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Environment

Inoculazione e osservazione di colture micorriziche arbuscolari su sistemi autotrofi a base di polimeri superassorbenti

Published: June 14, 2024
doi:
10.3791/66848
, ,
1Centre d’Étude de la Forêt (CEF) and Institut de Biologie Intégrative et des Systèmes (IBIS),Université Laval, 2Ottawa Research and Development Centre, Agriculture and Agri-Food Canada

Summary

Qui, descriviamo una tecnica semplice ed economica per l’inoculazione e l’osservazione di funghi micorrizici arbuscolari in sistemi autotrofi a base di polimeri superassorbenti.

Abstract

I funghi micorrizici arbuscolari (AM) sono difficili da manipolare e osservare a causa della loro associazione permanente con le radici delle piante e la propagazione nella rizosfera. Tipicamente, i funghi AM vengono coltivati in condizioni in vivo in coltura in vaso con un ospite autotrofico o in condizioni in vitro con radici trasformate di Ri Transfer-DNA (ospite eterotrofo) in una capsula di Petri. Inoltre, la coltivazione di funghi AM in coltura in vaso avviene in un ambiente opaco e non sterile. Al contrario, la coltura in vitro comporta la propagazione dei funghi AM in un ambiente sterile e trasparente. Il sistema autotrofico a base di polimeri superassorbenti (SAP-AS) è stato recentemente sviluppato e ha dimostrato di combinare i vantaggi di entrambi i metodi evitando le rispettive limitazioni (opacità e ospite eterotrofo, sterilità). Qui, presentiamo un protocollo dettagliato per una facile preparazione, l’inoculazione di singole spore e l’osservazione dei funghi AM in SAP-AS. Modificando le piastre di Petri, sono state possibili osservazioni fotografiche e video ad alta risoluzione su campioni viventi, cosa che sarebbe stata difficile o impossibile con le attuali tecniche in vivo e in vitro .

Introduction

I funghi micorrizici arbuscolari (AM) (Glomeromycotina) sono antichi simbionti delle radici delle piante (~500 Ma 1,2) che potrebbero aver svolto un ruolo essenziale nella colonizzazione dei suoli terrestri da parte delle tracheofite. Questa lunga coevoluzione tra funghi AM e tracheofite pone la micorriza arbuscolare come un capolavoro del mutualismo interregno. Le ife fungine AM aumentano significativamente la capacità dell’ospite di cercare i nutrienti del suolo3, compreso il trasferimento dei nutrienti a nuovi ospiti attraverso le reti micorriziche4. La rete ifali migliora la struttura del suolo e la produzione di glomalina potrebbe ridurre l’erosione del suolo5. Il trasferimento di parte del carbonio atmosferico al simbionte radicale fungino aumenta il sequestro del carbonio nel suolo6. Nel complesso, i funghi AM migliorano la resilienza delle piante sia agli stress abiotici che biotici e hanno quindi ricevuto una notevole attenzione nell’agroecologia7. Infatti, le pratiche di gestione agricola amiche dei funghi hanno il potenziale per ridurre l’uso di input chimici per la produzione agricola e migliorare il contenuto di carbonio organico nel suolo, obiettivi importanti che gli agricoltori devono integrare nelle loro pratiche di gestione al fine di rispettare gli impegni nazionali e internazionali in materia di transizione verso pratiche agricole sostenibili e lotta al cambiamento climatico.

Tuttavia, i funghi AM sono funghi microscopici del suolo e il loro studio è difficile a causa della loro biotrofia obbligata e della distribuzione della rizosfera. Il suolo è uno dei biotopi più difficili da studiare a causa della sua opacità, dell’enorme diversità di nicchie e delle interazioni multitrofiche a tutte le scale. L’isolamento, la propagazione e la caratterizzazione dei funghi AM sono quindi difficili. Fino alla metà del 20° secolo, solo le specie fungine AM che formavano sporocarpi erano state caratterizzate8. Tuttavia, la maggior parte delle specie fungine AM produce spore non sporocarpiche che vanno da ~20 μm a ~500 μm di diametro. La descrizione della tecnica di setacciatura a umido del suolo9 ha aperto la strada alla descrizione di queste specie fungine AM e da allora il tasso di descrizione delle specie è aumentato. Tuttavia, i funghi AM rappresentano un piccolo gruppo di specie rispetto a Dikarya.

