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Environment

Inoculación y observación de cultivos de micorrizas arbusculares en sistemas autótrofos superabsorbentes basados en polímeros

Published: June 14, 2024
doi:
10.3791/66848
, ,
1Centre d’Étude de la Forêt (CEF) and Institut de Biologie Intégrative et des Systèmes (IBIS),Université Laval, 2Ottawa Research and Development Centre, Agriculture and Agri-Food Canada

Summary

En este trabajo describimos una técnica sencilla y económica para inocular y observar hongos micorrícicos arbusculares en sistemas autótrofos superabsorbentes basados en polímeros.

Abstract

Los hongos micorrízicos arbusculares (AM) son difíciles de manipular y observar debido a su asociación permanente con las raíces de las plantas y su propagación en la rizosfera. Por lo general, los hongos AM se cultivan en condiciones in vivo en cultivo en maceta con un huésped autótrofo o en condiciones in vitro con raíces transformadas en ADN de transferencia de Ri (huésped heterótrofo) en una placa de Petri. Además, el cultivo de hongos AM en maceta se produce en un ambiente opaco y no estéril. Por el contrario, el cultivo in vitro implica la propagación de hongos AM en un ambiente estéril y transparente. Recientemente se ha desarrollado el sistema autótrofo superabsorbente basado en polímeros (SAP-AS) que combina las ventajas de ambos métodos evitando sus respectivas limitaciones (opacidad y huésped heterótrofo, esterilidad). Aquí, presentamos un protocolo detallado para una fácil preparación, inoculación de una sola espora y observación de hongos AM en SAP-AS. Mediante la modificación de las placas de Petri, fueron posibles observaciones fotográficas y de video de alta resolución en especímenes vivos, lo que habría sido difícil o imposible con las técnicas actuales in vivo e in vitro .

Introduction

Los hongos micorrízicos arbusculares (AM) (Glomeromycotina) son antiguos simbiontes de raíces de plantas (~500 Ma 1,2) que pueden haber desempeñado un papel esencial en la colonización de suelos terrestres por traqueofitas. Esta larga coevolución entre los hongos AM y las traqueofitas coloca a las micorrizas arbusculares como una obra maestra del mutualismo entre reinos. Las hifas fúngicas AM aumentan significativamente la capacidad del huésped para buscar nutrientes en el suelo3, incluida la transferencia de nutrientes a nuevos huéspedes a través de redes de micorrizas4. La red de hifas mejora la estructura del suelo, y la producción de glomalina podría reducir la erosión del suelo5. La transferencia de parte del carbono atmosférico al simbionte de la raíz del hongo aumenta el secuestro de carbono del suelo6. En general, los hongos AM mejoran la resiliencia de las plantas tanto al estrés abiótico como al biótico y, por lo tanto, han recibido una atención considerable en la agroecología7. De hecho, las prácticas de manejo agrícola amigables con los hongos AM tienen el potencial de reducir el uso de insumos químicos para la producción de cultivos y mejorar el contenido de carbono orgánico del suelo, que son objetivos importantes que los agricultores deben integrar en sus prácticas de manejo para cumplir con los compromisos nacionales e internacionales con respecto a la transición a prácticas agrícolas sostenibles y la lucha contra el cambio climático.

Sin embargo, los hongos AM son hongos microscópicos del suelo, y su estudio es difícil debido a su obligada distribución biotrófica y rizosfera. El suelo es uno de los biotopos más difíciles de estudiar debido a su opacidad, la enorme diversidad de nichos y las interacciones multitróficas a todas las escalas. Por lo tanto, el aislamiento, la propagación y la caracterización de los hongos AM son difíciles. Hasta mediadosdel siglo XX , sólo se habían caracterizado las especies de hongos AM formando esporocarpos8. Sin embargo, la mayoría de las especies de hongos AM producen esporas no esporocárpicas que van desde ~20 μm hasta ~500 μm de diámetro. La descripción de la técnica de tamizado húmedo del suelo9 abrió el camino para describir estas especies fúngicas de AM, y la tasa de descripción de especies ha aumentado desde entonces. Sin embargo, los hongos AM representan un pequeño grupo de especies en comparación con el Dikarya.

