تلقيح ومراقبة مزارع الميكوريزا الشجرية على أنظمة التغذية الذاتية القائمة على البوليمر فائق الامتصاص
Summary
هنا ، نصف تقنية بسيطة وغير مكلفة لتلقيح ومراقبة الفطريات الفطرية الشجرية في أنظمة التغذية الذاتية القائمة على البوليمر فائقة الامتصاص.
Abstract
يصعب التلاعب بالفطريات الجذرية الشجرية (AM) ومراقبتها بسبب ارتباطها الدائم بجذور النباتات وتكاثرها في الجذور. عادة ، يتم استزراع الفطريات AM في ظل ظروف الجسم الحي في زراعة وعاء مع مضيف ذاتي التغذية أو تحت ظروف المختبر مع الجذور المحولة Ri Transfer-DNA (مضيف غير متجانس) في طبق بتري. بالإضافة إلى ذلك ، تحدث زراعة الفطريات AM في زراعة الأواني في بيئة معتمة وغير معقمة. في المقابل ، تتضمن الثقافة في المختبر انتشار الفطريات AM في بيئة معقمة وشفافة. تم مؤخرا تطوير نظام التغذية الذاتية القائم على البوليمر فائق الامتصاص (SAP-AS) وثبت أنه يجمع بين مزايا كلتا الطريقتين مع تجنب قيود كل منهما (العتامة والمضيف غير المتجانس ، العقم). هنا ، نقدم بروتوكولا مفصلا لسهولة التحضير ، وتلقيح الأبواغ المفردة ، ومراقبة فطريات AM في SAP-AS. من خلال تعديل أطباق بتري ، كان من الممكن إجراء ملاحظات فوتوغرافية وفيديو عالية الدقة على العينات الحية ، والتي كانت ستكون صعبة أو مستحيلة مع تقنيات التيار في الجسم الحي وفي المختبر .
Introduction
الفطريات الجذرية الشجرية (AM) (Glomeromycotina) هي متعايشات جذور نباتية قديمة (~ 500 Ma1،2) ربما لعبت دورا أساسيا في استعمار التربة الأرضية بواسطة القصبات الهوائية. هذا التطور الطويل بين الفطريات AM والنباتات الرغامية يضع الفطريات الشجرية كتحفة من التبادلية بين المملكة. تزيد الخيوط الفطرية AM بشكل كبير من قدرة المضيف على البحث عن مغذيات التربة3 ، بما في ذلك نقل المغذيات إلى مضيفين جدد عبر شبكات الفطرياتالفطرية 4. تعمل الشبكة المغناطيسية على تحسين بنية التربة ، ويمكن أن يقلل إنتاج الجومالين من تآكل التربة5. يؤدي نقل جزء من الكربون الجوي إلى الجذر الفطري إلى زيادة عزل الكربون في التربة6. بشكل عام ، تعمل فطريات AM على تحسين مرونة النبات لكل من الضغوط اللاأحيائية والحيوية ، وبالتالي ، فقد حظيت باهتمام كبير في الإيكولوجيا الزراعية7. في الواقع ، تتمتع ممارسات الإدارة الزراعية الصديقة للفطريات بالقدرة على تقليل استخدام المدخلات الكيميائية لإنتاج المحاصيل وتحسين محتوى الكربون العضوي في التربة ، وهي أهداف مهمة يحتاج المزارعون إلى دمجها في ممارساتهم الإدارية من أجل الامتثال للالتزامات الوطنية والدولية فيما يتعلق بالانتقال إلى الممارسات الزراعية المستدامة ومكافحة تغير المناخ.