Le colture trappola, cioè l’inoculazione con spore o un campione di terreno ambientale contenente spore fungine AM di un vaso riempito con materiale autoclavato come turface e vermiculite e un seme sterilizzato di un ospite (porro, piantaggine), è un modo per propagare i funghi AM in condizioni controllate10. Tuttavia, il successo dell’inoculazione può essere valutato solo cercando la presenza di arbuscoli nei frammenti di radice dopo la colorazione o setacciando a umido un sottocampione o l’intero vaso per isolare le spore. Di solito si consiglia di non disturbare il sistema per almeno 6-12 settimane prima dell’analisi della coltura in vaso. Questa tecnica di coltura è adatta per la propagazione della maggior parte delle specie fungine AM conosciute, ma l’osservazione dal vivo del simbionte fungino non è possibile e il successo dell’inoculazione è incerto, soprattutto quando si tenta di coltivare singole spore.

Al contrario, la propagazione in vitro dei funghi AM può essere monitorata dal vivo grazie alla trasparenza del terreno di coltura11, ma questa tecnica di coltura richiede la disponibilità di radici trasformate e la presenza di carbonio nel terreno di coltura per funzionare in un ambiente sterile. Le spore devono essere sterilizzate e, insieme all’associazione con un ospite eterotrofo, la maggior parte delle specie fungine AM conosciute non si propagano con successo utilizzando questa tecnica.

Pertanto, la propagazione dei funghi AM utilizzando le tecniche attuali, sebbene consolidata e ampiamente utilizzata nella maggior parte dei laboratori, presenta alcune limitazioni per lo studio dei funghi AM. Paré et al. (2022)12 hanno sviluppato una tecnica in vivo utilizzando un polimero superassorbente trasparente (SAP) in combinazione con piante intere per propagare i funghi AM. La tecnica, concepita come sistema autotrofico basato su SAP (SAP-AS), è semplice ed economica e combina i vantaggi della coltura in vaso (associazione con un ospite autotrofo, condizioni non sterili) e delle colture in vitro (terreno trasparente, monitoraggio in tempo reale dello sviluppo della simbiosi). Qui, presentiamo un protocollo che spiega come impostare le colture con l’inoculazione di singole spore e utilizzare il SAP-AS per l’osservazione ad alto ingrandimento del micelio extraradicale. In particolare, descriviamo come modificare le piastre di Petri a due compartimenti, preparare la soluzione nutritiva, preparare il polimero superassorbente (SAP), preparare le piantine, assemblare il SAP-AS e inoculare con una singola spora, pregerminare le spore e monitorare in tempo reale lo sviluppo della simbiosi.