Los cultivos trampa, es decir, la inoculación con esporas o una muestra de suelo ambiental que contenga esporas de hongos AM de una maceta llena de material esterilizado en autoclave como turface y vermiculita y una semilla esterilizada de un huésped (puerro, plátano), es una forma de propagar hongos AM en condiciones controladas10. Sin embargo, el éxito de la inoculación solo puede evaluarse buscando la presencia de arbúsculos en los fragmentos de raíz después de la tinción o tamizando en húmedo una submuestra o toda la maceta para aislar las esporas. Por lo general, se recomienda no perturbar el sistema durante al menos 6-12 semanas antes del análisis del cultivo en maceta. Esta técnica de cultivo es adecuada para propagar la mayoría de las especies de hongos AM conocidas, pero la observación en vivo del simbionte fúngico no es posible y el éxito de la inoculación es incierto, especialmente cuando se intentan cultivos de esporas individuales.

Por el contrario, la propagación in vitro de hongos AM puede ser monitoreada en vivo gracias a la transparencia del medio de cultivo11, pero esta técnica de cultivo requiere la disponibilidad de raíces transformadas y la presencia de carbono en el medio de cultivo para trabajar en un ambiente estéril. Las esporas deben ser esterilizadas, y junto con la asociación con un huésped heterótrofo, la mayoría de las especies de hongos AM conocidas no se propagan con éxito utilizando esta técnica.

Por lo tanto, la propagación de hongos AM utilizando técnicas actuales, aunque establecidas y ampliamente utilizadas en la mayoría de los laboratorios, tiene algunas limitaciones para el estudio de los hongos AM. Paré et al. (2022)12 desarrollaron una técnica in vivo que utiliza un polímero superabsorbente transparente (SAP) en combinación con plantas enteras para propagar hongos AM. La técnica, diseñada como un sistema autótrofo basado en SAP (SAP-AS), es sencilla y económica y combina las ventajas del cultivo en maceta (asociación con un huésped autótrofo, condiciones no estériles) y los cultivos in vitro (medio transparente, monitorización en vivo del desarrollo de la simbiosis). Aquí, presentamos un protocolo que explica cómo configurar los cultivos con inoculación de una sola espora y utilizar el SAP-AS para la observación de gran aumento del micelio extrarradical. En concreto, describimos cómo modificar placas de Petri de dos compartimentos, preparar la solución nutritiva, preparar el polímero superabsorbente (SAP), preparar las plántulas, montar el SAP-AS e inocular con una sola espora, pregerminar las esporas y monitorizar en vivo el desarrollo de la simbiosis.