ومع ذلك ، فإن فطريات AM هي فطريات مجهرية للتربة ، ودراستها صعبة بسبب التغذية الحيوية الملزمة وتوزيع الجذور. التربة هي واحدة من أصعب البيئات الحيوية للدراسة بسبب عتامتها ، والتنوع الهائل في المنافذ ، والتفاعلات متعددة التغذية على جميع المستويات. لذلك فإن عزل الفطريات AM وانتشارها وتوصيفها أمر صعب. حتىمنتصف القرن 20 ، تم تمييز الأنواع الفطرية AM فقط التي تشكل sporocarps8. ومع ذلك ، فإن غالبية الأنواع الفطرية AM تنتج جراثيم غير sporocarpic تتراوح من ~ 20 ميكرومتر إلى ~ 500 ميكرومتر في القطر. فتح وصف تقنية غربلة التربةالرطبة 9 الطريق لوصف هذه الأنواع الفطرية AM ، وزاد معدل وصف الأنواع منذ ذلك الحين. ومع ذلك ، تمثل الفطريات AM مجموعة صغيرة من الأنواع مقارنة ب Dikarya.
مزارع الفخ ، أي التلقيح بالجراثيم أو عينة التربة البيئية التي تحتوي على جراثيم فطرية AM من وعاء مملوء بمواد معقمة مثل التورم والفيرميكوليت وبذور معقمة من مضيف (الكراث ، الموز) ، هي إحدى الطرق لنشر الفطريات AM في ظل ظروف خاضعة للرقابة10. ومع ذلك ، لا يمكن تقييم نجاح التلقيح إلا من خلال البحث عن وجود arbuscules في شظايا الجذر بعد تلطيخ أو عن طريق غربلة عينة فرعية أو وعاء كامل لعزل الجراثيم. يوصى عادة بعدم إزعاج النظام لمدة 6-12 أسبوعا على الأقل قبل تحليل ثقافة الوعاء. تقنية الاستزراع هذه مناسبة لنشر معظم الأنواع الفطرية المعروفة AM ، لكن المراقبة الحية للتعايش الفطري غير ممكنة ، ونجاح التلقيح غير مؤكد ، خاصة عند محاولة مزارع بوغ مفردة.
على العكس من ذلك ، يمكن مراقبة الانتشار في المختبر للفطريات AM مباشرة بفضل شفافية وسط الاستزراع11 ، لكن تقنية الاستزراع هذه تتطلب توافر الجذور المحولة ووجود الكربون في وسط الاستزراع للعمل في بيئة معقمة. يجب تعقيم الجراثيم ، وجنبا إلى جنب مع الارتباط مع مضيف غير متجانس ، لا يتم نشر معظم الأنواع الفطرية المعروفة AM بنجاح باستخدام هذه التقنية.
لذلك ، فإن انتشار الفطريات AM باستخدام التقنيات الحالية ، على الرغم من تأسيسها واستخدامها على نطاق واسع في معظم المختبرات ، له بعض القيود على دراسة الفطريات AM. طور Paré et al. (2022) 12 تقنية في الجسم الحي باستخدام بوليمر شفاف فائق الامتصاص (SAP) بالاشتراك مع نباتات كاملة لنشر فطريات AM. هذه التقنية ، المصممة كنظام تغذية ذاتية قائم على SAP (SAP-AS) ، بسيطة وغير مكلفة وتجمع بين مزايا زراعة الأواني (الارتباط بمضيف ذاتي التغذية ، وظروف غير معقمة) والثقافات في المختبر (وسط شفاف ، مراقبة حية لتطور التكافل). هنا ، نقدم بروتوكولا يشرح كيفية إعداد الثقافات بتلقيح بوغ واحد واستخدام SAP-AS لمراقبة التكبير العالي للفطريات غير الجذرية. على وجه التحديد ، نصف كيفية تعديل أطباق بتري المكونة من جزأين ، وإعداد محلول المغذيات ، وإعداد البوليمر فائق الامتصاص (SAP) ، وإعداد الشتلات ، وتجميع SAP-AS وتلقيحها ببوغ واحد ، وإنبات الجراثيم ، والمراقبة الحية لتطور التكافل.
