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Inoculação e observação de culturas micorrízicas arbusculares em sistemas autotróficos superabsorventes à base de polímeros

Published: June 14, 2024
doi:
10.3791/66848
, ,
1Centre d’Étude de la Forêt (CEF) and Institut de Biologie Intégrative et des Systèmes (IBIS),Université Laval, 2Ottawa Research and Development Centre, Agriculture and Agri-Food Canada

Summary

Aqui, descrevemos uma técnica simples e barata para inocular e observar fungos micorrízicos arbusculares em sistemas autotróficos superabsorventes à base de polímeros.

Abstract

Os fungos micorrízicos arbusculares (AM) são difíceis de manipular e observar devido à sua associação permanente com raízes de plantas e propagação na rizosfera. Normalmente, os fungos de micorrizas arbusculares são cultivados em condições in vivo em cultura de vasos com um hospedeiro autotrófico ou em condições in vitro com raízes transformadas em Ri Transfer-DNA (hospedeiro heterotrófico) em uma placa de Petri. Além disso, o cultivo de fungos de micorrizas arbusculares em cultura em vasos ocorre em ambiente opaco e não estéril. Em contraste, a cultura in vitro envolve a propagação de fungos de micorrizas arbusculares em um ambiente estéril e transparente. O sistema autotrófico à base de polímero superabsorvente (SAP-AS) foi recentemente desenvolvido e demonstrou combinar as vantagens de ambos os métodos, evitando suas respectivas limitações (opacidade e hospedeiro heterotrófico, esterilidade). Aqui, apresentamos um protocolo detalhado para fácil preparação, inoculação de esporos únicos e observação de fungos de micorrizas arbusculares em SAP-AS. Ao modificar as placas de Petri, observações fotográficas e de vídeo de alta resolução foram possíveis em espécimes vivos, o que teria sido difícil ou impossível com as técnicas atuais in vivo e in vitro .

Introduction

Os fungos micorrízicos arbusculares (AM) (Glomeromycotina) são antigos simbiontes da raiz de plantas (~500 Ma 1,2) que podem ter desempenhado um papel essencial na colonização de solos terrestres por traqueófitos. Essa longa coevolução entre fungos de micorrizas arbusculares e traqueófitos coloca a micorriza arbuscular como uma obra-prima do mutualismo entre reinos. As hifas fúngicas de micorrizas arbusculares aumentam significativamente a capacidade do hospedeiro de procurar nutrientes no solo3, incluindo o transporte de nutrientes para novos hospedeiros por meio de redes micorrízicas4. A rede de hifas melhora a estrutura do solo e a produção de glomalina pode reduzir a erosão do solo5. A transferência de parte do carbono atmosférico para o simbionte da raiz do fungo aumenta o sequestro de carbono do solo6. No geral, os fungos de micorrizas arbusculares melhoram a resiliência das plantas a estresses abióticos e bióticos e, portanto, têm recebido atenção considerável na agroecologia7. De fato, as práticas de manejo agrícola amigáveis aos fungos de micorriza do ar livre têm o potencial de reduzir o uso de insumos químicos para a produção agrícola e melhorar o teor de carbono orgânico do solo, que são objetivos importantes que os agricultores precisam integrar em suas práticas de manejo para cumprir os compromissos nacionais e internacionais relativos à transição para práticas agrícolas sustentáveis e à luta contra as mudanças climáticas.

No entanto, os fungos de micorrizas arbusculares são fungos microscópicos do solo, e seu estudo é difícil devido à sua biotrofia obrigatória e distribuição da rizosfera. O solo é um dos biótopos mais difíceis de estudar devido à sua opacidade, à enorme diversidade de nichos e às interações multitróficas em todas as escalas. O isolamento, propagação e caracterização de fungos de micorrizas arbusculares são, portanto, difíceis. Até meados doséculo 20, apenas espécies de fungos de micorrizas arbusculares formando esporocarpos haviam sido caracterizadas8. No entanto, a maioria das espécies de fungos de micorrizas arbusculares produz esporos não esporocárpicos que variam de ~ 20 μm a ~ 500 μm de diâmetro. A descrição da técnica de peneiramento úmido do solo9 abriu caminho para a descrição dessas espécies de fungos de micorrizas arbusculares, e a taxa de descrição das espécies aumentou desde então. No entanto, os fungos de micorrizas arbusculares representam um pequeno grupo de espécies em comparação com Dikarya.