Protocol

1. Modificación de placas de Petri de dos compartimentos NOTA: Los materiales necesarios para este paso se enumeran en la Tabla de Materiales. Modifique la tapa de la placa de Petri.Con la herramienta rotativa y la broca de trinchar adecuada, taladre dos agujeros (~7 mm de diámetro) en la parte superior de la tapa y una abertura de 1 cm en el lateral. Un orificio se utilizará para irrigar el compartimento de la raíz (vermiculita) y el otro para el compartimento de las hifas (SAP). Modifique el fondo de la placa de Petri.Taladre una muesca en el costado de la parte inferior de la placa de Petri para el tallo de la planta con la herramienta rotativa eléctrica. Asegúrese de que la muesca no sea demasiado profunda para evitar que el líquido se drene. Esta muesca se alineará con la abertura de 1 cm en la tapa (paso 1.1). Para reemplazar la barrera de plástico de la placa de Petri de doble compartimento con la membrana de filtro de malla de nailon, use la herramienta rotativa eléctrica para perforar una muesca rectangular de 30 mm hasta el fondo de la placa de Petri. Para una observación de alta resolución, perfore agujeros circulares de ~25 mm de diámetro en la parte inferior de la placa de Petri. Dependiendo de los requisitos, haga un solo orificio (o varios orificios) en el lado del SAP o uno en cada compartimento. Asegúrese de que los orificios no se perforen directamente debajo de los orificios de riego de la tapa. Instale la membrana de filtro de malla de nylon.Use la guía de metal y el clip para encajar la pieza de la membrana del filtro de malla de nailon en su lugar y presiónela firmemente sobre la barrera de plástico. Alinee la parte superior de la membrana con la parte superior de la barrera de plástico. Asegúrese de que la membrana sobresalga de la parte inferior de la guía. Con el kit de pirograbado, corte a lo largo del borde de la guía metálica para derretir y sellar la membrana al fondo de la placa de Petri y a la barrera de plástico que separa los dos compartimentos. Con la guía metálica y el clip aún en su lugar, retire con cuidado el exceso de membrana filtrante de malla de nailon con pinzas. Verifique bajo el microscopio de disección que la membrana del filtro de malla de nailon esté correctamente sellada al plástico para evitar la penetración de las raíces en el compartimento de las hifas (SAP). Instale el cubreobjetos.NOTA: El cubreobjetos se coloca debajo de la placa de Petri. Esto permite utilizar el aceite de inmersión y limpiar el cubreobjetos.Coloque el sellador de silicona a lo largo del borde de los orificios circulares (fuera del fondo de la placa de Petri). Coloque el cubreobjetos en el exterior del fondo de la placa de Petri y presione suavemente para garantizar una adhesión perfecta. Deje secar y elimine el exceso de sellador con una cuchilla de afeitar. Inspeccionar y limpiar.Use un chorro de aire para eliminar el polvo o los trozos de plástico que puedan haberse adherido a la placa de Petri. Inspeccione bajo un microscopio de disección para identificar y corregir cualquier defecto.NOTA: Use guantes para evitar huellas dactilares en las placas de Petri 2. Preparación de 1 L de solución nutritiva mMS-1 Preparar soluciones madre.Macronutrientes: Pesar y disolver en 1 L de agua destilada:7,31 g de MgSO4·7 H2O, 0,80 g de KNO3, 0,65 g de KCl y 0,048 g de KH2PO4,. Pesa 2,88 g de Ca(NO3)2·4H2O y disolver en 1 L de agua destilada. Pesar 0,80 g de NaFeEDTA y disolver en 0,5 L de agua destilada. Pesar 0,375 g de KI y disolver en 0,5 L de agua destilada. MicronutrientesDisolver 3 g de MnCl2·4H2O en 100 mL de agua destilada. Disolver 1.325 g de ZnSO4·7H2O en 100 mL de agua destilada. Disolver 0,75 g de H3BO3 en 100 ml de agua destilada. Cuando estén disueltas, mezclar las soluciones preparadas en los pasos 2.1.5.1-2.1.5.3. Peso 0,65 g de CuSO4·5H2O y disolver en 50 mL de agua destilada. Disolver 0,12 g de Na2MoO4·2H2O en 100 mL de agua destilada. Añadir 5 mL de la solución del paso 2.1.5.5 y 1 mL del paso 2.1.5.6 a la solución del paso 2.1.5.4. Ajustar el volumen de la solución obtenida en el paso 2.1.5.7 a 500 mL con agua destilada. Prepare 1 L de medio mMS-1.Agregue 700 ml de agua destilada a una botella de vidrio de 2 L. Mientras agita constantemente con una barra magnética, agregue 100 ml de solución de macronutrientes (paso 2.1.1), 100 ml de solución de nitrato de calcio (paso 2.1.2), 5 ml de solución férrica de EDTA (paso 2.1.3), 1 ml de solución de KI (paso 2.1.4) y 1 ml de solución de micronutrientes (paso 2.1.5). Ajuste el volumen de la solución a 1000 mL.NOTA: mMS-1 es una adaptación de Bécard y Fortin (1988)14. La esterilización a 121 °C durante 15 min es opcional, ya que el SAP-AS no es estéril. El pH no se ajusta porque el SAP tiene un fuerte efecto amortiguador, y Paré et al. (2022)12 mostraron que las condiciones en el SAP eran relativamente neutras (6,7 a 7,4). 