Protocol
Representative Results
Discussion
التلقيح هو الخطوة الأكثر أهمية في البروتوكول ، وقد أثبتت ماصات باستور الزجاجية المبثوقة أنها أداة ممتازة لمعالجة الجراثيم المفردة من فطريات AM بدقة مع الحفاظ على سلامتها. يتم تشكيل ماصات باستور الزجاجية المبثوقة بسهولة باستخدام شعلة شمعة أو موقد بنسن ، ويمكن ضبط الفتحة تحت المجهر المجسم لتتناسب مع حجم البوغ الذي يتم سحبه. من المهم معالجة الجراثيم بأدوات تتكيف مع حجم الأبواغ الفطرية AM (الشكل التكميلي 1) وتلقيح SAP-AS عندما تكون جذور النبات المضيف طويلة بما يكفي للوصول إلى غشاء Nitex حيث يتم ترسيب البوغ.
من السهل تكييف SAP-AS مع متطلبات التجربة. يمكن استخدام أطباق بتري الأكبر حجما ، مع مقصورات متعددة ، لمراقبة ، على سبيل المثال ، التفاعل بين السلالات النسبية الوثيقة أو بين الأنواع المختلفة من AMF أو لتعديل المادة الكيميائية (درجة الحموضة) أو البيئة البيولوجية (إدخال الديدان الخيطية والبكتيريا والفطريات). يمكن أيضا استخدام العديد من النباتات المضيفة الفطرية التغذية لتزويد الفطريات AM بعملية البناء الضوئي. تم اشتقاق محلول المغذيات mMS-1 من الحد الأدنى (M) وصفة متوسطة وصفها Bécard and Fortin (1988) 15 ناقص السكروز والفيتامينات وأجار البكتو للحد من مصادر الكربون. ومع ذلك ، يمكن استكمال SAP-AS بمحاليل مغذية مختلفة ، اعتمادا على أهداف التجربة.
يتطلب انتشار الفطريات AM في SAP-AS سقيا منتظما. يعرض الحجم المحدود للفيرميكوليت و SAP الجذور وفطر AM لتقلبات الرطوبة ، خاصة في أطباق بتري القياسية المكونة من جزأين (قطر 10 سم). القدرة على التوسع ، وبالتالي ، تقل شفافية حبيبات SAP بمرور الوقت. في الواقع ، فإن وجود الكاتيونات من محلول المغذيات يحد تدريجيا من توسع شبكة الأكريليت ويتطلب استبدال SAP بعد أشهر. بالإضافة إلى ذلك ، قد تنمو الطحالب الخضراء والعفن بمرور الوقت إذا لم تكن أطباق بتري محمية بشكل صحيح من الضوء أو الإفراط في الماء.
حتى الآن ، تمت زراعة سبعة أنواع فطرية AM بنجاح في SAP-AS ، وهو أقل بكثير من عدد الأنواع الفطرية AM التي يمكن نشرها في مزارع الأواني. ومع ذلك ، فإن كل من الظروف الحيوية وغير الحيوية في SAP-AS تشبه إلى حد كبير تلك الموجودة في مزارع الأواني ، ومن المحتمل أن تكون الأنواع الفطرية الأخرى AM قادرة على الانتشار في SAP-AS. من المحتمل أن يوفر التلقيح المباشر للجراثيم في SAP-AS ظروفا بيئية أقرب إلى تلك الموجودة في الجذور في التربة الطبيعية بسبب وجود إفرازات الجذر و / أو البكتيريا ، إذا تم استخدام جراثيم / بذور غير معقمة للتلقيح. يجب تفضيل هذا على التلقيح بالجراثيم المنبتة. بالإضافة إلى ذلك ، لا تزال الظروف التي تؤدي إلى إنبات البوغ داخل AMF غير مفهومة بشكل جيد ، وبالتالي قد لا يتم تكييف SAP المائي بمحلول مغذي mMS-1 لإنبات جراثيم الأنواع الفطرية الأخرى AM. تم اختبار إنبات البوغ على SAP المائي بمحلول مغذي mMS-1 لاختيار جراثيم قابلة للحياة على وجه التحديد لخطوة التلقيح باستخدام لقاح R. irregularis فقط.