Protocol

1. Modifica di piastre di Petri a due scomparti NOTA: I materiali necessari per questa fase sono elencati nella Tabella dei materiali. Modificare il coperchio della capsula di Petri.Utilizzando l’utensile rotante e la punta da intaglio appropriata, praticare due fori (~7 mm di diametro) nella parte superiore del coperchio e un’apertura laterale di 1 cm. Un foro sarà utilizzato per irrigare il compartimento delle radici (vermiculite) e l’altro per il compartimento delle ife (SAP). Modificare il fondo della piastra di Petri.Praticare una tacca sul lato del fondo della piastra di Petri per lo stelo della pianta utilizzando l’utensile rotante elettrico. Assicurarsi che la tacca non sia troppo profonda per evitare che il liquido defluisca. Questa tacca si allineerà con l’apertura di 1 cm nel coperchio (passaggio 1.1). Per sostituire la barriera di plastica della piastra di Petri a doppio scomparto con la membrana filtrante a rete di nylon, utilizzare l’utensile rotante elettrico per praticare una tacca rettangolare di 30 mm fino al fondo della piastra di Petri. Per un’osservazione ad alta risoluzione, praticare fori circolari di ~25 mm di diametro nella parte inferiore della capsula di Petri. A seconda delle esigenze, praticare un singolo foro (o più fori) sul lato SAP o uno in ogni scomparto. Assicurarsi che i fori non siano praticati direttamente sotto i fori di irrigazione del coperchio. Installare la membrana filtrante a rete di nylon.Utilizzare la guida metallica e la graffetta per incastrare in posizione il pezzo della membrana filtrante a rete di nylon e premerlo saldamente sulla barriera di plastica. Allineare la parte superiore della membrana con la parte superiore della barriera di plastica. Assicurarsi che la membrana sporga dalla parte inferiore della guida. Utilizzando il kit per pirografia, tagliare lungo il bordo della guida metallica per fondere e sigillare la membrana al fondo della capsula di Petri e alla barriera di plastica che separa i due scomparti. Con la guida metallica e la graffetta ancora in posizione, rimuovere con cura la membrana filtrante in rete di nylon in eccesso con una pinzetta. Verificare al microscopio da dissezione che la membrana del filtro a rete di nylon sia sigillata correttamente alla plastica per evitare la penetrazione della radice nel compartimento ifali (SAP). Installare il vetrino coprioggetti.NOTA: Il vetrino coprioggetti viene posizionato sotto la capsula di Petri. In questo modo è possibile utilizzare l’olio da immersione e pulire il vetrino coprioggetti.Posizionare il sigillante siliconico lungo il bordo dei fori circolari (all’esterno del fondo della capsula di Petri). Posizionare il vetrino coprioggetti all’esterno del fondo della piastra di Petri e premere delicatamente per garantire una perfetta adesione. Lasciare asciugare e rimuovere il sigillante in eccesso con una lama di rasoio. Ispezionare e pulire.Utilizzare un getto d’aria per rimuovere la polvere o i pezzi di plastica che potrebbero aver aderito alla capsula di Petri. Ispezionare al microscopio da dissezione per identificare e correggere eventuali difetti.NOTA: Indossare guanti per evitare impronte digitali sulle piastre di Petri 2. Preparazione di 1 L di soluzione nutritiva mMS-1 Preparare le soluzioni stock.Macronutrienti: Pesare e sciogliere in 1 L di acqua distillata:7,31 g di MgSO4·7 H2O, 0,80 g di KNO3, 0,65 g di KCl e 0,048 g di KH2PO4,. Pesare 2,88 g di Ca(NO3)2·4H2O e sciogliere in 1 L di acqua distillata. Pesare 0,80 g di NaFeEDTA e scioglierlo in 0,5 L di acqua distillata. Pesare 0,375 g di KI e sciogliere in 0,5 L di acqua distillata. MicronutrientiSciogliere 3 g di MnCl2·4H2O in 100 mL di acqua distillata. Sciogliere 1,325 g di ZnSO4·7H2O in 100 mL di acqua distillata. Sciogliere 0,75 g di H3BO3 in 100 ml di acqua distillata. Una volta disciolte, mescolare le soluzioni preparate nei passaggi 2.1.5.1-2.1.5.3. Pesa 0,65 g di CuSO4·5H2O e sciogliere in 50 mL di acqua distillata. Sciogliere 0,12 g di Na2MoO4·2H2O in 100 mL di acqua distillata. Aggiungere 5 mL della soluzione del passaggio 2.1.5.5 e 1 mL del passaggio 2.1.5.6 alla soluzione del passaggio 2.1.5.4. Regolare il volume della soluzione ottenuta al punto 2.1.5.7 a 500 ml con acqua distillata. Preparare 1 litro di terreno mMS-1.Aggiungere 700 ml di acqua distillata in una bottiglia di vetro da 2 litri. Mescolando costantemente con una barra magnetica, aggiungere 100 mL di soluzione di macroelementi (passaggio 2.1.1), 100 mL di soluzione di nitrato di calcio (passaggio 2.1.2), 5 mL di soluzione di EDTA ferrico (passaggio 2.1.3), 1 mL di soluzione KI (passaggio 2.1.4) e 1 mL di soluzione di microelementi (passaggio 2.1.5). Regolare il volume della soluzione a 1000 ml.NOTA: mMS-1 è un adattamento di Bécard e Fortin (1988)14. La sterilizzazione a 121 °C per 15 minuti è facoltativa in quanto il SAP-AS non è sterile. Il pH non viene regolato perché il SAP ha un forte effetto tampone e Paré et al. (2022)12 hanno dimostrato che le condizioni su SAP erano relativamente neutre (da 6,7 a 7,4). 