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Environment

Inokulation und Beobachtung von arbuskulären Mykorrhizakulturen auf superabsorbierenden polymerbasierten autotrophen Systemen

Published: June 14, 2024
doi:
10.3791/66848
, ,
1Centre d’Étude de la Forêt (CEF) and Institut de Biologie Intégrative et des Systèmes (IBIS),Université Laval, 2Ottawa Research and Development Centre, Agriculture and Agri-Food Canada

Summary

Hier beschreiben wir eine einfache und kostengünstige Technik zur Inokulation und Beobachtung von arbuskulären Mykorrhizapilzen in superabsorbierenden polymerbasierten autotrophen Systemen.

Abstract

Arbuskuläre Mykorrhizapilze (AM) sind aufgrund ihrer dauerhaften Assoziation mit Pflanzenwurzeln und ihrer Vermehrung in der Rhizosphäre schwer zu manipulieren und zu beobachten. Typischerweise werden AM-Pilze unter in vivo Bedingungen in Topfkultur mit einem autotrophen Wirt oder unter in vitro Bedingungen mit Ri Transfer-DNA transformierten Wurzeln (heterotropher Wirt) in einer Petrischale kultiviert. Darüber hinaus erfolgt die Kultivierung von AM-Pilzen in Topfkulturen in einer undurchsichtigen und unsterilen Umgebung. Im Gegensatz dazu handelt es sich bei der In-vitro-Kultur um die Vermehrung von AM-Pilzen in einer sterilen, transparenten Umgebung. Das superabsorbierende polymerbasierte autotrophe System (SAP-AS) wurde kürzlich entwickelt und hat gezeigt, dass es die Vorteile beider Methoden kombiniert und gleichzeitig ihre jeweiligen Einschränkungen (Opazität und heterotropher Wirt, Sterilität) vermeidet. Hier stellen wir ein detailliertes Protokoll für die einfache Vorbereitung, die Inokulation mit einzelnen Sporen und die Beobachtung von AM-Pilzen in SAP-AS vor. Durch die Modifikation der Petrischalen waren hochauflösende Foto- und Videobeobachtungen an lebenden Proben möglich, die mit den derzeitigen in vivo und in vitro Techniken nur schwer oder gar nicht möglich gewesen wären.

Introduction

Arbuskuläre Mykorrhizapilze (Glomeromycotina) sind uralte Pflanzenwurzelsymbionten (~500 Ma 1,2), die möglicherweise eine wesentliche Rolle bei der Besiedlung terrestrischer Böden durch Tracheophyten gespielt haben. Diese lange Koevolution zwischen AM-Pilzen und Tracheophyten macht die arbuskuläre Mykorrhiza zu einem Meisterwerk des Mutualismus zwischen den Reichen. AM-Pilzhyphen erhöhen signifikant die Fähigkeit des Wirts, nach Bodennährstoffen zu suchen3, einschließlich der Nährstoffverschleppung zu neuen Wirten über Mykorrhizanetzwerke4. Das Hyphennetzwerk verbessert die Bodenstruktur, und die Produktion von Glomalin könnte die Bodenerosion verringern5. Die Übertragung eines Teils des atmosphärischen Kohlenstoffs auf den Pilzwurzelsymbionten erhöht die Kohlenstoffbindung im Boden6. Insgesamt verbessern AM-Pilze die Widerstandsfähigkeit der Pflanzen sowohl gegenüber abiotischen als auch gegenüber biotischem Stress und haben daher in der Agrarökologie erhebliche Aufmerksamkeit erhalten7. In der Tat haben pilzfreundliche landwirtschaftliche Bewirtschaftungspraktiken am Morgen das Potenzial, den Einsatz chemischer Betriebsmittel für die Pflanzenproduktion zu reduzieren und den Gehalt an organischem Kohlenstoff im Boden zu verbessern – wichtige Ziele, die Landwirte in ihre Bewirtschaftungspraktiken integrieren müssen, um den nationalen und internationalen Verpflichtungen in Bezug auf den Übergang zu nachhaltigen landwirtschaftlichen Praktiken und den Kampf gegen den Klimawandel nachzukommen.

AM-Pilze sind jedoch bodenmikroskopisch kleine Pilze, und ihre Untersuchung ist aufgrund ihrer obligaten Biotrophie und Rhizosphärenverteilung schwierig. Der Boden ist eines der am schwierigsten zu untersuchenden Biotope aufgrund seiner Opazität, der großen Vielfalt an Nischen und der multitrophischen Wechselwirkungen auf allen Skalen. Die Isolierung, Vermehrung und Charakterisierung von AM-Pilzen ist daher schwierig. Bis zur Mitte des 20. Jahrhunderts wurden nur AM-Pilzarten charakterisiert, die Sporokarpe bilden8. Die Mehrheit der AM-Pilzarten produziert jedoch nicht-sporokarpe Sporen mit einem Durchmesser von ~20 μm bis ~500 μm. Die Beschreibung der Boden-Nasssiebtechnik9 eröffnete den Weg zur Beschreibung dieser AM-Pilzarten, und die Rate der Artenbeschreibungen hat seitdem zugenommen. Dennoch stellen AM-Pilze im Vergleich zu Dikarya eine kleine Gruppe von Arten dar.