As culturas armadilha, ou seja, a inoculação com esporos ou uma amostra ambiental de solo contendo esporos de fungos de micorrizas arbusculares de um vaso cheio de material autoclavado, como turface e vermiculita, e uma semente esterilizada de um hospedeiro (alho-poró, banana), é uma maneira de propagar fungos de micorrizas arbusculares sob condições controladas10. No entanto, o sucesso da inoculação só pode ser avaliado procurando a presença de arbúsculos em fragmentos de raiz após a coloração ou peneirando úmidamente uma subamostra ou todo o vaso para isolar esporos. Geralmente, é recomendado não perturbar o sistema por pelo menos 6 a 12 semanas antes da análise da cultura em vaso. Esta técnica de cultura é adequada para a propagação da maioria das espécies de fungos de micorrizas arbusculares conhecidas, mas a observação ao vivo do simbionte fúngico não é possível e o sucesso da inoculação é incerto, especialmente quando são tentadas culturas de esporos únicos.

Pelo contrário, a propagação in vitro de fungos de micorrizas arbusculares pode ser monitorada ao vivo graças à transparência do meio de cultura11, mas essa técnica de cultivo requer a disponibilidade de raízes transformadas e a presença de carbono no meio de cultura para funcionar em um ambiente estéril. Os esporos devem ser esterilizados e, juntamente com a associação com um hospedeiro heterotrófico, a maioria das espécies de fungos de micorrizas arbusculares conhecidas não são propagadas com sucesso usando essa técnica.

Portanto, a propagação de fungos de micorrizas arbusculares utilizando técnicas atuais, embora estabelecidas e amplamente utilizadas na maioria dos laboratórios, apresenta algumas limitações para o estudo de fungos de micorrizas arbusculares. Paré et al. (2022)12 desenvolveram uma técnica in vivo usando um polímero superabsorvente transparente (SAP) em combinação com plantas inteiras para propagar fungos de micorrizas arbusculares. A técnica, projetada como um sistema autotrófico baseado em SAP (SAP-AS), é simples e barata e combina as vantagens da cultura em vaso (associação com um hospedeiro autotrófico, condições não estéreis) e culturas in vitro (meio transparente, monitoramento ao vivo do desenvolvimento da simbiose). Aqui, apresentamos um protocolo explicando como configurar as culturas com inoculação de esporos únicos e usar o SAP-AS para observação de alta ampliação do micélio extrarradical. Especificamente, descrevemos como modificar placas de Petri de dois compartimentos, preparar a solução nutritiva, preparar o polímero superabsorvente (SAP), preparar as mudas, montar o SAP-AS e inocular com um único esporo, pré-germinar os esporos e monitorar ao vivo o desenvolvimento da simbiose.