3. Preparación de SAP NOTA: Los materiales necesarios para este paso se enumeran en la Tabla de Materiales. Hidratar SAP: mezclar 5 g de SAP seco con 500 mL de solución nutritiva mMS-1 (paso 2.2). Dejar hidratar durante 12 h (toda la noche) a temperatura ambiente (RT). Escurrir y recoger los granos de SAP hidratados.Cuando se utilice SAP hidratado para llenar la placa de 12 pocillos (sección 7), no drene el SAP hidratado y mezcle el grano hidratado y los restos de la solución nutritiva mMS-1.NOTA: Están disponibles tres granulometrías del SAP seco: pequeña, mediana y grande. La granulometría media (1-2 mm) es la más adecuada. El SAP de granulometría grande traga demasiado cuando está hidratado y la tapa de la placa de Petri no se puede cerrar, mientras que la granulometría pequeña SAP deja poco espacio entre ellos, lo que es una limitación para las observaciones de la estructura fúngica entre los granos. 4. Preparación de plántulas. NOTA: Los materiales necesarios para este paso se enumeran en la Tabla de Materiales. Germinar las semillas de P. lanceolata en papel secante humedecido con solución nutritiva mMS-1 en una placa de Petri. Incuba en la oscuridad en RT. Rehidrate según sea necesario hasta que las raicillas tengan al menos 2 cm de largo. 5. Montaje y gestión de SAP-AS NOTA: Los materiales necesarios para este paso se enumeran en la Tabla de Materiales. Montaje de SAP-AS (paso 1 + paso 2 + paso 3 + paso 4)Coloque el tallo de la plántula en la muesca en el costado de la placa de Petri con la raíz hacia adentro y los cotiledones / hojas y tallos hacia afuera. Cubre las raíces con aproximadamente 1,5-2 g de vermiculita. Hidrate el compartimento de la raíz con 8 mL de solución nutritiva mMS-1. Esto ayudará a estabilizar la raíz y la vermiculita. Agregue 5 g de SAP hidratado a lo largo de la membrana filtrante de malla de nailon en el costado del compartimento de la raíz. Añadir 15 g de SAP hidratado en el compartimento de las hifas. El compartimento de las hifas es el compartimento sin muesca en el lateral del fondo de la placa de Petri. Antes de cerrar la placa de Petri con la tapa, asegúrese de que las muescas laterales de la tapa y el fondo de la placa de Petri estén alineadas para no dañar el tallo. Selle la placa de Petri con una tira de parafina que se una a la base y la tapa, teniendo cuidado de no aplastar el tallo joven. Pese y registre el peso promedio de la placa de Petri para determinar cuándo es necesario rehidratar el SAP-AS. Apila las placas de Petri para optimizar el espacio. Mantenga la placa de Petri en la oscuridad usando una cubierta opaca con una abertura en el costado para las plántulas. Gestione SAP-AS.Hidrate las placas de Petri solo con la solución nutritiva mMS-1. Utilice el peso medio como referencia. Cuando la placa de Petri se haya aligerado en 5-6 g, agregue la solución nutritiva mMS-1 para devolverla al peso original. Asegúrese de que la vermiculita y el SAP se mantengan hidratados pero no inundados. Las raíces deben tener acceso al oxígeno. A medida que la plántula y su socio fúngico se desarrollen, riéguelas con más frecuencia. No es necesario regar ambos compartimentos al mismo tiempo. Los requisitos de riego varían según el desarrollo de las plántulas, pero también según las condiciones ambientales en las que se incuban los SAP-AS. Reduzca los requisitos de riego eliminando las hojas viejas si la planta tiene más de tres hojas sanas. Retira las hojas muertas.NOTA: La presencia de cationes como K+, Mg2+ y Ca2+ en la solución nutritiva mMS-1 tiende a disminuir la expansión de la red SAP13 a lo largo del tiempo. 6. Inoculación del SAP-AS con una sola espora NOTA: Los materiales necesarios para este paso se enumeran en la Tabla de Materiales. Inocular con una sola espora.Caliente la pipeta de vidrio con una vela de llama o un mechero Bunsen. Tire a medida que el vidrio se derrite para estirar el tubo de vidrio hasta que se separe. Bajo un microscopio estereoscópico, rompa la punta de la pipeta de vidrio para reducir el diámetro interno (normalmente 100-300 μm). Esto facilitará en gran medida la manipulación de las esporas individuales. Abra la placa de Petri, localice el lugar donde se va a colocar la espora y despeje un espacio entre los 5 g de SAP hidratado a lo largo de la membrana del filtro de malla de nailon para exponer una sección de una raíz. Bajo el microscopio de disección, recoja una espora con la pipeta extruida. Pipetea un poco de líquido antes de pipetear la espora. Evite pipetear el líquido después de recolectar la espora. Bajo el microscopio de disección, deposite cuidadosamente la espora en la raíz. El líquido pipeteado antes de pipetear la espora ayudará a expulsar la espora. Si la espora no se deposita en un lugar óptimo, utilice una aguja de acupuntura o un cepillo de pelo para que la espora vuelva a entrar en contacto con la raíz. Si es necesario, tome una foto de la espora depositada en la raíz como referencia y use un marcador para ubicar el sitio de inoculación. Reemplace el SAP sobre el fragmento de raíz para proporcionar un microambiente húmedo para la raíz y la espora. Espere al menos 24 horas antes de regar el compartimento de la raíz y tenga cuidado de no lavar la espora de la raíz. Antes de cerrar la placa de Petri con la tapa, asegúrese de que las muescas laterales de la tapa y la parte inferior de la placa de Petri estén alineadas para no dañar el tallo de la plántula.NOTA: El SAP-AS está listo para la inoculación cuando las raíces alcanzan la membrana filtrante de malla de nylon, idealmente unos días después del riego, por lo que no hay líquido libre. 