Burada, süper emici polimer bazlı ototrofik sistemlerde arbusküler mikorizal mantarları aşılamak ve gözlemlemek için basit ve ucuz bir tekniği açıklıyoruz.
Arbusküler mikorizal () mantarların, bitki kökleri ile kalıcı ilişkileri ve rizosferdeki çoğalmaları nedeniyle manipüle edilmesi ve gözlemlenmesi zordur. Tipik olarak, mantarları, bir ototrofik konakçı ile pot kültüründe in vivo koşullar altında veya bir Petri kabında Ri Transfer-DNA’ya dönüştürülmüş kökler (heterotrofik konak) ile in vitro koşullar altında kültürlenir. Ek olarak, saksı kültüründe mantarlarının yetiştirilmesi, opak ve steril olmayan bir ortamda gerçekleşir. Buna karşılık, in vitro kültür, mantarlarının steril, şeffaf bir ortamda çoğaltılmasını içerir. Süper emici polimer bazlı ototrofik sistem (SAP-AS) yakın zamanda geliştirilmiş ve her iki yöntemin avantajlarını kendi sınırlamalarından (opaklık ve heterotrofik konak, sterilite) kaçınarak birleştirdiği gösterilmiştir. Burada, SAP-AS’de kolay hazırlama, tek spor aşılaması ve mantarlarının gözlemlenmesi için ayrıntılı bir protokol sunuyoruz. Petri kaplarını değiştirerek, canlı örnekler üzerinde yüksek çözünürlüklü fotoğraf ve video gözlemleri mümkün oldu, bu da mevcut in vivo ve in vitro tekniklerle zor veya imkansız olurdu.
Arbusküler mikorizal () mantarlar (Glomeromycotina), karasal toprakların trakeofitler tarafından kolonizasyonunda önemli bir rol oynamış olabilecek eski bitki kökü simbiyontlarıdır (~ 500 Ma 1,2). mantarları ve trakeofitler arasındaki bu uzun birlikte evrim, arbusküler mikorizayı krallıklar arası karşılıklılığın bir başyapıtı olarak yerleştirir. mantar hifleri, mikorizalağlar 4 yoluyla yeni konakçılara besin taşınması da dahil olmak üzere, konakçının toprak besinlerini3 arama yeteneğini önemli ölçüde artırır. Hif ağı toprak yapısını iyileştirir ve glomalin üretimi toprak erozyonunu azaltabilir5. Atmosferik karbonun bir kısmının mantar kökü simbiyotuna aktarılması, toprak karbon tutumunu arttırır6. Genel olarak, mantarları hem abiyotik hem de biyotik streslere karşı bitki direncini artırır ve bu nedenle agroekolojide büyük ilgi görmüştür7. Nitekim, mantar dostu tarımsal yönetim uygulamaları, sürdürülebilir tarım uygulamalarına geçiş ve iklim değişikliğiyle mücadele ile ilgili ulusal ve uluslararası taahhütlere uymak için çiftçilerin yönetim uygulamalarına entegre etmeleri gereken önemli hedefler olan mahsul üretimi için kimyasal girdilerin kullanımını azaltma ve toprak organik karbon içeriğini iyileştirme potansiyeline sahiptir.
Bununla birlikte, mantarları toprak mikroskobik mantarlarıdır ve zorunlu biyotrofi ve rizosfer dağılımları nedeniyle çalışmaları zordur. Toprak, opaklığı, çok çeşitli nişler ve her ölçekte çoklu trofik etkileşimler nedeniyle incelenmesi en zor biyotoplardan biridir. mantarlarının izolasyonu, yayılması ve karakterizasyonu bu nedenle zordur. 20.yüzyılın ortalarına kadar, sadece sporokarpları oluşturan mantar türleri karakterize edilmişti8. Bununla birlikte, mantar türlerinin çoğu, çapı ~ 20 μm ila ~ 500 μm arasında değişen sporokarpik olmayan sporlar üretir. Toprak ıslak eleme tekniğinin9 tanımı, bu mantar türlerini tanımlamanın yolunu açtı ve o zamandan beri tür tanımlama oranı arttı. Bununla birlikte, mantarları, Dikarya’ya kıyasla küçük bir tür grubunu temsil eder.