Protocol

1. Modificação de placas de Petri de dois compartimentos NOTA: Os materiais necessários para esta etapa estão listados na Tabela de Materiais. Modifique a tampa da placa de Petri.Usando a ferramenta rotativa e a broca de trinchar apropriada, faça dois furos (~7 mm de diâmetro) na parte superior da tampa e uma abertura de 1 cm na lateral. Um orifício será usado para irrigar o compartimento da raiz (vermiculita) e o outro para o compartimento das hifas (SAP). Modifique o fundo da placa de Petri.Faça um entalhe na lateral do fundo da placa de Petri para o caule da planta usando a ferramenta rotativa elétrica. Certifique-se de que o entalhe não seja muito profundo para evitar que o líquido escorra. Este entalhe se alinhará com a abertura de 1 cm na tampa (etapa 1.1). Para substituir a barreira plástica da placa de Petri de compartimento duplo pela membrana do filtro de malha de náilon, use a ferramenta rotativa elétrica para perfurar um entalhe retangular de 30 mm até o fundo da placa de Petri. Para observação de alta resolução, faça furos circulares de ~ 25 mm de diâmetro no fundo da placa de Petri. Dependendo dos requisitos, faça um único furo (ou vários furos) no lado do SAP ou um em cada compartimento. Certifique-se de que os orifícios não sejam perfurados diretamente sob os orifícios de irrigação da tampa. Instale a membrana do filtro de malha de nylon.Use a guia de metal e o clipe de papel para prender o pedaço da membrana do filtro de malha de náilon no lugar e pressione-o firmemente na barreira de plástico. Alinhe a parte superior da membrana com a parte superior da barreira de plástico. Certifique-se de que a membrana se projeta da parte inferior da guia. Usando o kit de pirografia, corte ao longo da borda da guia de metal para derreter e selar a membrana no fundo da placa de Petri e a barreira plástica que separa os dois compartimentos. Com a guia de metal e o clipe de papel ainda no lugar, remova cuidadosamente o excesso de membrana do filtro de malha de náilon com uma pinça. Verifique sob o microscópio de dissecação se a membrana do filtro de malha de náilon está devidamente selada ao plástico para evitar a penetração da raiz no compartimento da hifa (SAP). Instale a lamínula.NOTA: A lamínula é colocada sob a placa de Petri. Isso permite que o óleo de imersão seja usado e a lamínula seja limpa.Coloque o selante de silicone ao longo da borda dos orifícios circulares (fora do fundo da placa de Petri). Coloque a lamínula do lado de fora do fundo da placa de Petri e pressione suavemente para garantir uma aderência perfeita. Deixe secar e remova o excesso de selante com uma lâmina de barbear. Inspecione e limpe.Use um jato de ar para remover qualquer poeira ou pedaços de plástico que possam ter aderido à placa de Petri. Inspecione sob um microscópio de dissecação para identificar e corrigir quaisquer defeitos.NOTA: Use luvas para evitar impressões digitais nas placas de Petri 2. Preparação de 1 L de solução nutritiva mMS-1 Prepare soluções de estoque.Macronutrientes: Pesar e dissolver o seguinte em 1 L de água destilada:7,31 g de MgSO4·7 H2O, 0,80 g de KNO3, 0,65 g de KCl e 0,048 g de KH2PO4,. Pesar 2,88 g de Ca(NO3)2·4H2O e dissolver em 1 L de água destilada. Pesar 0,80 g de NaFeEDTA e dissolver em 0,5 L de água destilada. Pesar 0,375 g de KI e dissolver em 0,5 L de água destilada. MicronutrientesDissolver 3 g de MnCl2·4H2O em 100 mL de água destilada. Dissolver 1,325 g de ZnSO4·7H2O em 100 mL de água destilada. Dissolver 0,75 g de H3BO3 em 100 ml de água destilada. Quando dissolvido, misturar as soluções preparadas nas etapas 2.1.5.1-2.1.5.3. Pesar 0,65 g de CuSO4·5H2O e dissolver em 50 mL de água destilada. Dissolva 0,12 g de Na2MoO4·2H2O em 100 mL de água destilada. Adicione 5 ml da solução do passo 2.1.5.5 e 1 ml do passo 2.1.5.6 à solução do passo 2.1.5.4. Ajustar o volume da solução obtida no passo 2.1.5.7 para 500 ml com água destilada. Prepare 1 L de mídia mMS-1.Adicione 700 mL de água destilada a uma garrafa de vidro de 2 L. Enquanto mexe constantemente com uma barra magnética, adicione 100 mL de solução de macronutrientes (etapa 2.1.1), 100 mL de solução de nitrato de cálcio (etapa 2.1.2), 5 mL de solução férrica de EDTA (etapa 2.1.3), 1 mL de solução de KI (etapa 2.1.4) e 1 mL de solução de micronutrientes (etapa 2.1.5). Ajuste o volume da solução para 1000 mL.NOTA: mMS-1 é adaptado de Bécard e Fortin (1988)14. A esterilização a 121 °C por 15 min é opcional, pois o SAP-AS não é estéril. O pH não é ajustado porque o PAS tem um forte efeito tampão, e Paré et al. (2022)12 mostraram que as condições no PAS eram relativamente neutras (6,7 a 7,4). 