7. Germinación de esporas en SAP (opcional) NOTA: Los materiales necesarios para este paso se enumeran en la Tabla de Materiales. Germinación de esporas.Triturar el SAP hidratado para obtener una textura suave (ver paso 3.3.1). Las burbujas de aire suelen desaparecer en 24 h o mediante autoclave (opcional) del SAP mezclado. Usando una jeringa de 20 mL sin aguja, pipetee aproximadamente 2 g (equivalente a 2 mL) de SAP mezclado en cada pocillo de la placa de 12 pocillos. Seleccione una espora bajo el microscopio de disección y utilice la pipeta extruida como se describe en la sección 6. Bajo el microscopio de disección, coloque una espora en el centro de cada pocillo. Incube la placa de 12 pocillos en la oscuridad en RT y controle la germinación periódicamente. Bajo el microscopio de disección, seleccione una espora con una hifa creciente (de al menos unos pocos milímetros de longitud). Agregue 1 mL de solución nutritiva mMS-1 al pocillo y espere unos minutos para que el medio se vuelva más fluido. Si es necesario, utilice la aguja de acupuntura para eliminar suavemente las esporas y las hifas del sustrato. Recoja la espora con una pipeta o llevando las raíces de una plántula a la superficie del medio para pegar la espora y las hifas a las raíces. Luego, coloque la plántula en la placa de Petri como se describe en el paso 5.1.3.NOTA: Coordine la germinación de las esporas y el crecimiento de las plántulas. Este método solo se ha probado con esporas de R. irregularis . 8. Seguimiento en vivo del desarrollo de la simbiosis NOTA: Los materiales necesarios para este paso se enumeran en la Tabla de Materiales. Observe rutinariamente con un microscopio de disección, vertical o invertido.Observe la parte superior de cada compartimento a 20x – 40x utilizando un microscopio de disección con iluminación blanca y campo oscuro. Si no se dispone de un microscopio invertido, observe el fondo de cada compartimento con un microscopio de disección o vertical invirtiendo la placa de Petri. Antes de invertir la placa de Petri, deje que el SAP-AS se seque durante 2 días para que el SAP se adhiera ligeramente al fondo de la placa de Petri. Realice observaciones detalladas a 40x a través de la parte inferior de la placa de Petri y hasta 100x (inmersión en aceite) a través del cubreobjetos. Observa las esporas y las redes de hifas.NOTA: Las estructuras fúngicas que se desarrollan dentro de los granos de SAP pueden mancharse.Prepare una solución de tinta y vinagre de acuerdo con Vierheilig et al. (1998)15. No calentar. Extraiga un grano de SAP que contenga hifas y esporas y colóquelo en la tinta en RT. La tinta penetrará en el grano de SAP y manchará las hifas y las esporas en pocos minutos. Retire el grano de SAP y colóquelo en una solución de nutrientes mMS-1 o agua del grifo. La tinta saldrá del grano en 12 h, pero las esporas y las hifas permanecerán manchadas. Presione el grano de SAP entre dos portaobjetos de microscopio para aplanarlo para la fotografía y el recuento de esporas. Observa los arbúsculos.Extraiga algunas raíces del compartimento de la raíz y tiña utilizando el protocolo de tinta y vinagre según Vierheilig et al. (1998)15. Tenga cuidado de no sumergir las raíces en la solución de KOH durante más de 2-3 minutos; De lo contrario, las raíces se volverán demasiado frágiles para los siguientes pasos y se desintegrarán en desechos inutilizables. Bajo un microscopio de disección, seleccione un fragmento de raíz de aproximadamente 5 mm de largo que pueda contener arbúsculos y colóquelo en un portaobjetos en una gota de agua. Con agujas de acupuntura o pinzas extremadamente delgadas, corte las raíces en capas de unas pocas células de grosor. Absorber el agua y comprobar al microscopio que los segmentos con arbúsculos siguen presentes y son de calidad satisfactoria, y que están correctamente colocados en el portaobjetos. En este punto, los arbúsculos deben ser fácilmente visibles dentro de las capas de células de la raíz. Deje secar durante 2-3 minutos para que las capas de la raíz se adhieran al portaobjetos. Agregue una gota de tampón de alcohol polivinílico-ácido lácticoglicerol (PVLG) y agregue el cubreobjetos. Observar mediante métodos de microscopía estándar.