Tuzak kültürleri, yani sporlarla aşılama veya turface ve vermikülit gibi otoklavlanmış malzeme ile doldurulmuş bir tencerenin mantar sporlarını içeren bir çevresel toprak numunesi ve bir konakçının sterilize edilmiş bir tohumu (pırasa, muz), kontrollü koşullar altında mantarlarını çoğaltmanın bir yoludur10. Bununla birlikte, aşılamanın başarısı ancak boyamadan sonra kök parçalarında arbusküllerin varlığına bakılarak veya sporları izole etmek için bir alt numunenin veya tüm kabın ıslak elenmesiyle değerlendirilebilir. Genellikle saksı kültürünün analizinden önce en az 6-12 hafta boyunca sistemin rahatsız edilmemesi önerilir. Bu kültür tekniği, bilinen mantar türlerinin çoğunun çoğaltılması için uygundur, ancak mantar simbiyontunun canlı gözlemi mümkün değildir ve özellikle tek spor kültürleri denendiğinde aşılamanın başarısı belirsizdir.
Aksine, mantarlarının in vitro yayılımı, kültür ortamının11 şeffaflığı sayesinde canlı olarak izlenebilir, ancak bu kültür tekniği, steril bir ortamda çalışmak için dönüştürülmüş köklerin mevcudiyetini ve kültür ortamında karbon varlığını gerektirir. Sporlar sterilize edilmelidir ve heterotrofik bir konakçı ile birlikte, bilinen mantar türlerinin çoğu bu teknik kullanılarak başarılı bir şekilde çoğaltılmaz.
Bu nedenle, mantarlarının mevcut teknikler kullanılarak çoğaltılması, çoğu laboratuvarda kurulmuş ve yaygın olarak kullanılmasına rağmen, mantarlarının incelenmesi için bazı sınırlamalara sahiptir. Paré ve ark. (2022)12 , mantarlarını çoğaltmak için bütün bitkilerle kombinasyon halinde şeffaf bir süper emici polimer (SAP) kullanarak in vivo bir teknik geliştirdi. SAP tabanlı bir ototrofik sistem (SAP-AS) olarak tasarlanan teknik, basit ve ucuzdur ve pot kültürünün (ototrofik bir konakçı ile ilişkilendirme, steril olmayan koşullar) ve in vitro kültürlerin (şeffaf ortam, simbiyoz gelişiminin canlı izlenmesi) avantajlarını birleştirir. Burada, tek spor inokülasyonu ile kültürlerin nasıl kurulacağını ve ekstraradikal miselyumun yüksek büyütmeli gözlemi için SAP-AS’nin nasıl kullanılacağını açıklayan bir protokol sunuyoruz. Spesifik olarak, iki bölmeli Petri kaplarının nasıl değiştirileceğini, besin çözeltisinin nasıl hazırlanacağını, süper emici polimerin (SAP) nasıl hazırlanacağını, fidelerin nasıl hazırlanacağını, SAP-AS’nin nasıl birleştirileceğini ve tek bir sporla nasıl aşılanacağını, sporların nasıl önceden çimleneceğini ve simbiyozun gelişimini canlı olarak nasıl izleyeceğimizi açıklıyoruz.
Aşılama, protokoldeki en kritik adımdır ve ekstrüde cam Pasteur pipetleri, bütünlüklerini korurken mantarlarının tek sporlarını doğru bir şekilde manipüle etmek için mükemmel bir araç olduğunu kanıtlamıştır. Ekstrüde cam Pasteur pipetleri, bir mum veya Bunsen brülörünün alevi kullanılarak kolayca şekillendirilebilir ve açıklık, pipetlenen sporun boyutuna uyacak şekilde stereomikroskop altında ayarlanabilir. Sporları, mantar sporunun boyutuna uyarlanmış aletlerle manipüle etmek (Ek Şekil 1) ve konakçı bitki kökleri, sporun biriktiği Nitex zarına ulaşacak kadar uzun olduğunda SAP-AS’yi aşılamak önemlidir.