Fallenkulturen, d.h. die Inokulation mit Sporen oder einer Umweltbodenprobe, die AM-Pilzsporen eines Topfes enthält, der mit autoklaviertem Material wie Turface und Vermiculit und einem sterilisierten Saatgut eines Wirts (Porree, Wegerich) gefüllt ist, ist eine Möglichkeit, AM-Pilze unter kontrollierten Bedingungen zu vermehren10. Der Erfolg der Inokulation kann jedoch nur beurteilt werden, indem nach der Färbung nach dem Vorhandensein von Arbuskeln in Wurzelfragmenten gesucht wird oder eine Teilprobe oder der gesamte Topf nass gesiebt wird, um Sporen zu isolieren. In der Regel wird empfohlen, das System mindestens 6-12 Wochen vor der Analyse der Topfkultur nicht zu stören. Diese Kulturtechnik eignet sich für die Vermehrung der meisten bekannten AM-Pilzarten, aber eine Live-Beobachtung des Pilzsymbionten ist nicht möglich, und der Erfolg der Inokulation ist ungewiss, insbesondere wenn Einzelsporenkulturen versucht werden.

Im Gegensatz dazu kann die In-vitro-Vermehrung von AM-Pilzen dank der Transparenz des Nährmediums11 live überwacht werden, aber diese Kulturtechnik erfordert die Verfügbarkeit von transformierten Wurzeln und das Vorhandensein von Kohlenstoff im Kulturmedium, um in einer sterilen Umgebung zu funktionieren. Die Sporen müssen sterilisiert werden, und zusammen mit der Assoziation mit einem heterotrophen Wirt werden die meisten der bekannten AM-Pilzarten mit dieser Technik nicht erfolgreich vermehrt.

Daher hat die Vermehrung von AM-Pilzen mit den derzeitigen Techniken, obwohl sie etabliert und in den meisten Laboratorien weit verbreitet ist, einige Einschränkungen für die Untersuchung von AM-Pilzen. Paré et al. (2022)12 entwickelten eine In-vivo-Technik , bei der ein transparentes superabsorbierendes Polymer (SAP) in Kombination mit ganzen Pflanzen verwendet wird, um AM-Pilze zu vermehren. Die Technik, die als SAP-basiertes autotrophes System (SAP-AS) konzipiert ist, ist einfach und kostengünstig und kombiniert die Vorteile der Pot-Kultur (Assoziation mit einem autotrophen Wirt, unsterile Bedingungen) und der In-vitro-Kultur (transparentes Medium, Live-Monitoring der Symbioseentwicklung). Hier stellen wir ein Protokoll vor, das erklärt, wie man die Kulturen mit Einzelsporen-Inokulation einrichtet und das SAP-AS für die Beobachtung des extraradikalen Myzels mit hoher Vergrößerung verwendet. Konkret beschreiben wir, wie man Zweikammer-Petrischalen modifiziert, die Nährlösung vorbereitet, das Superabsorberpolymer (SAP) vorbereitet, die Sämlinge vorbereitet, das SAP-AS zusammensetzt und mit einer einzigen Spore impft, die Sporen vorkeimt und die Entwicklung der Symbiose live überwacht.