Representative Results

El SAP-AS es una técnica sencilla y económica para el cultivo de hongos AM y la observación del desarrollo de estructuras fúngicas intrarradicales y extrarradicales. Aquí, proporcionamos un protocolo detallado para ayudar a los usuarios a configurar SAP-AS e introdujimos dos modificaciones en comparación con la descripción original del SAP-AS. En primer lugar, la presencia de SAP en el compartimento de la raíz a lo largo de la membrana de Nitex facilita la inoculación del sistema con una sola espora (Figura 1). Figura 1: Inoculación con una sola espora del SAP-AS. (A) Inoculación con una sola espora de Rhizophagus irregularis. (B) Inoculación con una sola espora de Funneliformis mosseae. Las flechas blancas indican el punto de inoculación. Barras de escala: 500 μm. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura. Es fácil identificar una zona con unas pocas raíces donde se puede depositar la espora. La ubicación exacta de la espora se puede marcar en la superficie de la tapa de la placa de Petri y verificarse periódicamente para la germinación y colonización de las raíces. La presencia de granos hidratados de SAP proporciona un ambiente húmedo propicio para la germinación de las esporas. La inoculación en las raíces próximas a la membrana de Nitex permite un rápido desarrollo de la simbiosis con el micelio extraradical para acceder rápidamente al compartimento de las hifas y buscar nutrientes (Figura 2). La capacidad de observar si la única espora colocada en el punto de inoculación germina o no también nos permite identificar y eliminar los cultivos no exitosos y reemplazarlos. En segundo lugar, los cubreobjetos en la parte inferior de la placa de Petri permiten obtener imágenes en vivo de alta resolución de la simbiosis AM-hongo (Figura 2B, C) y, en particular, del flujo citoplasmático dentro del micelio extraradical (Figura 2D). Figura 2: SAP-AS inoculado. (A) SAP-AS inoculado con una sola espora de Rhizophagus irregularis (DAOM 197198). La planta huésped es Plantago lanceolata. (B) Racimo de esporas observadas a través del cubreobjetos en el compartimento de las hifas bajo un microscopio estereoscópico. Barra de escala: 500 μm. (C) Fotografía de alta resolución del grupo de esporas observada a través del cubreobjetos bajo un microscopio óptico con un aumento de 10x. Barra de escala: 100 μm (D) Fotografía de alta resolución de hifas observadas a través del cubreobjetos bajo un microscopio óptico con un aumento de 100x. Barra de escala: 10 μm. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura. Los usuarios pueden intentar germinar esporas de hongos AM en SAP hidratadas con la solución nutritiva mMS-1 para garantizar que los SAP-AS se inoculen solo con esporas viables (Figura 3). Sin embargo, esto solo se probó con esporas comerciales de R. irregularis, y el éxito de la germinación de esporas en SAP hidratado con solución nutritiva mMS-1 puede variar significativamente con otras especies de hongos AM. Figura 3: Germinación de esporas de R. irregularis en placa de 12 pocillos. Barra de escala: 500 μm. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura. Finalmente, debido a que SAP-AS es una técnica in vivo y no estéril para propagar HMA, la placa de Petri puede manipularse en el banco y abrirse para muestrear raíces colonizadas, esporas libres o granos colonizados de SAP (Figura 4). Las estructuras fúngicas intrarradicales y extrarradicales se pueden teñir de manera similar a los HMA propagados en cultivos de órganos de marihuana o de raíz (Figura 4C). Figura 4: Estructuras fúngicas de AM extrarradicales e intrarradicales extraídas del SAP-AS. (A) Se observan esporas libres de R. irregularis en el compartimento de la raíz. Barra de escala: 200 μm. (B) Esporas de R. irregularis teñidas en SAP. Barra de escala: 500 μm. (C) Fragmentos de raíz teñidos que muestran las hifas y arbúsculos intrarradicales. Barras de escala: 50 μm, 100 μm. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura. Figura complementaria 1: Comparación del grosor de las diversas herramientas disponibles para manipular las esporas de hongos AM. Haga clic aquí para descargar este archivo. Figura complementaria 2: SAP-AS apilado. Haga clic aquí para descargar este archivo.

