Identificação de células T raras específicas de antígenos de pulmões de camundongos com peptídeos: tetrâmeros do complexo principal de histocompatibilidade

No coração do sistema imunológico adaptativo está a capacidade de uma célula T de reconhecer e responder a um antígeno específico. Quando e onde uma célula T responde ao seu antígeno cognato determina o equilíbrio entre infecção e autoimunidade, homeostase e câncer, saúde e doença¹. Segue-se que o estudo de células T em um contexto específico de imunidade deve se concentrar nas células com especificidade para um antígeno relevante de interesse. Entre os avanços tecnológicos que aumentaram muito a capacidade de caracterizar populações de células T específicas do antígeno estão multímeros solúveis marcados com fluorescência (geralmente tetrâmeros) de moléculas de classe I ou classe II do complexo principal de histocompatibilidade (MHC) complexadas a epítopos de peptídeos antigênicos, mais conhecidos como “tetrâmeros peptídeo: MHC” ^{2 , 3 , 4 , 5}. Ao representar os ligantes naturais dos receptores de antígenos de células T (TCRs), os tetrâmeros peptídeo:MHC classe I e classe II fornecem um meio de identificar diretamente as células T CD8⁺ e CD4⁺ específicas do antígeno, respectivamente, dentro do repertório endógeno de células T no sistema imunológico sem a necessidade de uma resposta à estimulação do antígeno em um ensaio. Os tetrâmeros representam uma abordagem mais elegante para o estudo de células T específicas do antígeno do que os modelos de transferência adotiva de células T transgênicas TCR⁶ e têm sido cada vez mais usados para identificar populações de células T estranhas e auto-específicas de antígenos em modelos experimentais de camundongos e doenças humanas ^4,5.

Embora os tetrâmeros possam identificar prontamente populações de alta frequência de células T que se expandiram em resposta à estimulação de antígenos, seu uso para células T ingênuas, autoantígenas específicas ou de memória é limitado pelas frequências muito baixas dessas populações⁷. Nosso grupo e outros desenvolveram e popularizaram estratégias de enriquecimento magnético baseadas em tetrâmeros que aumentam a sensibilidade de detecção para permitir estudos dessas populações de células em tecidos linfóides de camundongos 8,9,10,11.

O surgimento de células T residentes no tecido no campo colocou uma ênfase maior no desenvolvimento de novas maneiras de investigar células T no espaço não linfóide. Como muitas outras superfícies mucosas, as células T nos pulmões encontram uma variedade de antígenos próprios e estranhos derivados do epitélio do hospedeiro, micróbios comensais e infecciosos e entidades ambientais, incluindo alérgenos. A análise transcricional de células T colhidas de tecido não linfóide (NLT) demonstra um fenótipo semelhante à memória que tem destino e função únicos específicos do tecido, muitas vezes direcionados ao tráfego e à homeostase do tecido¹². Além disso, as células T de memória residentes no tecido (Trms) tendem a ser mais restritas clonalmente do que aquelas em circulação¹³. Determinar como e por que os antígenos impulsionam a residência das células T na NLT é fundamental para entender como o sistema imunológico protege contra infecções, mantém a homeostase do tecido e, às vezes, se transforma em autoimunidade. No entanto, parece haver maior atrito entre as células T residentes nos tecidos dos pulmões em comparação com outros NLT¹⁴. Consequentemente, a capacidade de identificar e caracterizar células T endógenas do pulmão com uma determinada especificidade de antígeno é limitada por sua raridade inerente.

Ao combinar o uso de técnicas de enriquecimento celular baseadas em esferas magnéticas e coloração de tetrâmero peptídeo: MHC, conseguimos detectar células T auto-específicas expandidas, mas raras, em pulmões de camundongos^15,16. Aqui, apresentamos uma descrição detalhada de um protocolo que otimizamos para isolar e caracterizar de forma confiável qualquer população rara de células T específicas do antígeno presente nos pulmões de camundongos (Figura 1). Este protocolo incorpora uma etapa de coloração de anticorpos in vivo para distinguir células T residentes no tecido das células T vasculares¹⁷, seguida por dois métodos diferentes para processamento de tecido pulmonar para acomodar a disponibilidade de recursos. Isso é seguido por uma etapa geral de enriquecimento magnético de células T, coloração de tetrâmero e análise por citometria de fluxo. A viabilidade celular e a coloração do tetrâmero são aprimoradas ainda mais neste protocolo pela adição de aminoguanidina, que bloqueia a apoptose induzida por ativação de células T mediada por óxido nítrico sintase induzível (iNOS)¹⁸ e Dasatinibe, que limita a regulação negativa do TCR¹⁹. As etapas destacadas neste protocolo utilizam técnicas comuns e reagentes prontamente disponíveis, tornando-o acessível para quase todos os pesquisadores envolvidos em imunologia de células T de camundongos e é altamente adaptável para uma variedade de análises posteriores. Embora não seja provável que as células T virgens sejam encontradas nos pulmões, acreditamos que este protocolo será particularmente útil para o estudo de células T autoantígenas específicas e Trms nos pulmões.

Figura 1: Visão geral do fluxo de trabalho do protocolo. Os pulmões são colhidos de camundongos e dissociados em células únicas. As amostras são posteriormente enriquecidas para células T antes da coloração com tetrâmeros peptídicos:MHC e anticorpos marcados com fluorescência para análise de citometria de fluxo. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.