3. Preparação do SAP NOTA: Os materiais necessários para esta etapa estão listados na Tabela de Materiais. Hidratar SAP: misturar 5 g de SAP seco com 500 ml de solução nutritiva mMS-1 (passo 2.2). Deixe hidratar por 12 h (durante a noite) em temperatura ambiente (RT). Escorra e recolha os grãos SAP hidratados.Quando o SAP hidratado for usado para encher a placa de 12 poços (seção 7), não drene o SAP hidratado e misture o grão hidratado e o restante da solução nutritiva mMS-1.NOTA: Três granulometrias do SAP seco estão disponíveis: pequeno, médio e grande. A granulometria média (1-2 mm) é a mais adequada. O SAP de grande granulometria engole muito quando hidratado e a tampa da placa de Petri não pode ser fechada, enquanto o SAP de pequena granulometria deixa pouco espaço entre eles, o que é uma limitação para as observações da estrutura fúngica entre os grãos. 4. Preparação de mudas NOTA: Os materiais necessários para esta etapa estão listados na Tabela de Materiais. Germinar as sementes de P. lanceolata em papel mata-borrão umedecido com solução nutritiva mMS-1 em uma placa de Petri. Incube no escuro em RT. Reidrate conforme necessário até que as radículas tenham pelo menos 2 cm de comprimento. 5. Montagem e gestão do SAP-AS NOTA: Os materiais necessários para esta etapa estão listados na Tabela de Materiais. Montar SAP-AS (etapa 1 + etapa 2 + etapa 3 + etapa 4)Coloque o caule da muda no entalhe na lateral da placa de Petri com a raiz para dentro e os cotilédones / folhas e caules para fora. Cubra as raízes com aproximadamente 1,5-2 g de vermiculita. Hidrate o compartimento radicular com 8 mL de solução nutritiva mMS-1. Isso ajudará a estabilizar a raiz e a vermiculita. Adicione 5 g de SAP hidratado ao longo da membrana do filtro de malha de náilon na lateral do compartimento da raiz. Adicione 15 g de SAP hidratado ao compartimento das hifas. O compartimento das hifas é o compartimento sem entalhe na lateral do fundo da placa de Petri. Antes de fechar a placa de Petri com a tampa, certifique-se de que os entalhes laterais da tampa e o fundo da placa de Petri estejam alinhados para não danificar a haste. Sele a placa de Petri com uma tira de parafina que une a base e a tampa, tomando cuidado para não esmagar o caule jovem. Pese e registre o peso médio da placa de Petri para determinar quando o SAP-AS precisa ser reidratado. Empilhe as placas de Petri para otimizar o espaço. Mantenha a placa de Petri no escuro usando uma tampa opaca com uma abertura lateral para as mudas. Gerenciar SAP-AS.Hidrate as placas de Petri apenas com solução nutritiva mMS-1. Use o peso médio como referência. Quando a placa de Petri clarear em 5-6 g, adicione a solução nutritiva mMS-1 para trazê-la de volta ao peso original. Certifique-se de que a vermiculita e o SAP sejam mantidos hidratados, mas não inundados. As raízes devem ter acesso ao oxigênio. À medida que a muda e seu parceiro fúngico se desenvolvem, irrigue-os com mais frequência. Não é necessário regar os dois compartimentos ao mesmo tempo. As necessidades de irrigação variam de acordo com o desenvolvimento das mudas, mas também de acordo com as condições ambientais em que os SAP-AS são incubados. Reduza os requisitos de irrigação removendo as folhas velhas se a planta tiver mais de três folhas saudáveis. Remova as folhas mortas.NOTA: A presença de cátions como K+, Mg2+ e Ca2+ na solução nutritiva mMS-1 tende a diminuir a expansão da rede SAP13 ao longo do tempo. 6. Inoculação do SAP-AS com um único esporo NOTA: Os materiais necessários para esta etapa estão listados na Tabela de Materiais. Inocular com um único esporo.Aqueça a pipeta de vidro com uma vela de chama ou bico de Bunsen. Puxe enquanto o vidro derrete para esticar o tubo de vidro até que ele se separe. Sob um estereomicroscópio, quebre a ponta da pipeta de vidro para reduzir o diâmetro interno (normalmente 100-300 μm). Isso facilitará muito a manipulação de esporos individuais. Abra a placa de Petri, localize o local onde o esporo deve ser colocado e abra um espaço entre os 5 g de SAP hidratado ao longo da membrana do filtro de malha de náilon para expor uma seção de uma raiz. Sob o microscópio de dissecação, pegue um esporo com a pipeta extrudada. Pipete um pouco de líquido antes de pipetar o esporo. Evite pipetar líquido após coletar o esporos. Sob o microscópio de dissecação, deposite cuidadosamente o esporo na raiz. O líquido pipetado antes de pipetar o esporo ajudará a expulsar o esporo. Se o esporo não for depositado em um local ideal, use uma agulha de acupuntura ou escove o cabelo para trazer o esporo de volta ao contato com a raiz. Se