transcripcional de las células T recolectadas de tejido no linfoide (NLT) demuestra un fenotipo similar a la memoria que tiene un destino y una función únicos específicos del tejido, a menudo dirigidos al tráfico y la homeostasis tisular¹². Además, los linfocitos T de memoria residentes en los tejidos (Trms) tienden a estar más restringidos clonalmente que los que están en circulación¹³. Determinar cómo y por qué los antígenos impulsan la residencia de las células T en la NLT es fundamental para comprender cómo el sistema inmunitario protege contra las infecciones, mantiene la homeostasis de los tejidos y, a veces, se convierte en autoinmunidad. Sin embargo, parece haber una mayor deserción entre las células T residentes en el tejido de los pulmones en comparación con otras NLT¹⁴. En consecuencia, la capacidad de identificar y caracterizar las células T endógenas del pulmón con una especificidad antigénica dada está limitada por su rareza inherente.

Mediante la combinación del uso de técnicas de enriquecimiento celular basadas en perlas magnéticas y la tinción de tetrámero péptido:MHC, hemos logrado detectar células T específicas de antígeno propio expandidas pero raras en pulmones de ratón^15,16. Aquí, presentamos una descripción detallada de un protocolo que hemos optimizado para aislar y caracterizar de manera confiable cualquier población de células T específicas de antígeno raro presente en pulmones de ratón (Figura 1). Este protocolo incorpora un paso de tinción de anticuerpos in vivo para distinguir las células T vasculares residentes en el tejido¹⁷, seguido de dos métodos diferentes para el procesamiento del tejido pulmonar para adaptarse a la disponibilidad de recursos. A esto le sigue una etapa general de enriquecimiento magnético de células T, tinción con tetrámeros y análisis por citometría de flujo. La viabilidad celular y la tinción de tetrámeros se mejoran aún más en este protocolo mediante la adición de aminoguanidina, que bloquea la apoptosis¹⁸ inducida por la activación de las células T mediada por óxido nítrico sintasa (iNOS) y dasatinib, que limita la regulación negativa de TCR¹⁹. Los pasos destacados en este protocolo utilizan técnicas comunes y reactivos fácilmente disponibles, lo que lo hace accesible para casi cualquier investigador dedicado a la inmunología de células T de ratón y es altamente adaptable para una variedad de análisis posteriores. Aunque no es probable que las células T vírgenes se encuentren en los pulmones, creemos que este protocolo será particularmente útil para el estudio de las células T específicas de antígeno propio y las Trm en los pulmones.

Figura 1: Descripción general del flujo de trabajo del protocolo. Los pulmones se extraen de ratones y se disocian en células individuales. Posteriormente, las muestras se enriquecen para obtener células T antes de teñirlas con tetrámeros péptidos:MHC y anticuerpos marcados con fluorescencia para el análisis por citometría de flujo. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.