Protocol

1. Modifikation von Petrischalen mit zwei Kammern HINWEIS: Die für diesen Schritt erforderlichen Materialien sind in der Materialtabelle aufgeführt. Modifizieren Sie den Deckel der Petrischale.Bohren Sie mit dem Rotationswerkzeug und dem entsprechenden Schnitzmeißel zwei Löcher (~7 mm Durchmesser) in die Oberseite des Deckels und eine 1 cm Öffnung in die Seite. Ein Loch wird für die Bewässerung des Wurzelkompartiments (Vermiculit) und das andere für das Kompartiment der Hyphen (SAP) verwendet. Modifizieren Sie den Boden der Petrischale.Bohren Sie mit dem elektrischen Drehwerkzeug eine Kerbe in die Seite des Petrischalenbodens für den Pflanzenstiel. Achten Sie darauf, dass die Kerbe nicht zu tief ist, damit die Flüssigkeit nicht abläuft. Diese Kerbe wird mit der 1 cm breiten Öffnung im Deckel ausgerichtet (Schritt 1.1). Um die Kunststoffbarriere der Petrischale mit zwei Kammern durch die Nylonnetz-Filtermembran zu ersetzen, bohren Sie mit dem elektrischen Drehwerkzeug eine 30 mm lange rechteckige Kerbe bis zum Boden der Petrischale. Für eine hochauflösende Betrachtung bohren Sie kreisförmige Löcher mit einem Durchmesser von ~25 mm in den Boden der Petrischale. Je nach Bedarf können Sie ein einzelnes Loch (oder mehrere Löcher) auf der SAP-Seite oder eines in jedem Fach bohren. Achten Sie darauf, dass die Löcher nicht direkt unter die Spüllöcher des Deckels gebohrt werden. Installieren Sie die Nylon-Mesh-Filtermembran.Verwenden Sie die Metallführung und die Büroklammer, um das Stück der Nylon-Mesh-Filtermembran an Ort und Stelle zu klemmen und fest auf die Kunststoffbarriere zu drücken. Richten Sie die Oberseite der Membran an der Oberseite der Kunststoffbarriere aus. Stellen Sie sicher, dass die Membran aus der Unterseite der Führung herausragt. Schneiden Sie mit dem Brandbekämpfungsset entlang der Kante der Metallführung, um die Membran am Boden der Petrischale und an der Kunststoffbarriere, die die beiden Kammern trennt, zu schmelzen und abzudichten. Während die Metallführung und die Büroklammer noch an Ort und Stelle sind, entfernen Sie vorsichtig überschüssige Nylonnetzfiltermembran mit einer Pinzette. Vergewissern Sie sich unter dem Präpariermikroskop, dass die Nylonnetz-Filtermembran ordnungsgemäß mit dem Kunststoff abgedichtet ist, um ein Eindringen der Wurzel in das Hyphenfach (SAP) zu verhindern. Deckglas anbringen.HINWEIS: Das Deckglas wird unter die Petrischale gelegt. Dadurch kann das Tauchöl verwendet und das Deckglas gereinigt werden.Platzieren Sie den Silikondichtstoff entlang des Randes der kreisförmigen Löcher (außerhalb des Bodens der Petrischale). Legen Sie das Deckglas auf die Außenseite des Petrischalenbodens und drücken Sie es vorsichtig an, um eine perfekte Haftung zu gewährleisten. Lassen Sie es trocknen und entfernen Sie überschüssiges Dichtmittel mit einer Rasierklinge. Prüfen und reinigen.Verwenden Sie einen Luftstoß, um Staub oder Plastikteile zu entfernen, die an der Petrischale haften geblieben sein könnten. Untersuchen Sie unter einem Präpariermikroskop, um eventuelle Defekte zu identifizieren und zu korrigieren.HINWEIS: Tragen Sie Handschuhe, um Fingerabdrücke auf den Petrischalen zu vermeiden 2. Zubereitung von 1 L Nährlösung mMS-1 Bereiten Sie Stammlösungen vor.Makronährstoffe: Wiegen und lösen Sie Folgendes in 1 l destilliertem Wasser auf:7,31 g MgSO4·7 H2O, 0,80 g KNO3, 0,65 g KCl und 0,048 g KH2PO4. mit einem Gewicht von 2,88 g Ca(NO3)2·4H2O und in 1 L destilliertem Wasser auflösen. 0,80 g NaFeEDTA abwiegen und in 0,5 l destilliertem Wasser auflösen. 0,375 g KI abwiegen und in 0,5 l destilliertem Wasser auflösen. Mikronährstoffe3 g MnCl2·4H2O in 100 mL destilliertem Wasser. 1.325 g ZnSO4· auflösen7H2O in 100 mL destilliertem Wasser. 0,75 g H3BO3 werden in 100 ml destilliertem Wasser gelöst. Wenn sie aufgelöst sind, mischen Sie die in den Schritten 2.1.5.1 bis 2.1.5.3 hergestellten Lösungen. 0,65 g CuSO4·5H2O und lösen Sie sie in 50 mL destilliertem Wasser auf. 0,12 g Na2MoO4·2H2O in 100 mL destilliertem Wasser. Geben Sie 5 mL der Lösung aus Schritt 2.1.5.5 und 1 mL aus Schritt 2.1.5.6 zur Lösung aus Schritt 2.1.5.4. Das Volumen der in Schritt 2.1.5.7 erhaltenen Lösung wird mit destilliertem Wasser auf 500 ml eingestellt. Bereiten Sie 1 l mMS-1-Medium vor.Geben Sie 700 ml destilliertes Wasser in eine 2-Liter-Glasflasche. Unter ständigem Rühren mit einem Magnetstab 100 ml Makronährstofflösung (Schritt 2.1.1), 100 ml Calciumnitratlösung (Schritt 2.1.2), 5 ml Eisen-EDTA-Lösung (Schritt 2.1.3), 1 ml KI-Lösung (Schritt 2.1.4) und 1 ml Mikronährstofflösung (Schritt 2.1.5) hinzufügen. Stellen Sie das Volumen der Lösung auf 1000 ml ein.HINWEIS: mMS-1 ist eine Adaption von Bécard und Fortin (1988)14. Die Sterilisation bei 121 °C für 15 min ist optional, da der SAP-AS nicht steril ist. Der pH-Wert wird nicht angepasst, da das SAP einen starken Puffereffekt hat, und Paré et al. (2022)12 zeigten, dass die Bedingungen unter SAP relativ neutral waren (6,7 bis 7,4). 3. Vorbereitung von SAP HINWEIS: Die für diesen Schritt erforderlichen Materialien sind in der Materialtabelle aufgeführt. Hydrate SAP: Mischen Sie 5 g trockenes SAP mit 500 mL mMS-1 Nährlösung (Schritt 2.2). 