SAP-AS’nin deney gereksinimlerine uyarlanması kolaydır. Daha büyük Petri kapları, çok bölmeli, örneğin, yakın akraba suşlar arasındaki veya farklı AMF türleri arasındaki etkileşimi izlemek veya kimyasal (pH) veya biyolojik ortamı (nematodların, bakterilerin, mantarların eklenmesi) değiştirmek için kullanılabilir. mantarlarına fotosentezler sağlamak için çeşitli mikotrofik konakçı bitkiler de kullanılabilir. Besin çözeltisi mMS-1, Bécard ve Fortin (1988)15 tarafından açıklanan minimum (M) orta tariften türetilmiştir ve karbon kaynaklarını sınırlamak için sükroz, vitaminler ve bacto agar çıkarılmıştır. Bununla birlikte, SAP-AS, deney hedeflerine bağlı olarak çeşitli besin çözeltileri ile desteklenebilir.
mantarlarının SAP-AS’de çoğaltılması düzenli sulama gerektirir. Sınırlı miktarda vermikülit ve SAP, kökleri ve mantarını, özellikle standart iki bölmeli Petri kaplarında (10 cm çapında) nem dalgalanmalarına maruz bırakır. SAP tanelerinin genişleme yeteneği ve dolayısıyla şeffaflığı zamanla azalır. Aslında, besin çözeltisinden katyonların varlığı, akrilat ağının genişlemesini aşamalı olarak sınırlar ve aylar sonra SAP’nin değiştirilmesini gerektirir. Ek olarak, Petri kapları ışıktan veya aşırı sudan uygun şekilde korunmazsa yeşil algler ve küf zamanla büyüyebilir.
Bugüne kadar, saksı kültürlerinde çoğaltılabilen mantar türlerinin sayısının çok altında olan SAP-AS’de yedi mantar türü başarıyla yetiştirilmiştir. Bununla birlikte, SAP-AS’deki hem biyotik hem de abiyotik koşullar, saksı kültürlerindekilere çok benzer ve diğer mantar türlerinin SAP-AS’de çoğalabilmesi muhtemeldir. SAP-AS’de sporların doğrudan aşılanması, aşılama için steril olmayan sporlar/tohumlar kullanılıyorsa, kök eksüdalarının ve/veya bakterilerin varlığına bağlı olarak muhtemelen doğal bir toprakta rizosferinkine daha yakın çevresel koşullar sağlar. Bu, çimlenmiş sporlarla aşılamaya tercih edilmelidir. Ek olarak, AMF içinde spor çimlenmesini tetikleyen koşullar hala tam olarak anlaşılamamıştır, bu nedenle mMS-1 besin çözeltisi ile hidratlı SAP, diğer mantar türlerinin sporlarını çimlendirmek için uyarlanamayabilir. mMS-1 besin çözeltisi ile hidratlanmış SAP üzerindeki spor çimlenmesi, sadece R. irregularis inoculum kullanılarak aşılama adımı için canlı sporları spesifik olarak seçmek üzere test edildi.
simbiyozunun gelişiminin aşılanması ve izlenmesi SAP-AS’de kolayca gerçekleştirilir. Modifiye edilmiş iki bölmeli Petri kapları, farklı mantar türlerinin yetiştirilmesine izin verir. Paré ve ark.12 , altı cins ve üç aileden yedi farklı AMF türünü çoğaltmıştır. İki bölmeli Petri kaplarının modifikasyonu, ucuz aletlerle kolayca yapılır. SAP-AS’yi hazırlamak ve sürdürmek için gereken malzemelerin (vermikülit, SAP, Pasteur pipeti vb.) ve reaktiflerin (mMS-1) maliyeti ve miktarı sınırlıdır, bu da çok sayıda SAP-AS’nin minimum maliyetle yönetilmesine olanak tanır. SAP-AS’yi istifleme yeteneği, saksı kültürlerine kıyasla mantar kültürlerinin ayak izini de önemli ölçüde azaltır. Örneğin, 50 SAP-AS (onlu 5 yığın) 1 m uzunluğundaki bir rafa sığabilir (Ek Şekil 2). Bu özellikler, SAP-AS’ı lise laboratuvar derslerinde veya üniversitelerde lisans düzeyinde simbiyoz öğretimi ile uyumlu basit ve ucuz bir teknik haline getirir. Kolonize SAP taneleri, yeni SAP-AS veya saksı kültürlerini aşılamak için kullanılabilir.