3. Preparazione di SAP NOTA: I materiali necessari per questa fase sono elencati nella Tabella dei materiali. Idratare la SAP: mescolare 5 g di SAP secco con 500 ml di soluzione nutritiva mMS-1 (fase 2.2). Lasciare idratare per 12 ore (tutta la notte) a temperatura ambiente (RT). Scolare e raccogliere i chicchi di SAP idratati.Quando si utilizza SAP idrato per riempire la piastra a 12 pozzetti (sezione 7), non scolare il SAP idratato e mescolare il grano idrato e il residuo della soluzione nutritiva mMS-1.NOTA: Sono disponibili tre granulometrie del SAP secco: piccola, media e grande. La granulometria media (1-2 mm) è la più appropriata. Il SAP di grande granulometria deglutisce troppo quando è idratato e il coperchio della capsula di Petri non può essere chiuso, mentre il SAP di piccola granulometria lascia poco spazio tra di loro, il che è una limitazione per le osservazioni della struttura fungina tra i grani. 4. Preparazione delle piantine NOTA: I materiali necessari per questa fase sono elencati nella Tabella dei materiali. Far germogliare i semi di P. lanceolata su carta assorbente inumidita con soluzione nutritiva mMS-1 in una capsula di Petri. Incubare al buio a RT. Reidratare secondo necessità fino a quando le radichette non sono lunghe almeno 2 cm. 5. Assemblaggio e gestione di SAP-AS NOTA: I materiali necessari per questa fase sono elencati nella Tabella dei materiali. Assemblare SAP-AS (passaggio 1 + passaggio 2 + passaggio 3 + passaggio 4)Posiziona il gambo della piantina nella tacca sul lato della capsula di Petri con la radice verso l’interno e i cotiledoni/foglie e steli verso l’esterno. Coprire le radici con circa 1,5-2 g di vermiculite. Idratare il compartimento radicolare con 8 ml di soluzione nutritiva mMS-1. Questo aiuterà a stabilizzare la radice e la vermiculite. Aggiungere 5 g di SAP idrato lungo la membrana filtrante a rete di nylon sul lato del compartimento radicolare. Aggiungere 15 g di SAP idratato nello scomparto ifale. Lo scomparto ife è lo scomparto senza tacca sul lato del fondo della piastra di Petri. Prima di chiudere la capsula di Petri con il coperchio, assicurarsi che le tacche laterali del coperchio e il fondo della piastra di Petri siano allineati in modo da non danneggiare lo stelo. Sigillare la capsula di Petri con una striscia di paraffina che unisce la base e il coperchio, facendo attenzione a non schiacciare il gambo giovane. Pesare e registrare il peso medio della capsula di Petri per determinare quando il SAP-AS deve essere reidratato. Impila le piastre di Petri per ottimizzare lo spazio. Tenete la capsula di Petri al buio utilizzando una copertura opaca con un’apertura laterale per le piantine. Gestisci SAP-AS.Idratare le piastre di Petri solo con la soluzione nutritiva mMS-1. Utilizzare il peso medio come riferimento. Quando la capsula di Petri si è schiarita di 5-6 g, aggiungere la soluzione nutritiva mMS-1 per riportarla al peso originale. Assicurarsi che la vermiculite e la SAP siano mantenute idratate ma non allagate. Le radici devono avere accesso all’ossigeno. Man mano che la piantina e il suo partner fungino si sviluppano, irrigali più frequentemente. Non è necessario innaffiare entrambi gli scomparti contemporaneamente. I requisiti di irrigazione variano in base allo sviluppo delle piantine, ma anche in base alle condizioni ambientali in cui i SAP-AS vengono incubati. Riduci il fabbisogno di irrigazione rimuovendo le foglie vecchie se la pianta ha più di tre foglie sane. Rimuovi le foglie morte.NOTA: La presenza di cationi come K+, Mg2+ e Ca2+ nella soluzione nutritiva mMS-1 tende a ridurre l’espansione della rete SAP13 nel tempo. 6. Inoculazione del SAP-AS con una singola spora NOTA: I materiali necessari per questa fase sono elencati nella Tabella dei materiali. Inoculare con una singola spora.Scaldare la pipetta di vetro con una candela a fiamma o un bruciatore Bunsen. Tirare mentre il vetro si scioglie per allungare il tubo di vetro fino a quando non si separa. Sotto uno stereomicroscopio, rompere la punta della pipetta di vetro per ridurre il diametro interno (tipicamente 100-300 μm). Ciò faciliterà notevolmente la manipolazione delle singole spore. Aprire la capsula di Petri, individuare il punto in cui deve essere posizionata la spora e liberare uno spazio tra i 5 g di SAP idrato lungo la membrana filtrante a rete di nylon per esporre una sezione di una radice. Sotto il microscopio da dissezione, prelevare una spora con la pipetta estrusa. Pipettare un po’ di liquido prima di pipettare la spora. Evitare di pipettare il liquido dopo aver raccolto le spore. Sotto il microscopio da dissezione, depositare con cura la spora sulla radice. Il liquido pipettato prima di pipettare la spora aiuterà ad espellere la spora. Se la spora non si deposita in un punto ottimale, utilizzare un ago per agopuntura o una spazzola per riportare la spora a contatto con la radice. Se necessario, scattare una foto della spora depositata sulla radice come riferimento e utilizzare un pennarello per individuare il sito di inoculazione. Sostituire il SAP sul frammento di radice per fornire un microambiente umido per la radice e la spora. Attendere almeno 24 ore prima di irrigare il compartimento radicolare e fare attenzione a non lavare via la spora dalla radice. Prima di chiudere la capsula di Petri con il coperchio, assicurarsi che le tacche laterali del coperchio e il fondo della capsula di Petri siano allineati in modo da non danneggiare il gambo della piantina.NOTA: IL SAP-AS è pronto per l’inoculazione quando le radici raggiungono la membrana filtrante a rete di nylon, idealmente pochi giorni dopo l’irrigazione, quindi non c’è liquido libero. 