12 h (über Nacht) bei Raumtemperatur (RT) hydratisieren lassen. Die hydratisierten SAP-Körner abtropfen lassen und auffangen.Wenn hydratisiertes SAP zum Befüllen der 12-Well-Platte (Abschnitt 7) verwendet wird, lassen Sie das hydratisierte SAP nicht ab und mischen Sie das hydratisierte Getreide und den Rest der mMS-1-Nährlösung.HINWEIS: Es stehen drei Granulometrien des trockenen SAP zur Verfügung: klein, mittel und groß. Die mittlere Körnung (1-2 mm) ist am besten geeignet. Der Saft der großen Granulometrie schluckt zu viel, wenn er hydratisiert wird, und der Deckel der Petrischale lässt sich nicht schließen, während der kleine Granulatometrie-SAP wenig Platz zwischen ihnen lässt, was eine Einschränkung für die Beobachtungen der Pilzstruktur zwischen den Körnern darstellt. 4. Vorbereitung der Setzlinge HINWEIS: Die für diesen Schritt erforderlichen Materialien sind in der Materialtabelle aufgeführt. Die Samen von P. lanceolata auf Löschpapier, das mit mMS-1-Nährlösung in einer Petrischale angefeuchtet ist, keimen lassen. Inkubieren Sie im Dunkeln bei RT. Rehydrieren Sie nach Bedarf, bis die Wurzeln mindestens 2 cm lang sind. 5. Aufbau und Verwaltung von SAP-AS HINWEIS: Die für diesen Schritt erforderlichen Materialien sind in der Materialtabelle aufgeführt. SAP-AS zusammenbauen (Schritt 1 + Schritt 2 + Schritt 3 + Schritt 4)Setzen Sie den Sämlingsstiel in die Kerbe an der Seite der Petrischale, mit der Wurzel nach innen und den Keimblättern/Blättern und Stängeln nach außen. Bedecken Sie die Wurzeln mit ca. 1,5-2 g Vermiculit. Hydratisieren Sie das Wurzelkompartiment mit 8 ml mMS-1 Nährlösung. Dies hilft, die Wurzel und das Vermiculit zu stabilisieren. Geben Sie 5 g hydratisiertes SAP entlang der Nylonnetz-Filtermembran an der Seite des Wurzelfachs. Geben Sie 15 g hydratisiertes SAP in das Hyphenfach. Das Hyphenfach ist das Fach ohne Kerbe an der Seite des Bodens der Petrischale. Bevor Sie die Petrischale mit dem Deckel verschließen, stellen Sie sicher, dass die seitlichen Kerben des Deckels und der Unterseite der Petrischale ausgerichtet sind, um den Stiel nicht zu beschädigen. Verschließen Sie die Petrischale mit einem Paraffinstreifen, der den Boden und den Deckel verbindet, und achten Sie darauf, den jungen Stiel nicht zu zerquetschen. Wiegen und notieren Sie das durchschnittliche Gewicht der Petrischale, um zu bestimmen, wann das SAP-AS rehydriert werden muss. Stapeln Sie die Petrischale, um den Platz zu optimieren. Bewahren Sie die Petrischale im Dunkeln auf, indem Sie eine undurchsichtige Abdeckung mit einer Öffnung an der Seite für die Sämlinge verwenden. Verwalten Sie SAP-AS.Hydratisieren Sie die Petrischalen nur mit mMS-1 Nährlösung. Verwenden Sie das durchschnittliche Gewicht als Referenz. Wenn die Petrischale um 5-6 g heller geworden ist, fügen Sie mMS-1 Nährlösung hinzu, um sie wieder auf das ursprüngliche Gewicht zu bringen. Stellen Sie sicher, dass Vermiculit und SAP hydratisiert, aber nicht überflutet werden. Die Wurzeln müssen Zugang zu Sauerstoff haben. Wenn sich der Sämling und sein Pilzpartner entwickeln, bewässern Sie sie häufiger. Es ist nicht notwendig, beide Fächer gleichzeitig zu bewässern. Der Bewässerungsbedarf variiert je nach Entwicklung der Sämlinge, aber auch je nach den Umweltbedingungen, unter denen SAP-AS inkubiert werden. Reduziere den Bewässerungsbedarf, indem du alte Blätter entfernst, wenn die Pflanze mehr als drei gesunde Blätter hat. Entferne abgestorbene Blätter.HINWEIS: Das Vorhandensein von Kationen wie K+, Mg2+ und Ca2+ in der mMS-1-Nährlösung neigt dazu, die Ausdehnung des SAP-Netzwerks13 im Laufe der Zeit zu verringern. 6. Beimpfung des SAP-AS mit einer einzigen Spore HINWEIS: Die für diesen Schritt erforderlichen Materialien sind in der Materialtabelle aufgeführt. Mit einer einzigen Spore impfen.Erhitzen Sie die Glaspipette mit einer Flammenkerze oder einem Bunsenbrenner. Ziehen Sie, während das Glas schmilzt, um das Glasrohr zu dehnen, bis es sich trennt. Brechen Sie unter einem Stereomikroskop die Spitze der Glaspipette, um den Innendurchmesser (typischerweise 100-300 μm) zu verringern. Dies erleichtert die Manipulation einzelner Sporen erheblich. Öffnen Sie die Petrischale, lokalisieren Sie die Stelle, an der die Spore platziert werden soll, und machen Sie eine Lücke zwischen den 5 g hydratisiertem SAP entlang der Nylonnetzfiltermembran frei, um einen Abschnitt einer Wurzel freizulegen. Nehmen Sie unter dem Präpariermikroskop mit der extrudierten Pipette eine Spore auf. Pipettieren Sie etwas Flüssigkeit, bevor Sie die Spore pipettieren. Vermeiden Sie das Pipettieren von Flüssigkeit nach dem Sammeln der Spore. Legen Sie die Spore unter dem Präpariermikroskop vorsichtig auf die Wurzel. Die Flüssigkeit, die vor dem Pipettieren der Spore pipettiert wird, hilft, die Spore auszustoßen. Wenn die Spore nicht an einer optimalen Stelle abgelagert wird, verwenden Sie eine Akupunkturnadel oder bürsten Sie die Haare, um die Spore wieder in Kontakt mit der