necessário, tire uma foto do esporo depositado na raiz para referência e use um marcador para localizar o local da inoculação. Substitua o SAP sobre o fragmento da raiz para fornecer um microambiente úmido para a raiz e o esporos. Espere pelo menos 24 h antes de irrigar o compartimento da raiz e tome cuidado para não lavar o esporo da raiz. Antes de fechar a placa de Petri com a tampa, certifique-se de que os entalhes laterais da tampa e o fundo da placa de Petri estejam alinhados para não danificar o caule da muda.NOTA: O SAP-AS está pronto para inoculação quando as raízes atingem a membrana do filtro de malha de nylon, idealmente alguns dias após a irrigação, para que não haja líquido livre. 7. Germinação de esporos no SAP (opcional) NOTA: Os materiais necessários para esta etapa estão listados na Tabela de Materiais. Germinação de esporos.Misture o SAP hidratado para obter uma textura suave (consulte a etapa 3.3.1). As bolhas de ar geralmente desaparecem em 24 h ou por autoclavagem (opcional) do SAP misturado. Usando uma seringa de 20 mL sem agulha, pipete aproximadamente 2 g (equivalente a 2 mL) de SAP misturado em cada poço da placa de 12 poços. Selecione um esporo sob o microscópio de dissecação e use a pipeta extrudada conforme descrito na seção 6. Sob o microscópio de dissecação, coloque um esporo no centro de cada poço. Incube a placa de 12 poços no escuro em RT e monitore a germinação periodicamente. Sob o microscópio de dissecação, selecione um esporo com uma hifa crescente (pelo menos alguns milímetros de comprimento). Adicione 1 mL de solução nutritiva mMS-1 ao poço e aguarde alguns minutos para que o meio se torne mais fluido. Se necessário, use a agulha de acupuntura para remover suavemente o esporo e as hifas do substrato. Colete o esporo com uma pipeta ou trazendo as raízes de uma muda para a superfície do meio para colar o esporo e as hifas nas raízes. Em seguida, coloque a muda na placa de Petri conforme descrito na etapa 5.1.3.NOTA: Coordene a germinação de esporos e o crescimento de mudas. Este método só foi testado com esporos de R. irregularis . 8. Monitoramento ao vivo do desenvolvimento da simbiose NOTA: Os materiais necessários para esta etapa estão listados na Tabela de Materiais. Observe rotineiramente com um microscópio de dissecação, vertical ou invertido.Observe a parte superior de cada compartimento em 20x – 40x usando um microscópio de dissecação com iluminação branca e campo escuro. Se um microscópio invertido não estiver disponível, observe o fundo de cada compartimento com um microscópio de dissecação ou vertical invertendo a placa de Petri. Antes de inverter a placa de Petri, deixe o SAP-AS secar por 2 dias para que o SAP adira ligeiramente ao fundo da placa de Petri. Faça observações detalhadas a 40x através do fundo da placa de Petri e até 100x (imersão em óleo) através da lamínula. Observe esporos e redes de hifas.NOTA: As estruturas fúngicas que se desenvolvem dentro dos grãos SAP podem ser coradas.Prepare uma solução de tinta e vinagre de acordo com Vierheilig et al. (1998)15. Não aqueça. Extraia um grão SAP contendo hifas e esporos e coloque-o na tinta em RT. A tinta penetrará no grão SAP e manchará as hifas e esporos em poucos minutos. Remova o grão SAP e coloque-o em solução nutritiva mMS-1 ou água da torneira. A tinta sairá do grão em 12 h, mas os esporos e hifas permanecerão manchados. Pressione o grão SAP entre duas lâminas de microscópio para achatá-lo para fotografia e contagem de esporos. Observe os arbúsculos.Extrair algumas raízes do compartimento radicular e corar usando o protocolo de tinta e vinagre de acordo com Vierheilig et al. (1998)15. Tenha cuidado para não mergulhar as raízes na solução de KOH por mais de 2-3 min; caso contrário, as raízes se tornarão muito frágeis para as etapas seguintes e se desintegrarão em detritos inutilizáveis. Sob um microscópio de dissecação, selecione um fragmento de raiz de aproximadamente 5 mm de comprimento que possa conter arbúsculos e coloque-o em uma lâmina em uma gota d’água. Usando agulhas de acupuntura ou pinças extremamente finas, arranque as raízes em camadas de algumas células de espessura. Absorver a água e verificar ao microscópio se os segmentos com arbúsculos ainda estão presentes e de qualidade satisfatória e correctamente colocados na lâmina. Neste ponto, os arbúsculos devem ser facilmente visíveis dentro das camadas de células da raiz. Deixe secar por 2-3 min para que as camadas da raiz adiram à lâmina. Adicione uma gota de tampão polivinílico álcool-ácido lácticoglicerol (PVLG) e adicione a lamínula. Observe por métodos de microscopia padrão.

