זיהוי תאי T נדירים ספציפיים לאנטיגן מריאות עכבר באמצעות פפטיד:טטרמרים מורכבים עיקריים של היסטותאימות

בלב מערכת החיסון הנרכשת נמצאת היכולת של תא T לזהות אנטיגן מסוים ולהגיב לו. מתי והיכן תא T מגיב לאנטיגן הקוגנטי שלו קובע את מאזן הזיהום והאוטואימוניות, הומאוסטזיס וסרטן, בריאות ומחלות¹. מכאן נובע כי המחקר של תאי T בהקשר ספציפי של חסינות צריך להתמקד בתאים עם ספציפיות עבור אנטיגן רלוונטי של עניין. בין הפיתוחים הטכנולוגיים ששיפרו מאוד את היכולת לאפיין אוכלוסיות תאי T ספציפיים לאנטיגן ניתן למנות מולטימרים מסיסים (בדרך כלל טטרמרים) של מולקולות מסוג I או מדרגה II של קומפלקס היסטותאימות ראשוני (MHC) המורכבות לאפיטופים של פפטידים, הידועים יותר בשם “פפטיד MHC”2,3,4,5 . על ידי ייצוג הליגנדות הטבעיות של קולטני אנטיגן של תאי T (TCRs), פפטידים:MHC Class I ו- Class II טטרמרים מספקים אמצעי לזיהוי ישיר של תאי T ספציפיים לאנטיגן CD8⁺ ו- CD4⁺, בהתאמה, בתוך הרפרטואר האנדוגני של תאי T במערכת החיסון ללא דרישה לתגובה לגירוי אנטיגן בבדיקה. טטרמרים מייצגים גישה אלגנטית יותר לחקר תאי T ספציפיים לאנטיגן מאשר מודלים להעברת תאי T טרנסגניים^{TCR 6}, ונעשה בהם שימוש הולך וגובר לזיהוי אוכלוסיות תאי T זרים וספציפיים לאנטיגן עצמי הן במודלים ניסיוניים של עכברים והן במחלות אנושיות ^4,5.

בעוד טטרמרים יכולים לזהות בקלות אוכלוסיות בתדר גבוה של תאי T שהתרחבו בתגובה לגירוי אנטיגן, השימוש בהם עבור תאי T נאיביים, ספציפיים לאנטיגן עצמי או זיכרון מוגבל על ידי התדרים הנמוכים מאוד של אוכלוסיות אלה⁷. הקבוצה שלנו ואחרים פיתחו והפיצו אסטרטגיות העשרה מגנטית מבוססות טטרמר המגבירות את רגישות הזיהוי כדי לאפשר מחקרים של אוכלוסיות תאים אלה ברקמות הלימפה של עכברים 8,9,10,11.

הופעתם של תאי T שוכנים ברקמה בתחום שמה דגש מוגבר על פיתוח דרכים חדשות לחקור תאי T במרחב הלא-לימפואידי. כמו משטחים ריריים רבים אחרים, תאי T בריאות נתקלים במגוון אנטיגנים עצמיים וזרים שמקורם באפיתל של המאכסן, חיידקים קומנסליים וזיהומיים, וישויות סביבתיות, כולל אלרגנים. ניתוח שעתוק של תאי T שנקצרו מרקמה לא לימפואידית (NLT) מדגים פנוטיפ דמוי זיכרון הנושא גורל ותפקוד ייחודיים לרקמה, המכוונים לעתים קרובות לסחר ולהומאוסטזיס רקמות¹². יתר על כן, תאי זיכרון T (Trms) שוכנים ברקמה נוטים להיות מוגבלים יותר מבחינה קלונית מאשר אלה במחזור¹³. קביעה כיצד ומדוע אנטיגנים מניעים את מיקום תאי T ב-NLT היא קריטית להבנת האופן שבו מערכת החיסון מתגוננת מפני זיהום, שומרת על הומאוסטזיס רקמות, ולפעמים מתדרדרת לאוטואימוניות. עם זאת, נראה שיש שחיקה גדולה יותר בקרב תאי T שוכני רקמות מהריאות בהשוואה לתאי NLT¹⁴ אחרים. בהתאם לכך, היכולת לזהות ולאפיין תאי T אנדוגניים של הריאה עם ספציפיות אנטיגן נתונה מוגבלת על ידי הנדירות הטבועה בהם.

על ידי שילוב של שימוש בטכניקות העשרת תאים מבוססות חרוזים מגנטיים וצביעת טטרמר פפטיד MHC, הצלחנו לאתר תאי T ספציפיים לאנטיגן עצמי מורחבים אך נדירים בריאות עכבר^15,16. כאן, אנו מציגים תיאור מפורט של פרוטוקול שביצענו אופטימיזציה כדי לבודד ולאפיין באופן אמין כל אוכלוסיית תאי T נדירה ספציפית לאנטיגן שנמצאת בריאות עכברים (איור 1). פרוטוקול זה משלב שלב צביעת נוגדנים in vivo כדי להבדיל בין תאי T שוכנים לתאי T וסקולריים¹⁷ ואחריו שתי שיטות שונות לעיבוד רקמת ריאה כדי להתאים לזמינות משאבים. לאחר מכן מתבצע שלב העשרה מגנטי כללי של תאי T, צביעת טטרמר וניתוח לפי ציטומטריית זרימה. כדאיות התא וצביעת טטרמר משופרת עוד יותר בפרוטוקול זה על ידי תוספת של אמינוגואנידין, אשר חוסם אפופטוזיס¹⁸ בתיווך תחמוצת החנקן המושרה על ידי סינתאז חנקן (iNOS) בתיווך תאי T המושרה על ידי הפעלת תאי T וDasatinib המגביל את הפחתת הרגולציה של TCR¹⁹. השלבים המודגשים בפרוטוקול זה משתמשים בטכניקות נפוצות ובריאגנטים זמינים, מה שהופך אותו לנגיש כמעט לכל חוקר העוסק באימונולוגיה של תאי T בעכבר והוא ניתן להתאמה גבוהה למגוון ניתוחים במורד הזרם. למרות שתאי T נאיביים אינם צפויים להימצא בריאות, אנו מאמינים שפרוטוקול זה יהיה מועיל במיוחד לחקר תאי T ספציפיים לאנטיגן עצמי ו- Trms בריאות.

איור 1: סקירה כללית של זרימת עבודה של פרוטוקול. ריאות נקצרות מעכברים ומנותקות לתאים בודדים. הדגימות מועשרות לאחר מכן עבור תאי T לפני צביעה עם פפטיד טטרמרים MHC ונוגדנים מסומנים פלואורסצנטית לניתוח ציטומטרי זרימה. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.