7. Germinazione delle spore su SAP (opzionale) NOTA: I materiali necessari per questa fase sono elencati nella Tabella dei materiali. Germinazione delle spore.Sfumare il SAP idratato per ottenere una consistenza liscia (vedere il passaggio 3.3.1). Le bolle d’aria di solito scompaiono entro 24 ore o in autoclave (opzionale) del SAP miscelato. Utilizzando una siringa da 20 mL senza ago, pipettare circa 2 g (equivalenti a 2 mL) di SAP miscelato in ciascun pozzetto della piastra a 12 pozzetti. Selezionare una spora al microscopio da dissezione e utilizzare la pipetta estrusa come descritto nella sezione 6. Sotto il microscopio da dissezione, posizionare una spora al centro di ogni pozzetto. Incubare la piastra a 12 pozzetti al buio a RT e monitorare periodicamente la germinazione. Sotto il microscopio da dissezione, selezionare una spora con un’ifa in crescita (almeno qualche millimetro di lunghezza). Aggiungere 1 mL di soluzione nutritiva mMS-1 al pozzetto e attendere qualche minuto affinché il terreno diventi più fluido. Se necessario, utilizzare l’ago per agopuntura per rimuovere delicatamente le spore e le ife dal substrato. Raccogli la spora con una pipetta o portando le radici di una piantina sulla superficie del terreno per attaccare la spora e le ife alle radici. Quindi, posizionare la piantina nella capsula di Petri come descritto al punto 5.1.3.NOTA: Coordina la germinazione delle spore e la crescita delle piantine. Questo metodo è stato testato solo con spore di R. irregularis . 8. Monitoraggio in tempo reale dello sviluppo della simbiosi NOTA: I materiali necessari per questa fase sono elencati nella Tabella dei materiali. Osservare di routine con un microscopio da dissezione, verticale o invertito.Osservare la parte superiore di ogni scomparto a 20x – 40x utilizzando un microscopio da dissezione con illuminazione bianca e campo scuro. Se non è disponibile un microscopio invertito, osservare il fondo di ciascun compartimento con un microscopio da dissezione o verticale capovolgendo la piastra di Petri. Prima di capovolgere la capsula di Petri, lasciare asciugare il SAP-AS per 2 giorni in modo che il SAP aderisca leggermente al fondo della capsula di Petri. Effettua osservazioni dettagliate a 40x attraverso il fondo della capsula di Petri e fino a 100x (immersione in olio) attraverso il vetrino coprioggetti. Osservare le spore e le reti ifali.NOTA: Le strutture fungine che si sviluppano all’interno dei grani SAP possono essere colorate.Preparare una soluzione di inchiostro e aceto secondo Vierheilig et al. (1998)15. Non riscaldare. Estrarre un granulo SAP contenente ife e spore e posizionarlo nell’inchiostro a RT. L’inchiostro penetrerà nel grano di SAP e macchierà le ife e le spore in pochi minuti. Rimuovere il granello SAP e metterlo nella soluzione nutritiva mMS-1 o nell’acqua del rubinetto. L’inchiostro uscirà dalla grana entro 12 ore, ma le spore e le ife rimarranno macchiate. Premere il grano SAP tra due vetrini da microscopio per appiattirlo per la fotografia e il conteggio delle spore. Osservare gli arbuscoli.Estrarre alcune radici dal compartimento radicolare e colorare utilizzando il protocollo dell’inchiostro e dell’aceto secondo Vierheilig et al. (1998)15. Fare attenzione a non immergere le radici nella soluzione KOH per più di 2-3 minuti; In caso contrario, le radici diventeranno troppo fragili per i passaggi successivi e si disintegreranno in detriti inutilizzabili. Al microscopio da dissezione, selezionare un frammento di radice lungo circa 5 mm che possa contenere arbuscoli e posizionarlo su un vetrino in una goccia d’acqua. Usando aghi per agopuntura o pinzette estremamente sottili, strappare le radici in strati spessi alcune cellule. Assorbire l’acqua e verificare al microscopio che i segmenti con arbuscoli siano ancora presenti e di qualità soddisfacente, e correttamente posizionati sul vetrino. A questo punto, gli arbuscoli devono essere facilmente visibili all’interno degli strati cellulari radicolari. Lasciare asciugare per 2-3 minuti in modo che gli strati di radice aderiscano al vetrino. Aggiungere una goccia di tampone alcol polivinilico-acido lattico (PVLG) e aggiungere il vetrino coprioggetti. Osservare con metodi di microscopia standard.