Representative Results

O SAP-AS é uma técnica simples e barata para cultivar fungos de micorrizas arbusculares e observar o desenvolvimento de estruturas fúngicas intrarradicais e extra-radicais. Aqui, fornecemos um protocolo detalhado para ajudar os usuários a configurar o SAP-AS e introduzimos duas modificações em comparação com a descrição original do SAP-AS. Primeiro, a presença de SAP no compartimento radicular ao longo da membrana Nitex facilita a inoculação do sistema com um único esporo (Figura 1). Figura 1: Inoculação de esporo único do SAP-AS. (A) Inoculação com um único esporo de Rhizophagus irregularis. (B) Inoculação com um único esporo de Funneliformis mosseae. As setas brancas indicam o ponto de inoculação. Barras de escala: 500 μm. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura. É fácil identificar uma área com poucas raízes onde o esporo pode ser depositado. A localização exata do esporo pode ser marcada na superfície da tampa da placa de Petri e verificada periodicamente quanto à germinação e colonização das raízes. A presença de grãos hidratados de SAP proporciona um ambiente úmido propício à germinação de esporos. A inoculação nas raízes próximas à membrana Nitex permite o rápido desenvolvimento da simbiose com o micélio extrarradical para acessar rapidamente o compartimento das hifas e forragem para nutrientes (Figura 2). A capacidade de observar se o único esporo colocado no ponto de inoculação germina ou não também nos permite identificar e remover culturas malsucedidas e substituí-las. Em segundo lugar, as lamínulas na parte inferior da placa de Petri permitem imagens ao vivo de alta resolução da simbiose AM-fungo (Figura 2B, C) e, em particular, do fluxo citoplasmático dentro do micélio extrarradical (Figura 2D). Figura 2: SAP-AS inoculado. (A) SAP-AS inoculado com um único esporo de Rhizophagus irregularis (DAOM 197198). A planta hospedeira é Plantago lanceolata. (B) Aglomerado de esporos observados através da lamínula no compartimento das hifas sob um estereomicroscópio. Barra de escala: 500 μm. (C) Fotografia de alta resolução do aglomerado de esporos observado através da lamínula sob um microscópio de luz com ampliação de 10x. Barra de escala: 100 μm (D) Fotografia de alta resolução de hifas observadas através da lamínula sob um microscópio óptico com ampliação de 100x. Barra de escala: 10 μm. Clique aqui para ver uma versão ampliada desta figura. Os usuários podem tentar germinar esporos de fungos de micorrizas arbusculares em SAP hidratado com solução nutritiva mMS-1 para garantir que os SAP-AS sejam inoculados apenas com esporos viáveis (Figura 3). No entanto, isso foi testado apenas com esporos comerciais de R. irregularis, e o sucesso da germinação de esporos em SAP hidratado com solução nutritiva mMS-1 pode variar significativamente com outras espécies de fungos de micorrizas arbusculares. Figura 3: Germinação de esporos de R. irregularis em placa de 12 poços. Barra de escala: 500 μm. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura. Finalmente, como o SAP-AS é uma técnica in vivo e não estéril para propagação de FMA, a placa de Petri pode ser manipulada na bancada e aberta para amostrar raízes colonizadas, esporos livres ou grãos colonizados de SAP (Figura 4). As estruturas fúngicas intrarradicais e extra-radicais podem ser coradas de maneira semelhante aos FMAs propagados em culturas de vasos ou órgãos radiculares ( Figura 4C ). Figura 4: Estruturas fúngicas extra-radicais e intra-radicais de micorrizas arbusculares extraídas do SAP-AS. (A) Esporos livres de R. irregular são observados no compartimento radicular. Barra de escala: 200 μm. (B) Esporos de R. irregularis corados em SAP. Barra de escala: 500 μm. (C) Fragmentos de raiz corados mostrando as hifas e arbúsculos intrarradicais. Barras de escala: 50 μm, 100 μm. Clique aqui para ver uma versão ampliada desta figura. Figura suplementar 1: Comparação da espessura das várias ferramentas disponíveis para manipular esporos de fungos de micorrizas arbusculares. Clique aqui para baixar este arquivo. Figura suplementar 2: SAP-AS empilhado. Clique aqui para baixar este arquivo.

Discussion

A inoculação é a etapa mais crítica do protocolo, e as pipetas Pasteur de vidro extrudado provaram ser uma excelente ferramenta para manipular com precisão esporos únicos de fungos de micorrizas arbusculares, preservando sua integridade. As pipetas de vidro extrudado Pasteur são facilmente moldadas usando a chama de uma vela ou bico de Bunsen, e a abertura pode ser ajustada sob o estereomicroscópio para corresponder ao tamanho do esporo que está sendo pipetado. É importante manipular os esporos com ferramentas adaptadas ao tamanho do esporo do fungo AM (Figura Suplementar 1) e inocular o SAP-AS quando as raízes da planta hospedeira são longas o suficiente para atingir a membrana Nitex onde o esporo é depositado.

O SAAP-AS é fácil de adaptar aos requisitos do experimento. Placas de Petri maiores podem ser usadas, com vários compartimentos, para monitorar, por exemplo, a interação entre cepas intimamente relacionadas ou entre diferentes espécies de FMA ou para modificar o ambiente químico (pH) ou biológico (introdução de nematóides, bactérias, fungos). Várias plantas hospedeiras micotróficas também podem ser usadas para fornecer fotossintatos aos fungos de micorrizas arbusculares. A solução nutritiva mMS-1 foi derivada da receita de meio mínimo (M) descrita por Bécard e Fortin (1988)15 menos a sacarose, vitaminas e ágar bacto para limitar as fontes de carbono. No entanto, o SAP-AS pode ser suplementado com várias soluções nutritivas, dependendo dos objetivos do experimento.

A propagação de fungos de micorrizas arbusculares em SAP-AS requer rega regular. O volume limitado de vermiculita e SAP expõe as raízes e o fungo AM a flutuações de umidade, especialmente em placas de Petri padrão de dois compartimentos (10 cm de diâmetro). A capacidade de expansão e, portanto, a transparência dos grãos SAP diminui com o tempo. De fato, a presença de cátions da solução nutritiva limita progressivamente a expansão da rede de acrilato e requer a substituição do SAP após meses. Além disso, algas verdes e mofo podem crescer com o tempo se as placas de Petri não forem devidamente protegidas da luz ou regadas em excesso.