Wurzel zu bringen. Machen Sie bei Bedarf ein Foto der auf der Wurzel abgelagerten Spore als Referenz und verwenden Sie einen Marker, um die Impfstelle zu lokalisieren. Ersetzen Sie das SAP über dem Wurzelfragment, um eine feuchte Mikroumgebung für die Wurzel und die Spore zu schaffen. Warten Sie mindestens 24 Stunden, bevor Sie das Wurzelfach bewässern, und achten Sie darauf, die Sporen nicht von der Wurzel abzuwaschen. Bevor Sie die Petrischale mit dem Deckel verschließen, stellen Sie sicher, dass die seitlichen Kerben des Deckels und der Boden der Petrischale ausgerichtet sind, um den Stiel des Sämlings nicht zu beschädigen.HINWEIS: Der SAP-AS ist bereit für die Inokulation, wenn die Wurzeln die Nylonnetz-Filtermembran erreichen, idealerweise einige Tage nach der Bewässerung, so dass keine freie Flüssigkeit vorhanden ist. 7. Sporenkeimung auf SAP (optional) HINWEIS: Die für diesen Schritt erforderlichen Materialien sind in der Materialtabelle aufgeführt. Keimung von Sporen.Mischen Sie das hydratisierte SAP, um eine glatte Textur zu erhalten (siehe Schritt 3.3.1). Luftblasen verschwinden in der Regel innerhalb von 24 h oder durch Autoklavieren (optional) des gemischten SAP. Pipettieren Sie mit einer 20-ml-Spritze ohne Nadel etwa 2 g (entspricht 2 ml) gemischtes SAP in jede Vertiefung der 12-Well-Platte. Wählen Sie eine Spore unter dem Präpariermikroskop aus und verwenden Sie die extrudierte Pipette wie in Abschnitt 6 beschrieben. Platzieren Sie unter dem Präpariermikroskop eine Spore in der Mitte jeder Vertiefung. Inkubieren Sie die 12-Well-Platte im Dunkeln bei RT und überwachen Sie die Keimung regelmäßig. Wählen Sie unter dem Präpariermikroskop eine Spore mit einer wachsenden Hyphen (mindestens einige Millimeter lang) aus. Geben Sie 1 ml mMS-1 Nährlösung in die Vertiefung und warten Sie einige Minuten, bis das Medium flüssiger wird. Verwenden Sie bei Bedarf die Akupunkturnadel, um die Sporen und Hyphen vorsichtig vom Substrat zu entfernen. Sammeln Sie die Spore entweder mit einer Pipette oder indem Sie die Wurzeln eines Sämlings an die Oberfläche des Mediums bringen, um die Sporen und Hyphen an die Wurzeln zu kleben. Legen Sie dann den Sämling in die Petrischale, wie in Schritt 5.1.3 beschrieben.HINWEIS: Koordinieren Sie die Sporenkeimung und das Wachstum der Sämlinge. Diese Methode wurde nur mit R . irregularis-Sporen getestet. 8. Live-Monitoring der Symbioseentwicklung HINWEIS: Die für diesen Schritt erforderlichen Materialien sind in der Materialtabelle aufgeführt. Beobachten Sie routinemäßig mit einem Präpariermikroskop, aufrechten oder inversen Mikroskop.Beobachten Sie die Oberseite jedes Fachs bei 20x – 40x mit einem Präpariermikroskop mit weißer Beleuchtung und Dunkelfeld. Wenn kein inverses Mikroskop zur Verfügung steht, beobachten Sie den Boden jedes Kompartiments mit einem Präparier- oder aufrechten Mikroskop, indem Sie die Petrischale umkehren. Lassen Sie das SAP-AS vor dem Umdrehen der Petrischale 2 Tage trocknen, damit das SAP leicht am Boden der Petrischale haftet. Machen Sie detaillierte Beobachtungen bei 40x durch den Boden der Petrischale und bis zu 100x (Ölimmersion) durch das Deckglas. Beobachte Sporen und Hyphennetzwerke.HINWEIS: Die Pilzstrukturen, die sich im Inneren der SAP-Körner entwickeln, können gefärbt werden.Bereiten Sie eine Tinten-Essig-Lösung nach Vierheilig et al. (1998)15 vor. Nicht erhitzen. Extrahieren Sie ein SAP-Korn, das Hyphen und Sporen enthält, und legen Sie es in die Tinte bei RT. Die Tinte dringt in das SAP-Korn ein und färbt die Hyphen und Sporen innerhalb weniger Minuten. Entfernen Sie das SAP-Getreide und legen Sie es in mMS-1 Nährlösung oder Leitungswasser. Die Tinte tritt innerhalb von 12 h aus dem Korn aus, aber die Sporen und Hyphen bleiben fleckig. Drücken Sie das SAP-Korn zwischen zwei Objektträger, um es für die Fotografie und Sporenzählung abzuflachen. Beobachten Sie Arbuskeln.Extrahieren Sie einige Wurzeln aus dem Wurzelkompartiment und färben Sie es mit dem Tinten- und Essigprotokoll nach Vierheilig et al. (1998)15. Achten Sie darauf, die Wurzeln nicht länger als 2-3 Minuten in die KOH-Lösung zu tauchen; Andernfalls werden die Wurzeln für die folgenden Schritte zu zerbrechlich und zerfallen in unbrauchbaren Schutt. Wählen Sie unter einem Präpariermikroskop ein etwa 5 mm langes Wurzelfragment aus, das Arbuskeln enthalten kann, und legen Sie es auf einen Objektträger in einen Tropfen Wasser. Reißen Sie mit Akupunkturnadeln oder einer hauchdünnen Pinzette die Wurzeln in Schichten von wenigen Zellen Dicke ab. Nehmen Sie das Wasser auf und prüfen Sie unter dem Mikroskop, ob die Segmente mit den Arbuskeln noch vorhanden und von zufriedenstellender Qualität sind und korrekt auf dem Objektträger platziert sind. Zu diesem Zeitpunkt müssen die Arbuskeln innerhalb der Wurzelzellschichten gut sichtbar sein. Lassen Sie es 2-3 Minuten trocknen, damit die Wurzelschichten am Objektträger haften. Fügen Sie einen Tropfen Polyvinylalkohol-Milchsäure-Glycerin (PVLG)-Puffer hinzu und fügen Sie das Deckglas hinzu. Beobachten Sie mit Standard-Mikroskopiemethoden.