Representative Results

Il SAP-AS è una tecnica semplice ed economica per la coltura di funghi AM e l’osservazione dello sviluppo di strutture fungine intraradicali ed extraradicaliche. Qui, abbiamo fornito un protocollo dettagliato per aiutare gli utenti a configurare SAP-AS e abbiamo introdotto due modifiche rispetto alla descrizione originale di SAP-AS. In primo luogo, la presenza di SAP sul compartimento radicolare lungo la membrana Nitex facilita l’inoculazione del sistema con una singola spora (Figura 1). Figura 1: Inoculazione di una singola spora del SAP-AS. (A) Inoculazione con una singola spora di Rhizophagus irregularis. (B) Inoculazione con una singola spora di Funneliformis mosseae. Le frecce bianche indicano il punto di inoculazione. Barre di scala: 500 μm. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura. È facile identificare un’area con poche radici in cui la spora può essere depositata. La posizione esatta della spora può essere segnata sulla superficie del coperchio della capsula di Petri e controllata periodicamente per la germinazione e la colonizzazione delle radici. La presenza di grani idrati di SAP fornisce un ambiente umido favorevole alla germinazione delle spore. L’inoculazione sulle radici vicino alla membrana Nitex consente un rapido sviluppo della simbiosi con il micelio extraradicale per accedere rapidamente al compartimento ife e alla ricerca di nutrienti (Figura 2). La capacità di osservare se la singola spora posta nel punto di inoculazione germina o meno ci permette anche di identificare e rimuovere le colture non riuscite e sostituirle. In secondo luogo, i vetrini coprioggetti sul fondo della capsula di Petri consentono l’imaging dal vivo ad alta risoluzione della simbiosi AM-fungo (Figura 2B, C) e, in particolare, del flusso citoplasmatico all’interno del micelio extraradicalico (Figura 2D). Figura 2: SAP-AS inoculato. (A) SAP-AS inoculato con una singola spora di Rhizophagus irregularis (DAOM 197198). La pianta ospite è la Plantago lanceolata. (B) Ammasso di spore osservato attraverso il vetrino coprioggetti nel compartimento ifali al microscopio stereomicroscopio. Barra della scala: 500 μm. (C) Fotografia ad alta risoluzione dell’ammasso di spore osservato attraverso il vetrino coprioggetti al microscopio ottico con ingrandimento 10x. Barra graduata: 100 μm (D) Fotografia ad alta risoluzione delle ife osservate attraverso il vetrino coprioggetti al microscopio ottico con ingrandimento 100x. Barra della scala: 10 μm. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura. Gli utenti possono tentare di germinare le spore fungine AM su SAP idratato con la soluzione nutritiva mMS-1 per garantire che i SAP-AS siano inoculati solo con spore vitali (Figura 3). Tuttavia, questo è stato testato solo con spore commerciali di R. irregularis e il successo della germinazione delle spore su SAP idratato con soluzione nutritiva mMS-1 può variare significativamente con altre specie fungine AM. Figura 3: Germinazione delle spore di R. irregularis in una piastra a 12 pozzetti. Barra della scala: 500 μm. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura. Infine, poiché SAP-AS è una tecnica in vivo e non sterile per la propagazione dell’AMF, la piastra di Petri può essere manipolata sul banco e aperta per campionare radici colonizzate, spore libere o granuli colonizzati di SAP (Figura 4). Le strutture fungine intraradicali ed extraradicaliche possono essere colorate in modo simile all’AMF propagato in vasi o colture di organi radicali (Figura 4C). Figura 4: Strutture fungine AM extraradicaliche e intraradicaliche estratte dal SAP-AS. (A) Spore libere di R. irregularis osservate nel compartimento radicolare. Barra della scala: 200 μm. (B) Spore di R. irregularis colorate in SAP. Barra graduata: 500 μm. (C) Frammenti di radice colorati che mostrano le ife intraradicali e gli arbuscoli. Barre di scala: 50 μm, 100 μm. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura. Figura supplementare 1: Confronto dello spessore dei vari strumenti disponibili per manipolare le spore fungine AM. Clicca qui per scaricare questo file. Figura 2 supplementare: SAP-AS impilato. Clicca qui per scaricare questo file.