يتم إجراء التلقيح ومراقبة تطور تكافل AM بسهولة في SAP-AS. تسمح أطباق بتري المعدلة المكونة من جزأين بزراعة أنواع فطرية مختلفة من AM. قام Paré et al.12 بنشر سبعة أنواع مختلفة من AMF من ستة أجناس وثلاث عائلات. يتم تعديل أطباق بتري المكونة من جزأين بسهولة باستخدام أدوات غير مكلفة. تكلفة وكمية المواد (الفيرميكوليت ، SAP ، ماصة باستور ، إلخ) والكواشف (mMS-1) اللازمة لإعداد وصيانة SAP-AS محدودة ، مما يسمح بإدارة عدد كبير من SAP-AS بأقل تكلفة. كما أن القدرة على تكديس SAP-AS تقلل بشكل كبير من بصمة الثقافات الفطرية AM مقارنة بمزارع الأواني. على سبيل المثال ، يمكن وضع 50 SAP-AS (5 أكوام من عشرة) على رف طوله 1 متر (الشكل التكميلي 2). هذه الميزات تجعل SAP-AS تقنية بسيطة وغير مكلفة متوافقة مع تدريس AM symbiosis في دورات مختبر المدرسة الثانوية أو على المستوى الجامعي في الجامعات. يمكن استخدام الحبوب المستعمرة من SAP لتلقيح SAP-AS الجديدة أو ثقافات الأواني.
يسمح وجود غطاء في الجزء الخلفي من الجزء السفلي من طبق بتري بالتصوير الفوتوغرافي والفيديو عالي الدقة للهياكل الفطرية غير الجذرية. يمكن دراسة التدفق السيتوبلازمي بسهولة في ظل ظروف معيشية قريبة جدا من الظروف الطبيعية. هذا له أهمية كبيرة لدراسات وظائف الفطريات AM المتعلقة بفطرياتها (المغذيات ، نقل المياه ، بنية التربة ، إلخ) ولدراسات التشكل الخلفي.
يكمل AMF دورته البيولوجية في جذور النباتات وداخل الجذور. دراسة الكائنات الحية الدقيقة في التربة معقدة بسبب الصعوبة الكامنة في مراقبة بيئة التربة. الهدف الرئيسي من SAP-AS هو إعادة إنشاء بيئة مشابهة قدر الإمكان للجذمور لانتشار فطريات AM مع الحفاظ على القدرة على مراقبة تطور فطريات AM بتفصيل كبير. لأن هذا يعني ظروفا غير معقمة ، يجب أن تكون كمية الكربون المتاحة محدودة لتجنب انتشار الكائنات الحية الدقيقة المغذية. لا تزال معرفة سلوك الفطريات AM في الجذور محدودة للغاية ، ويوفر SAP-AS إمكانية إجراء مقارنات مفصلة بين الأنواع فيما يتعلق بقدرتها على العلف في البيئة غير الجذرية ، وإنتاج بوغها ، واستعمار جذورها. يمكن أن يكون هذا أكثر تعقيدا عن طريق إضافة تفاعلات مع أنواع التربة الأخرى مثل البكتيريا والديدان الخيطية والطلائعيات ومسببات الأمراض الفطرية الجذرية ، ويمكن تحسين معرفة تفاعلات ميكروبيوتا التربة بفضل SAP-AS.
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
نود أن نشكر المراجعين المجهولين على اقتراحاتهما. تم توفير التمويل لهذا البحث من قبل الزراعة والأغذية الزراعية الكندية (AAFC) في إطار المشروع J-002295 (إدارة وتعزيز المجموعات البيولوجية لمركز العين للإخصاب).