Até o momento, sete espécies de fungos de micorrizas arbusculares foram cultivadas com sucesso em SAP-AS, o que está muito abaixo do número de espécies de fungos de micorrizas arbusculares que podem ser propagadas em culturas de vasos. No entanto, tanto as condições bióticas quanto abióticas no SAP-AS são muito semelhantes às das culturas em vasos, e é provável que outras espécies de fungos de micorrizas arbusculares possam se propagar no SAP-AS. A inoculação direta de esporos em SAP-AS provavelmente proporciona condições ambientais mais próximas às da rizosfera em solo natural devido à presença de exsudatos radiculares e/ou bactérias, se esporos/sementes não estéreis forem utilizados para inoculação. Isso deve ser preferido à inoculação com esporos germinados. Além disso, as condições que desencadeiam a germinação de esporos dentro do FMA ainda são pouco compreendidas, portanto, o SAP hidratado com solução nutritiva mMS-1 pode não ser adaptado para germinar esporos de outras espécies de fungos de micorrizas arbusculares. A germinação de esporos em SAP hidratado com solução nutritiva mMS-1 foi testada para selecionar especificamente esporos viáveis para a etapa de inoculação usando apenas inóculo de R. irregularis .

A inoculação e o monitoramento do desenvolvimento da simbiose AM são facilmente realizados no SAP-AS. As placas de Petri modificadas de dois compartimentos permitem o cultivo de diferentes espécies de fungos de micorrizas arbusculares. Paré et al.12 propagaram sete espécies diferentes de FMA de seis gêneros e três famílias. A modificação de placas de Petri de dois compartimentos é facilmente feita com ferramentas baratas. O custo e a quantidade de materiais (vermiculita, SAP, pipeta de Pasteur, etc.) e reagentes (mMS-1) necessários para preparar e manter o SAP-AS são limitados, permitindo que um grande número de SAP-AS seja gerenciado a um custo mínimo. A capacidade de empilhar o SAP-AS também reduz significativamente a pegada das culturas de fungos de micorrizas arbusculares em comparação com as culturas de vasos. Por exemplo, 50 SAP-AS (5 pilhas de dez) podem caber em uma prateleira de 1 m de comprimento (Figura Suplementar 2). Esses recursos tornam o SAP-AS uma técnica simples e barata, compatível com o ensino da simbiose AM em cursos de laboratório do ensino médio ou em nível de graduação em universidades. Grãos colonizados de SAP podem ser usados para inocular novas culturas SAP-AS ou em vasos.

A presença de uma lamínula na parte de trás do fundo da placa de Petri permite fotografia e vídeo de alta resolução das estruturas fúngicas extra-radicais. O fluxo citoplasmático pode ser facilmente estudado em condições de vida muito próximas das condições naturais. Isso é de grande importância para estudos das funções dos fungos de micorrizas arbusculares relacionadas aos seus micélios (nutrientes, transporte de água, estrutura do solo, etc.) e para estudos da morfogênese das hifas.

Os FMA completam seu ciclo biológico nas raízes das plantas e na rizosfera. O estudo de microrganismos do solo é complexo devido à dificuldade inerente de observação do ambiente do solo. O principal objetivo do SAP-AS é recriar um ambiente o mais semelhante possível à rizosfera para a propagação de fungos de micorrizas arbusculares, mantendo a capacidade de observar o desenvolvimento de fungos de micorrizas arbusculares em grande detalhe. Como isso implica condições não estéreis, a quantidade de carbono disponível deve ser limitada para evitar a proliferação de microrganismos saprotróficos. O conhecimento do comportamento dos fungos de micorrizas arbusculares na rizosfera ainda é extremamente limitado, e o SAP-AS oferece a possibilidade de fazer comparações detalhadas entre as espécies quanto à sua capacidade de forragear no ambiente extra-radical, sua produção de esporos e sua colonização radicular. Isso pode ser ainda mais complicado adicionando interações com outras espécies do solo, como bactérias, nematóides, protistas e patógenos fúngicos radiculares, e o conhecimento das interações da microbiota do solo pode ser melhorado graças ao SAP-AS.

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Gostaríamos de agradecer aos dois revisores anônimos por suas sugestões. O financiamento para esta pesquisa foi fornecido pela Agriculture and Agri-Food Canada (AAFC) no âmbito do projeto J-002295 (Gestão e aprimoramento das coleções biológicas da AAFC).