Discussion

La inoculación es el paso más crítico del protocolo, y las pipetas Pasteur de vidrio extruido demostraron ser una excelente herramienta para manipular con precisión esporas individuales de hongos AM mientras preservan su integridad. Las pipetas Pasteur de vidrio extruido se moldean fácilmente utilizando la llama de una vela o un mechero Bunsen, y la abertura se puede ajustar bajo el microscopio estereoscópico para que coincida con el tamaño de la espora que se pipetea. Es importante manipular las esporas con herramientas adaptadas al tamaño de la espora fúngica AM (Figura suplementaria 1) e inocular el SAP-AS cuando las raíces de la planta huésped sean lo suficientemente largas como para alcanzar la membrana Nitex donde se deposita la espora.

Los SAP-AS son fáciles de adaptar a los requisitos del experimento. Se pueden utilizar placas de Petri más grandes, con compartimentos múltiples, para monitorear, por ejemplo, la interacción entre cepas cercanas o entre diferentes especies de HMA o para modificar el entorno químico (pH) o biológico (introducción de nematodos, bacterias, hongos). También se pueden utilizar varias plantas hospederas micotróficas para proporcionar fotosintatos a los hongos AM. La solución nutritiva mMS-1 se derivó de la receta de medio mínimo (M) descrita por Bécard y Fortin (1988)15 menos la sacarosa, las vitaminas y el agar bacto para limitar las fuentes de carbono. Sin embargo, el SAP-AS puede complementarse con diversas soluciones nutritivas, dependiendo de los objetivos del experimento.

La propagación de los hongos AM en SAP-AS requiere un riego regular. El volumen limitado de vermiculita y SAP expone las raíces y el hongo AM a fluctuaciones de humedad, especialmente en placas de Petri estándar de dos compartimentos (10 cm de diámetro). La capacidad de expansión y, por lo tanto, la transparencia de los granos de SAP disminuye con el tiempo. De hecho, la presencia de cationes de la solución nutritiva limita progresivamente la expansión de la red de acrilato y requiere la sustitución del SAP al cabo de meses. Además, las algas verdes y el moho pueden crecer con el tiempo si las placas de Petri no se protegen adecuadamente de la luz o se riegan en exceso.

Hasta la fecha, se han cultivado con éxito siete especies de hongos AM en SAP-AS, lo que está muy por debajo del número de especies de hongos AM que se pueden propagar en cultivos en macetas. Sin embargo, tanto las condiciones bióticas como las abióticas en el SAP-AS son muy similares a las de los cultivos en macetas, y es probable que otras especies de hongos AM puedan propagarse en el SAP-AS. La inoculación directa de esporas en SAP-AS probablemente proporciona condiciones ambientales más cercanas a las de la rizosfera en un suelo natural debido a la presencia de exudados radiculares y/o bacterias, si se utilizan esporas/semillas no estériles para la inoculación. Esto debe ser preferible a la inoculación con esporas germinadas. Además, las condiciones que desencadenan la germinación de esporas dentro de la HMA aún no se conocen bien, por lo tanto, es posible que la SAP hidratada con la solución nutritiva mMS-1 no esté adaptada para germinar esporas de otras especies de hongos AM. Se probó la germinación de esporas en SAP hidratadas con solución nutritiva mMS-1 para seleccionar específicamente esporas viables para la etapa de inoculación utilizando solo inóculo de R. irregularis .