Materials
| 100 x 15 mm Stackable Bi-Plate | Kord Valmark | 1204U09 | https://www.thomassci.com/Laboratory-Supplies/Petri-Dishes/_/100-x-15-mm-Stackable-Bi-Plate |
| 12-well plate | Greiner Bio-one | 665180 | https://shop.gbo.com/en/row/products/bioscience/cell-culture-products/cellstar-cell-culture-multiwell-plates/665180.html |
| 18 mm round glass coverslips | Fisher Scientific | 12-545-100 | https://www.fishersci.com/shop/products/fisherbrand-cover-glasses-circles-11/12545100#?keyword=12-545-100 |
| 20 mL Syringe PP/PE without needle | Millipore Sigma | Z683620-100EA | https://www.sigmaaldrich.com/CA/en/product/aldrich/z683620?utm_source=google&utm_medium= cpc&utm_campaign=20674735406 &utm_content=157607444391&gc lid=Cj0KCQiA5rGuBhCnARIsAN11 vgQOT_WPRg9WFyBEyoO4b0x1 -F7Tks4houU7VTRS5EiYM9l0F-B oL7saAmFoEALw_wcB |
| Acupuncture needle | Lierre | A143-LP1-3075 | https://www.lierre.ca/products/lierre-plus-acupuncture-needles-100pcs?gad _source=1&gclid=Cj0KCQiA5rGuBh CnARIsAN11vgTwupmw51UTdR k9cKr4ewi12W3dyVikenzH3sjdUB4 g41G-_KnvppoaAkbTEALw_wcB& utm_campaign=PMax-needles&utm_content=shopify_CA_ 5213169090694_35001500991622 &utm_medium=cpc&utm_source= google&variant=35001500991622 |
| Blotting paper | FLINN | FB0678 | https://www.flinnsci.ca/blotting-paper-12-x-19-pkg.-of-10/fb0678/ |
| Commercial or scientific blender or kitchen hand blender | kitchenaid | KHBV53DG | https://www.kitchenaid.ca/en_ca/countertop-appliances/hand-blenders/hand-blender-products/p.variable-speed-corded-hand-blender.khbv53dg.html |
| Dremel 199 Carving Bit | Dremel | 2615000199 | https://www.dremel.com/ca/en/p/199-2615000199 |
| Dry SAP medium granulometry 1–2 mm | HORTA-SORB MD | 00810085242789 | https://www.horticulturalalliance.com/product/horta-sorb-md-granule/ |
| Feather Stainless-Steel Blades for Dissecting Knife Handles | Fisher Scientific | 08-916-5B | https://www.fishersci.ca/shop/products/graham-field-stainless-steel-blades-dissecting-knife-handles-8/089165b |
| Glass Pasteur pipettes 230 mm | Kimble | RK-25554-14 | https://www.coleparmer.ca/i/dwk-life-sciences-kimble-disposable-pasteur-pipettes-plugged-end-borosilicate-glass-230-mm-1000-cs/2555414 |
| Ink | Sheaffer | 94321 | https://www.amazon.com/Sheaffer-Skrip-Bottled-Black-94231/dp/B002IKKKUU |
| Melting guide: modified paint Scraper, 2-in | Mastercraft | #049-7335-8 | https://www.canadiantire.ca/en/pdp/mastercraft-carbon-steel-flexible-spackling-putty-knife-wall-paint-scraper-2-in-0497335p.0497335.html?loc=plp |
| Microscopy glass slide | Fisher Scientific | 12-552-5 | https://www.fishersci.com/shop/products/fisherbrand-frosted-microscope-slides-4/125525 |
| Nitex nylon mesh filter screen | Dynamic Aqua-Supply Ltd. | NTX30-108 | https://dynamicaquasupply.com/products/nitex-screen?_pos=1&_sid=ffc105328&_ss=r& variant=6945749106731 |
| Paper clip | Makanu | Clips-BK-41mm-24 | https://www.amazon.ca/classeur-standard-grandes-trombones-excellentes |
| Parafilm | Avantor/vwr | 470201-930 | https://www.avantorsciences.com/ca/en/product/8882964/parafilm |
| Plantago lanceolata seeds | ecoumene | NA | https://www.ecoumene.com/produit/semences/herbacees/plantain-lanceole-bio/ |
| Polyvinyl alcohol-lactic acid-glycerol (PVLG). | NA | NA | https://invam.ku.edu/recipes |
| Pyrography kit with fine tip | Walnut Hollow | 483103 | https://www.walnuthollow.com/collections/creative-wood-burning/products/walnut-hollow-creative-versa-tool |
| Silicone sealant | Aqueon | 100165003 | https://www.aqueon.com/products/aquariums/silicone-sealant |
| Surgeon scalpel handle | Fisher Scientific | 22-079657 | https://www.fishersci.ca/shop/products/surgical-design-scalpel-handles-blades/22079657#?keyword=scalpel |
| Two Speed Rotary Tool Kit | Dremel | 200-1/21 | https://www.dremel.com/ca/en/p/200-1-21-f0130200ah |
| Vermiculite | PRO-MIX | 4981110 | https://www.canadiantire.ca/fr/pdp/vermiculite-pro-mix-9-l-0597936p.0597936.html |
| X1000 Round Coverslip dia. 30 mm #1 (0.13–0.16 mm) | Fisher Scientific | 12164692 | https://www.fishersci.fi/shop/products/x1000-cover-slip-diam-30-mm-n-1-1/12164692 |
References
- Dotzler, N., Krings, M., Taylor, T. N., Agerer, R. Germination shields in Scutellospora (Glomeromycota: Diversisporales, Gigasporaceae) from the 400 million-year-old Rhynie chert. Mycol Prog. 5 (3), 178-184 (2006).