Materials

100 x 15 mm Stackable Bi-Plate Kord Valmark 1204U09 https://www.thomassci.com/Laboratory-Supplies/Petri-Dishes/_/100-x-15-mm-Stackable-Bi-Plate
12-well plate  Greiner Bio-one 665180 https://shop.gbo.com/en/row/products/bioscience/cell-culture-products/cellstar-cell-culture-multiwell-plates/665180.html
18 mm round glass coverslips Fisher Scientific 12-545-100 https://www.fishersci.com/shop/products/fisherbrand-cover-glasses-circles-11/12545100#?keyword=12-545-100
20 mL Syringe PP/PE without needle Millipore Sigma Z683620-100EA https://www.sigmaaldrich.com/CA/en/product/aldrich/z683620?utm_source=google&utm_medium=
cpc&utm_campaign=20674735406
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Acupuncture needle  Lierre A143-LP1-3075 https://www.lierre.ca/products/lierre-plus-acupuncture-needles-100pcs?gad
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Blotting paper FLINN  FB0678 https://www.flinnsci.ca/blotting-paper-12-x-19-pkg.-of-10/fb0678/
Commercial or scientific blender or kitchen hand blender kitchenaid KHBV53DG https://www.kitchenaid.ca/en_ca/countertop-appliances/hand-blenders/hand-blender-products/p.variable-speed-corded-hand-blender.khbv53dg.html 
Dremel 199 Carving Bit Dremel 2615000199 https://www.dremel.com/ca/en/p/199-2615000199
Dry SAP medium granulometry 1–2 mm HORTA-SORB MD 00810085242789 https://www.horticulturalalliance.com/product/horta-sorb-md-granule/
Feather Stainless-Steel Blades for Dissecting Knife Handles  Fisher Scientific 08-916-5B https://www.fishersci.ca/shop/products/graham-field-stainless-steel-blades-dissecting-knife-handles-8/089165b
Glass Pasteur pipettes 230 mm Kimble RK-25554-14 https://www.coleparmer.ca/i/dwk-life-sciences-kimble-disposable-pasteur-pipettes-plugged-end-borosilicate-glass-230-mm-1000-cs/2555414
Ink Sheaffer 94321 https://www.amazon.com/Sheaffer-Skrip-Bottled-Black-94231/dp/B002IKKKUU
Melting guide: modified paint Scraper, 2-in Mastercraft #049-7335-8 https://www.canadiantire.ca/en/pdp/mastercraft-carbon-steel-flexible-spackling-putty-knife-wall-paint-scraper-2-in-0497335p.0497335.html?loc=plp
Microscopy glass slide Fisher Scientific 12-552-5 https://www.fishersci.com/shop/products/fisherbrand-frosted-microscope-slides-4/125525
Nitex nylon mesh filter screen  Dynamic Aqua-Supply Ltd. NTX30-108 https://dynamicaquasupply.com/products/nitex-screen?_pos=1&_sid=ffc105328&_ss=r&
variant=6945749106731
Paper clip Makanu ‎Clips-BK-41mm-24 https://www.amazon.ca/classeur-standard-grandes-trombones-excellentes
Parafilm Avantor/vwr 470201-930 https://www.avantorsciences.com/ca/en/product/8882964/parafilm
Plantago lanceolata seeds ecoumene NA https://www.ecoumene.com/produit/semences/herbacees/plantain-lanceole-bio/
Polyvinyl alcohol-lactic acid-glycerol (PVLG). NA NA https://invam.ku.edu/recipes
Pyrography kit with fine tip Walnut Hollow 483103 https://www.walnuthollow.com/collections/creative-wood-burning/products/walnut-hollow-creative-versa-tool
Silicone sealant Aqueon 100165003 https://www.aqueon.com/products/aquariums/silicone-sealant
Surgeon scalpel handle Fisher Scientific 22-079657 https://www.fishersci.ca/shop/products/surgical-design-scalpel-handles-blades/22079657#?keyword=scalpel
Two Speed Rotary Tool Kit Dremel 200-1/21 https://www.dremel.com/ca/en/p/200-1-21-f0130200ah
Vermiculite PRO-MIX 4981110 https://www.canadiantire.ca/fr/pdp/vermiculite-pro-mix-9-l-0597936p.0597936.html
X1000 Round Coverslip dia. 30 mm #1 (0.13–0.16 mm) Fisher Scientific 12164692 https://www.fishersci.fi/shop/products/x1000-cover-slip-diam-30-mm-n-1-1/12164692
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References

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Arbuscular Mycorrhizal FungiAM FungiSuperabsorbent PolymerAutotrophic SystemIn Vitro CultureIn Vivo CultureRi T-DNA Transformed RootsPot CultureRhizosphereInoculationObservationMicroscopy

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Paré, L., Banchini, C., Stefani, F. Inoculating and Observing Arbuscular Mycorrhizal Cultures on Superabsorbent Polymer-Based Autotrophic Systems. J. Vis. Exp. (208), e66848, doi:10.3791/66848 (2024).
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