La inoculación y el seguimiento del desarrollo de la simbiosis AM se realizan fácilmente en SAP-AS. Las placas de Petri modificadas de dos compartimentos permiten el cultivo de diferentes especies de hongos AM. Paré et al.12 han propagado siete especies diferentes de HMA de seis géneros y tres familias. La modificación de placas de Petri de dos compartimentos se realiza fácilmente con herramientas económicas. El coste y la cantidad de materiales (vermiculita, SAP, pipeta Pasteur, etc.) y reactivos (mMS-1) necesarios para preparar y mantener el SAP-AS son limitados, lo que permite gestionar un gran número de SAP-AS a un coste mínimo. La capacidad de apilar el SAP-AS también reduce significativamente la huella de los cultivos de hongos AM en comparación con los cultivos en macetas. Por ejemplo, 50 SAP-AS (5 pilas de diez) pueden caber en un estante de 1 m de largo (Figura complementaria 2). Estas características hacen que el SAP-AS sea una técnica simple y económica que es compatible con la enseñanza de la simbiosis AM en cursos de laboratorio de secundaria o a nivel de pregrado en universidades. Los granos colonizados de SAP se pueden utilizar para inocular nuevos cultivos de SAP-AS o en macetas.

La presencia de un cubreobjetos en la parte posterior de la parte inferior de la placa de Petri permite la fotografía y el video de alta resolución de las estructuras fúngicas extrarradicales. El flujo citoplasmático se puede estudiar fácilmente en condiciones de vida muy cercanas a las condiciones naturales. Esto es de gran importancia para los estudios de las funciones de los hongos AM relacionadas con sus micelios (nutrientes, transporte de agua, estructura del suelo, etc.) y para los estudios de la morfogénesis de las hifas.

Los HMA completan su ciclo biológico en las raíces de las plantas y dentro de la rizosfera. El estudio de los microorganismos del suelo es complejo debido a la dificultad inherente de observar el entorno del suelo. El objetivo principal del SAP-AS es recrear un entorno lo más parecido posible a la rizosfera para la propagación de hongos AM, manteniendo la capacidad de observar el desarrollo de los hongos AM con gran detalle. Debido a que esto implica condiciones no estériles, la cantidad de carbono disponible debe limitarse para evitar la proliferación de microorganismos saprótrofos. El conocimiento del comportamiento de los hongos AM en la rizosfera es todavía extremadamente limitado, y el SAP-AS ofrece la posibilidad de realizar comparaciones detalladas entre especies en cuanto a su capacidad para alimentarse en el ambiente extrarradical, su producción de esporas y su colonización de raíces. Esto puede complicarse aún más si se añaden las interacciones con otras especies del suelo, como bacterias, nematodos, protistas y patógenos fúngicos de la raíz, y el conocimiento de las interacciones de la microbiota del suelo puede mejorarse gracias al SAP-AS.

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Nos gustaría agradecer a los dos revisores anónimos por sus sugerencias. La financiación de esta investigación fue proporcionada por el Ministerio de Agricultura y Agroalimentación de Canadá (AAFC) en el marco del proyecto J-002295 (Gestión y mejora de las colecciones biológicas de la AAFC).

Materials

100 x 15 mm Stackable Bi-Plate Kord Valmark 1204U09 https://www.thomassci.com/Laboratory-Supplies/Petri-Dishes/_/100-x-15-mm-Stackable-Bi-Plate
12-well plate  Greiner Bio-one 665180 https://shop.gbo.com/en/row/products/bioscience/cell-culture-products/cellstar-cell-culture-multiwell-plates/665180.html
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Paré, L., Banchini, C., Stefani, F. Inoculating and Observing Arbuscular Mycorrhizal Cultures on Superabsorbent Polymer-Based Autotrophic Systems. J. Vis. Exp. (208), e66848, doi:10.3791/66848 (2024).
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