- Redecker, D. Glomalean fungi from the ordovician. Science. 289 (5486), 1920-1921 (2000).
- Olsson, P. A., Jakobsen, I., Wallander, H. . Foraging and Resource Allocation Strategies of Mycorrhizal Fungi in a Patchy Environment. Mycorrhizal Ecology. Ecological Studies. , (2003).
- Zheng, C., Chai, M., Jiang, S., Zhang, S., Christie, P., Zhang, J. Foraging capability of extraradical mycelium of arbuscular mycorrhizal fungi to soil phosphorus patches and evidence of carry-over effect on new host plant. Plant Soil. 387 (1-2), 201-217 (2015).
- Singh, A. K., et al. The role of glomalin in mitigation of multiple soil degradation problems. Crit Rev Environ Sci Technol. 52 (9), 1604-1638 (2022).
- Wilson, G. W. T., Rice, C. W., Rillig, M. C., Springer, A., Hartnett, D. C. Soil aggregation and carbon sequestration are tightly correlated with the abundance of arbuscular mycorrhizal fungi: results from long-term field experiments. Ecol Lett. 12 (5), 452-461 (2009).
- Gianinazzi, S., Gollotte, A., Binet, M. -. N., van Tuinen, D., Redecker, D., Wipf, D. Agroecology: the key role of arbuscular mycorrhizas in ecosystem services. Mycorrhiza. 20 (8), 519-530 (2010).
- Stürmer, S. L. A history of the taxonomy and systematics of arbuscular mycorrhizal fungi belonging to the phylum Glomeromycota. Mycorrhiza. 22 (4), 247-258 (2012).
- Gerdemann, J. W., Nicolson, T. H. Spores of mycorrhizal Endogone species extracted from soil by wet sieving and decanting. Trans Br Mycol Soc. 46 (2), 235-244 (1963).
- Walker, C., Vestberg, M. A simple and inexpensive method for producing and maintaining closed pot cultures of arbuscular mycorrhizal fungi. Agr Sci Finland. 3, 233-240 (1994).
- Fortin, J. A., et al. Arbuscular mycorrhiza on root-organ cultures. Can J Bot. 80 (1), 1-20 (2002).
- Paré, L., Banchini, C., Hamel, C., Bernier, L., Stefani, F. A simple and low-cost technique to initiate single-spore cultures of arbuscular mycorrhizal fungi using a superabsorbent polymer. Symbiosis. 88, 61-73 (2022).
- Saha, A., Sekharan, S., Manna, U. Superabsorbent hydrogel (SAH) as a soil amendment for drought management: A review. Soil Tillage Res. 204, 104736 (2020).
- Bécard, G., Fortin, J. A. Early events of vesicular-arbuscular mycorrhiza formation on Ri T-DNA transformed roots. New Phytol. 108 (2), 211-218 (1988).
- Vierheilig, H., Coughlan, A. P., Wyss, U., Piché, Y. Ink and vinegar, a simple staining technique for arbuscular-mycorrhizal fungi. Appl Environ Microbiol. 64 (12), 5004-5007 (1998).