Representative Results

Das SAP-AS ist eine einfache und kostengünstige Technik zur Kultivierung von AM-Pilzen und zur Beobachtung der Entwicklung von intraradikalen und extraradikalen Pilzstrukturen. Hier haben wir ein detailliertes Protokoll zur Verfügung gestellt, um den Benutzern bei der Einrichtung von SAP-AS zu helfen, und wir haben zwei Änderungen im Vergleich zur ursprünglichen Beschreibung von SAP-AS eingeführt. Erstens erleichtert das Vorhandensein von SAP auf dem Wurzelkompartiment entlang der Nitex-Membran die Inokulation des Systems mit einer einzigen Spore (Abbildung 1). Abbildung 1: Inokulation des SAP-AS mit einer einzelnen Spore. (A) Inokulation mit einer einzelnen Spore von Rhizophagus irregularis. (B) Inokulation mit einer einzigen Spore von Funneliformis mosseae. Die weißen Pfeile zeigen den Zeitpunkt der Impfung an. Maßstabsleisten: 500 μm. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen. Es ist einfach, einen Bereich mit wenigen Wurzeln zu identifizieren, an dem sich die Spore ablagern kann. Die genaue Position der Spore kann auf der Oberfläche des Petrischalendeckels markiert und periodisch auf Keimung und Besiedlung der Wurzeln überprüft werden. Das Vorhandensein von hydratisierten SAP-Körnern sorgt für ein feuchtes Milieu, das die Sporenkeimung begünstigt. Die Inokulation an den Wurzeln neben der Nitex-Membran ermöglicht eine schnelle Entwicklung der Symbiose mit dem extraradikalen Myzel, um schnell auf das Hyphenkompartiment zuzugreifen und nach Nährstoffen zu suchen (Abbildung 2). Die Möglichkeit zu beobachten, ob die einzelne Spore, die an der Impfstelle platziert wurde, keimt oder nicht, ermöglicht es uns auch, erfolglose Kulturen zu identifizieren, zu entfernen und zu ersetzen. Zweitens ermöglichen die Deckgläser am Boden der Petrischale eine hochauflösende Live-Abbildung der AM-Pilz-Symbiose (Abbildung 2B,C) und insbesondere der zytoplasmatischen Strömung innerhalb des extraradikalen Myzels (Abbildung 2D). Abbildung 2: Geimpftes SAP-AS. (A) SAP-AS, geimpft mit einer einzigen Spore des Rhizophagus irregularis (DAOM 197198). Die Wirtspflanze ist Plantago lanceolata. (B) Cluster von Sporen, die durch das Deckglas im Hyphenkompartiment unter einem Stereomikroskop beobachtet wurden. Maßstabsbalken: 500 μm. (C) Hochauflösendes Foto des Sporenclusters, das durch das Deckglas unter einem Lichtmikroskop bei 10-facher Vergrößerung beobachtet wurde. Maßstabsleiste: 100 μm (D) Hochauflösendes Foto von Hyphen, die durch das Deckglas unter einem Lichtmikroskop bei 100-facher Vergrößerung aufgenommen wurden. Maßstab: 10 μm. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen. Benutzer können versuchen, AM-Pilzsporen auf SAP zu keimen, das mit mMS-1-Nährlösung hydratisiert wurde, um sicherzustellen, dass die SAP-AS nur mit lebensfähigen Sporen geimpft werden (Abbildung 3). Dies wurde jedoch nur mit kommerziellen Sporen von R. irregularis getestet, und der Erfolg der Sporenkeimung auf SAP, das mit mMS-1-Nährlösung hydratisiert wurde, kann bei anderen AM-Pilzarten erheblich variieren. Abbildung 3: Keimung von R. irregularis-Sporen in einer 12-Well-Platte. Maßstab: 500 μm. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen. Da es sich bei SAP-AS um eine nicht sterile In-vivo-Technik zur Vermehrung von AMF handelt, kann die Petrischale auf dem Labortisch manipuliert und geöffnet werden, um besiedelte Wurzeln, freie Sporen oder besiedelte SAP-Körner zu beproben (Abbildung 4). Intraradikale und extraradikale Pilzstrukturen können auf ähnliche Weise angefärbt werden wie AMF, das in Topf- oder Wurzelorgankulturen vermehrt wird (Abbildung 4C). Abbildung 4: Extraradikale und intraradikale AM-Pilzstrukturen, die aus dem SAP-AS extrahiert wurden. (A) Freie Sporen von R. irregularis im Wurzelkompartiment beobachtet. Maßstabsbalken: 200 μm. (B) Sporen von R. irregularis in SAP gefärbt. Maßstabsbalken: 500 μm. (C) Gefärbte Wurzelfragmente mit den intraradikalischen Hyphen und Arbuskeln. Maßstabsstäbe: 50 μm, 100 μm. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen. Ergänzende Abbildung 1: Vergleich der Dicke der verschiedenen Werkzeuge, die zur Manipulation von AM-Pilzsporen zur Verfügung stehen. Bitte klicken Sie hier, um diese Datei herunterzuladen. Ergänzende Abbildung 2: Gestapeltes SAP-AS. Bitte klicken Sie hier, um diese Datei herunterzuladen.

Discussion

Die Inokulation ist der kritischste Schritt im Protokoll, und die Pasteur-Pipetten aus extrudiertem Glas erwiesen sich als hervorragendes Werkzeug, um einzelne Sporen von AM-Pilzen genau zu manipulieren und gleichzeitig ihre Integrität zu bewahren. Die Pasteur-Pipetten aus extrudiertem Glas lassen sich leicht mit der Flamme einer Kerze oder eines Bunsenbrenners formen, und die Öffnung kann unter dem Stereomikroskop an die Größe der zu pipettierenden Spore angepasst werden. Es ist wichtig, die Sporen mit Werkzeugen zu manipulieren, die an die Größe der AM-Pilzsporen angepasst sind (Ergänzende Abbildung 1) und das SAP-AS zu impfen, wenn die Wurzeln der Wirtspflanze lang genug sind, um die Nitex-Membran zu erreichen, wo die Spore abgelagert wird.