Petri kabının tabanının arkasında bir lamel bulunması, ekstraradikal mantar yapılarının yüksek çözünürlüklü fotoğrafına ve videosuna izin verir. Sitoplazmik akış, doğal koşullara çok yakın yaşam koşullarında kolayca incelenebilir. Bu, mantarlarının miselleri (besinler, su taşımacılığı, toprak yapısı vb.) ile ilgili işlevleri ve hif morfogenezi çalışmaları için büyük önem taşımaktadır.
AMF biyolojik döngülerini bitki köklerinde ve rizosfer içinde tamamlar. Toprak mikroorganizmalarının incelenmesi, toprak ortamını gözlemlemenin doğasında var olan zorluk nedeniyle karmaşıktır. SAP-AS’ın temel amacı, mantarlarının gelişimini ayrıntılı olarak gözlemleme yeteneğini korurken, mantarlarının yayılması için rizosfere mümkün olduğunca benzer bir ortamı yeniden yaratmaktır. Bu, steril olmayan koşullar anlamına geldiğinden, saprotrofik mikroorganizmaların çoğalmasını önlemek için mevcut karbon miktarı sınırlandırılmalıdır. mantarlarının rizosferdeki davranışlarına ilişkin bilgi hala son derece sınırlıdır ve SAP-AS, türler arasında radikal dışı ortamda yiyecek arama yetenekleri, spor üretimleri ve kök kolonizasyonları ile ilgili ayrıntılı karşılaştırmalar yapma imkanı sunar. Bu, bakteriler, nematodlar, protistler ve kök mantar patojenleri gibi diğer toprak türleri ile etkileşimler eklenerek daha da karmaşık hale gelebilir ve SAP-AS sayesinde toprak mikrobiyota etkileşimleri bilgisi geliştirilebilir.
The authors have nothing to disclose.
Önerileri için iki isimsiz yorumcuya teşekkür ederiz. Bu araştırmanın finansmanı, J-002295 (AAFC’nin biyolojik koleksiyonlarının yönetimi ve geliştirilmesi) projesi kapsamında Tarım ve Tarım-Gıda Kanada (AAFC) tarafından sağlanmıştır.
100 x 15 mm Stackable Bi-Plate | Kord Valmark | 1204U09 | https://www.thomassci.com/Laboratory-Supplies/Petri-Dishes/_/100-x-15-mm-Stackable-Bi-Plate |
12-well plate | Greiner Bio-one | 665180 | https://shop.gbo.com/en/row/products/bioscience/cell-culture-products/cellstar-cell-culture-multiwell-plates/665180.html |
18 mm round glass coverslips | Fisher Scientific | 12-545-100 | https://www.fishersci.com/shop/products/fisherbrand-cover-glasses-circles-11/12545100#?keyword=12-545-100 |
20 mL Syringe PP/PE without needle | Millipore Sigma | Z683620-100EA | https://www.sigmaaldrich.com/CA/en/product/aldrich/z683620?utm_source=google&utm_medium= cpc&utm_campaign=20674735406 &utm_content=157607444391&gc lid=Cj0KCQiA5rGuBhCnARIsAN11 vgQOT_WPRg9WFyBEyoO4b0x1 -F7Tks4houU7VTRS5EiYM9l0F-B oL7saAmFoEALw_wcB |
Acupuncture needle | Lierre | A143-LP1-3075 | https://www.lierre.ca/products/lierre-plus-acupuncture-needles-100pcs?gad _source=1&gclid=Cj0KCQiA5rGuBh CnARIsAN11vgTwupmw51UTdR k9cKr4ewi12W3dyVikenzH3sjdUB4 g41G-_KnvppoaAkbTEALw_wcB& utm_campaign=PMax-needles&utm_content=shopify_CA_ 5213169090694_35001500991622 &utm_medium=cpc&utm_source= google&variant=35001500991622 |