Die SAP-AS lassen sich leicht an die Anforderungen des Experiments anpassen. Größere Petrischalen mit mehreren Kompartimenten können verwendet werden, um beispielsweise die Wechselwirkung zwischen eng verwandten Stämmen oder zwischen verschiedenen AMF-Spezies zu überwachen oder die chemische (pH-Wert) oder biologische Umgebung zu verändern (Einführung von Nematoden, Bakterien, Pilzen). Auch verschiedene mykotrophe Wirtspflanzen können genutzt werden, um die AM-Pilze mit Photosynthesen zu versorgen. Die Nährlösung mMS-1 wurde aus der von Bécard und Fortin (1988)15 beschriebenen Minimal-(M)-Medium-Rezeptur abgeleitet, abzüglich der Saccharose, der Vitamine und des Bacto-Agars, um die Kohlenstoffquellen zu begrenzen. Das SAP-AS kann jedoch je nach Versuchszielen mit verschiedenen Nährlösungen ergänzt werden.

Die Vermehrung von AM-Pilzen in SAP-AS erfordert regelmäßiges Gießen. Das begrenzte Volumen an Vermiculit und SAP setzt die Wurzeln und den AM-Pilz Schwankungen der Feuchtigkeit aus, insbesondere in Standard-Petrischalen mit zwei Kammern (10 cm Durchmesser). Die Expansionsfähigkeit und damit die Transparenz der SAP-Körner nimmt mit der Zeit ab. Tatsächlich schränkt das Vorhandensein von Kationen aus der Nährlösung die Ausdehnung des Acrylatnetzwerks nach und nach ein und erfordert den Austausch des SAP nach Monaten. Darüber hinaus können Grünalgen und Schimmel mit der Zeit wachsen, wenn Petrischalen nicht richtig vor Licht geschützt oder überwässert werden.

Bisher wurden sieben AM-Pilzarten erfolgreich in SAP-AS kultiviert, was weit unter der Anzahl der AM-Pilzarten liegt, die in Topfkulturen vermehrt werden können. Sowohl die biotischen als auch die abiotischen Bedingungen in SAP-AS sind jedoch denen in Topfkulturen sehr ähnlich, und es ist wahrscheinlich, dass andere AM-Pilzarten in der Lage sein sollten, sich in SAP-AS zu vermehren. Die direkte Inokulation von Sporen in SAP-AS bietet aufgrund des Vorhandenseins von Wurzelexsudaten und/oder Bakterien wahrscheinlich Umweltbedingungen, die denen der Rhizosphäre in einem natürlichen Boden ähneln, wenn unsterile Sporen/Samen für die Inokulation verwendet werden. Dies sollte der Inokulation mit gekeimten Sporen vorzuziehen sein. Darüber hinaus sind die Bedingungen, die die Sporenkeimung innerhalb von AMF auslösen, noch wenig verstanden, so dass mit mMS-1-Nährlösung hydratisiertes SAP möglicherweise nicht an die Keimung von Sporen anderer AM-Pilzarten angepasst ist. Die Sporenkeimung auf SAP, das mit mMS-1-Nährlösung hydratisiert wurde, wurde getestet, um spezifisch lebensfähige Sporen für den Inokulationsschritt auszuwählen, wobei nur R. irregularis inoculum verwendet wurde.

Die Inokulation und das Monitoring der Entwicklung der AM-Symbiose sind in SAP-AS einfach durchzuführen. Die modifizierten Zwei-Kompartiment-Petrischalen ermöglichen die Kultivierung verschiedener AM-Pilzarten. Paré et al.12 haben sieben verschiedene AMF-Arten aus sechs Gattungen und drei Familien vermehrt. Die Modifikation von Petrischalen mit zwei Kammern ist mit kostengünstigen Werkzeugen leicht zu bewerkstelligen. Die Kosten und die Menge an Materialien (Vermiculit, SAP, Pasteur-Pipette usw.) und Reagenzien (mMS-1), die für die Vorbereitung und Wartung des SAP-AS erforderlich sind, sind begrenzt, so dass eine große Anzahl von SAP-AS zu minimalen Kosten verwaltet werden kann. Die Möglichkeit, das SAP-AS zu stapeln, reduziert auch den Fußabdruck von AM-Pilzkulturen im Vergleich zu Topfkulturen erheblich. So passen z.B. 50 SAP-AS (5 Zehnerstapel) auf ein 1 m langes Regal (Ergänzende Abbildung 2). Diese Eigenschaften machen das SAP-AS zu einer einfachen und kostengünstigen Technik, die mit dem Unterrichten von AM-Symbiose in Gymnasiallaboren oder im Grundstudium an Universitäten kompatibel ist. Besiedelte Körner von SAP können zur Inokulation neuer SAP-AS- oder Topfkulturen verwendet werden.

Das Vorhandensein eines Deckglases auf der Rückseite des Bodens der Petrischale ermöglicht hochauflösende Fotografien und Videos der extraradikalen Pilzstrukturen. Die zytoplasmatische Strömung kann leicht unter Lebensbedingungen untersucht werden, die den natürlichen Bedingungen sehr nahe kommen. Dies ist von großer Bedeutung für die Untersuchung der Funktionen von AM-Pilzen in Bezug auf ihre Myzelien (Nährstoffe, Wassertransport, Bodenstruktur usw.) und für Studien der Hyphenmorphogenese.