Blotting paper | FLINN | FB0678 | https://www.flinnsci.ca/blotting-paper-12-x-19-pkg.-of-10/fb0678/ |
Commercial or scientific blender or kitchen hand blender | kitchenaid | KHBV53DG | https://www.kitchenaid.ca/en_ca/countertop-appliances/hand-blenders/hand-blender-products/p.variable-speed-corded-hand-blender.khbv53dg.html |
Dremel 199 Carving Bit | Dremel | 2615000199 | https://www.dremel.com/ca/en/p/199-2615000199 |
Dry SAP medium granulometry 1–2 mm | HORTA-SORB MD | 00810085242789 | https://www.horticulturalalliance.com/product/horta-sorb-md-granule/ |
Feather Stainless-Steel Blades for Dissecting Knife Handles | Fisher Scientific | 08-916-5B | https://www.fishersci.ca/shop/products/graham-field-stainless-steel-blades-dissecting-knife-handles-8/089165b |
Glass Pasteur pipettes 230 mm | Kimble | RK-25554-14 | https://www.coleparmer.ca/i/dwk-life-sciences-kimble-disposable-pasteur-pipettes-plugged-end-borosilicate-glass-230-mm-1000-cs/2555414 |
Ink | Sheaffer | 94321 | https://www.amazon.com/Sheaffer-Skrip-Bottled-Black-94231/dp/B002IKKKUU |
Melting guide: modified paint Scraper, 2-in | Mastercraft | #049-7335-8 | https://www.canadiantire.ca/en/pdp/mastercraft-carbon-steel-flexible-spackling-putty-knife-wall-paint-scraper-2-in-0497335p.0497335.html?loc=plp |
Microscopy glass slide | Fisher Scientific | 12-552-5 | https://www.fishersci.com/shop/products/fisherbrand-frosted-microscope-slides-4/125525 |
Nitex nylon mesh filter screen | Dynamic Aqua-Supply Ltd. | NTX30-108 | https://dynamicaquasupply.com/products/nitex-screen?_pos=1&_sid=ffc105328&_ss=r& variant=6945749106731 |
Paper clip | Makanu | Clips-BK-41mm-24 | https://www.amazon.ca/classeur-standard-grandes-trombones-excellentes |
Parafilm | Avantor/vwr | 470201-930 | https://www.avantorsciences.com/ca/en/product/8882964/parafilm |
Plantago lanceolata seeds | ecoumene | NA | https://www.ecoumene.com/produit/semences/herbacees/plantain-lanceole-bio/ |
Polyvinyl alcohol-lactic acid-glycerol (PVLG). | NA | NA | https://invam.ku.edu/recipes |
Pyrography kit with fine tip | Walnut Hollow | 483103 | https://www.walnuthollow.com/collections/creative-wood-burning/products/walnut-hollow-creative-versa-tool |
Silicone sealant | Aqueon | 100165003 | https://www.aqueon.com/products/aquariums/silicone-sealant |
Surgeon scalpel handle | Fisher Scientific | 22-079657 | https://www.fishersci.ca/shop/products/surgical-design-scalpel-handles-blades/22079657#?keyword=scalpel |
Two Speed Rotary Tool Kit | Dremel | 200-1/21 | https://www.dremel.com/ca/en/p/200-1-21-f0130200ah |
Vermiculite | PRO-MIX | 4981110 | https://www.canadiantire.ca/fr/pdp/vermiculite-pro-mix-9-l-0597936p.0597936.html |
X1000 Round Coverslip dia. 30 mm #1 (0.13–0.16 mm) | Fisher Scientific | 12164692 | https://www.fishersci.fi/shop/products/x1000-cover-slip-diam-30-mm-n-1-1/12164692 |