AMF vervollständigen ihren biologischen Zyklus in den Pflanzenwurzeln und in der Rhizosphäre. Die Untersuchung von Bodenmikroorganismen ist komplex, da es inhärent schwierig ist, die Bodenumgebung zu beobachten. Das Hauptziel des SAP-AS ist es, eine der Rhizosphäre möglichst ähnliche Umgebung für die Vermehrung von AM-Pilzen zu schaffen und gleichzeitig die Möglichkeit zu erhalten, die Entwicklung der AM-Pilze sehr detailliert zu beobachten. Da dies unsterile Bedingungen impliziert, sollte die Menge an verfügbarem Kohlenstoff begrenzt werden, um die Vermehrung saprotropher Mikroorganismen zu vermeiden. Das Wissen über das Verhalten von AM-Pilzen in der Rhizosphäre ist noch äußerst begrenzt, und das SAP-AS bietet die Möglichkeit, detaillierte Vergleiche zwischen Arten hinsichtlich ihrer Fähigkeit zur Nahrungssuche in der extraradikalen Umgebung, ihrer Sporenproduktion und ihrer Wurzelbesiedlung anzustellen. Dies kann durch das Hinzufügen von Wechselwirkungen mit anderen Bodenarten wie Bakterien, Nematoden, Protisten und Wurzelpilzpathogenen weiter erschwert werden, und das Wissen über die Wechselwirkungen zwischen Bodenmikrobiota kann dank des SAP-AS verbessert werden.

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Wir danken den beiden anonymen Gutachtern für ihre Anregungen. Die Finanzierung dieser Forschung wurde von Agriculture and Agri-Food Canada (AAFC) im Rahmen des Projekts J-002295 (Management and enhancement of AAFC’s biological collections) bereitgestellt.

Materials

100 x 15 mm Stackable Bi-Plate Kord Valmark 1204U09 https://www.thomassci.com/Laboratory-Supplies/Petri-Dishes/_/100-x-15-mm-Stackable-Bi-Plate
12-well plate  Greiner Bio-one 665180 https://shop.gbo.com/en/row/products/bioscience/cell-culture-products/cellstar-cell-culture-multiwell-plates/665180.html
18 mm round glass coverslips Fisher Scientific 12-545-100 https://www.fishersci.com/shop/products/fisherbrand-cover-glasses-circles-11/12545100#?keyword=12-545-100
20 mL Syringe PP/PE without needle Millipore Sigma Z683620-100EA https://www.sigmaaldrich.com/CA/en/product/aldrich/z683620?utm_source=google&utm_medium=
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Blotting paper FLINN  FB0678 https://www.flinnsci.ca/blotting-paper-12-x-19-pkg.-of-10/fb0678/
Commercial or scientific blender or kitchen hand blender kitchenaid KHBV53DG https://www.kitchenaid.ca/en_ca/countertop-appliances/hand-blenders/hand-blender-products/p.variable-speed-corded-hand-blender.khbv53dg.html 
Dremel 199 Carving Bit Dremel 2615000199 https://www.dremel.com/ca/en/p/199-2615000199
Dry SAP medium granulometry 1–2 mm HORTA-SORB MD 00810085242789 https://www.horticulturalalliance.com/product/horta-sorb-md-granule/
Feather Stainless-Steel Blades for Dissecting Knife Handles  Fisher Scientific 08-916-5B https://www.fishersci.ca/shop/products/graham-field-stainless-steel-blades-dissecting-knife-handles-8/089165b
Glass Pasteur pipettes 230 mm Kimble RK-25554-14 https://www.coleparmer.ca/i/dwk-life-sciences-kimble-disposable-pasteur-pipettes-plugged-end-borosilicate-glass-230-mm-1000-cs/2555414
Ink Sheaffer 94321 https://www.amazon.com/Sheaffer-Skrip-Bottled-Black-94231/dp/B002IKKKUU
Melting guide: modified paint Scraper, 2-in Mastercraft #049-7335-8 https://www.canadiantire.ca/en/pdp/mastercraft-carbon-steel-flexible-spackling-putty-knife-wall-paint-scraper-2-in-0497335p.0497335.html?loc=plp
Microscopy glass slide Fisher Scientific 12-552-5 https://www.fishersci.com/shop/products/fisherbrand-frosted-microscope-slides-4/125525
Nitex nylon mesh filter screen  Dynamic Aqua-Supply Ltd. NTX30-108 https://dynamicaquasupply.com/products/nitex-screen?_pos=1&_sid=ffc105328&_ss=r&
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Paper clip Makanu ‎Clips-BK-41mm-24 https://www.amazon.ca/classeur-standard-grandes-trombones-excellentes
Parafilm Avantor/vwr 470201-930 https://www.avantorsciences.com/ca/en/product/8882964/parafilm
Plantago lanceolata seeds ecoumene NA https://www.ecoumene.com/produit/semences/herbacees/plantain-lanceole-bio/
Polyvinyl alcohol-lactic acid-glycerol (PVLG). NA NA https://invam.ku.edu/recipes
Pyrography kit with fine tip Walnut Hollow 483103 https://www.walnuthollow.com/collections/creative-wood-burning/products/walnut-hollow-creative-versa-tool
Silicone sealant Aqueon 100165003 https://www.aqueon.com/products/aquariums/silicone-sealant
Surgeon scalpel handle Fisher Scientific 22-079657 https://www.fishersci.ca/shop/products/surgical-design-scalpel-handles-blades/22079657#?keyword=scalpel
Two Speed Rotary Tool Kit Dremel 200-1/21 https://www.dremel.com/ca/en/p/200-1-21-f0130200ah
Vermiculite PRO-MIX 4981110 https://www.canadiantire.ca/fr/pdp/vermiculite-pro-mix-9-l-0597936p.0597936.html
X1000 Round Coverslip dia. 30 mm #1 (0.13–0.16 mm) Fisher Scientific 12164692 https://www.fishersci.fi/shop/products/x1000-cover-slip-diam-30-mm-n-1-1/12164692
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References

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Paré, L., Banchini, C., Stefani, F. Inoculating and Observing Arbuscular Mycorrhizal Cultures on Superabsorbent Polymer-Based Autotrophic Systems. J. Vis. Exp. (208), e66848, doi:10.3791/66848 (2024).
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