Discussion

L’inoculazione è la fase più critica del protocollo e le pipette Pasteur in vetro estruso si sono rivelate uno strumento eccellente per manipolare accuratamente singole spore di funghi AM preservandone l’integrità. Le pipette Pasteur in vetro estruso sono facilmente modellabili utilizzando la fiamma di una candela o di un bruciatore Bunsen e l’apertura può essere regolata allo stereomicroscopio per adattarsi alle dimensioni della spora da pipettare. È importante manipolare le spore con strumenti adatti alle dimensioni della spora fungina AM (Figura supplementare 1) e inoculare il SAP-AS quando le radici della pianta ospite sono abbastanza lunghe da raggiungere la membrana Nitex dove si deposita la spora.

I SAP-AS sono facili da adattare ai requisiti dell’esperimento. Le piastre di Petri più grandi possono essere utilizzate, con più compartimenti, per monitorare, ad esempio, l’interazione tra ceppi strettamente imparentati o tra diverse specie di AMF o per modificare l’ambiente chimico (pH) o biologico (introduzione di nematodi, batteri, funghi). Varie piante ospiti micotrofiche possono anche essere utilizzate per fornire ai funghi AM fotosintetizzati. La soluzione nutritiva mMS-1 è stata derivata dalla ricetta del terreno minimo (M) descritta da Bécard e Fortin (1988)15 meno il saccarosio, le vitamine e il bacto agar per limitare le fonti di carbonio. Tuttavia, il SAP-AS può essere integrato con varie soluzioni nutritive, a seconda degli obiettivi dell’esperimento.

La propagazione dei funghi AM in SAP-AS richiede un’irrigazione regolare. Il volume limitato di vermiculite e SAP espone le radici e il fungo AM a fluttuazioni di umidità, soprattutto nelle piastre di Petri standard a due scomparti (10 cm di diametro). La capacità di espansione e, quindi, la trasparenza dei grani SAP diminuisce nel tempo. Infatti, la presenza di cationi dalla soluzione nutritiva limita progressivamente l’espansione della rete acrilica e richiede la sostituzione del SAP dopo mesi. Inoltre, le alghe verdi e le muffe possono crescere nel tempo se le piastre di Petri non sono adeguatamente protette dalla luce o annaffiate eccessivamente.

Ad oggi, sette specie fungine AM sono state coltivate con successo in SAP-AS, che è molto al di sotto del numero di specie fungine AM che possono essere propagate in colture in vaso. Tuttavia, sia le condizioni biotiche che quelle abiotiche in SAP-AS sono molto simili a quelle nelle colture in vaso, ed è probabile che altre specie fungine AM siano in grado di propagarsi in SAP-AS. L’inoculazione diretta di spore in SAP-AS probabilmente fornisce condizioni ambientali più vicine a quelle della rizosfera in un suolo naturale a causa della presenza di essudati radicali e/o batteri, se per l’inoculazione vengono utilizzate spore/semi non sterili. Questo dovrebbe essere preferito all’inoculazione con spore germinate. Inoltre, le condizioni che innescano la germinazione delle spore all’interno dell’AMF sono ancora poco conosciute, quindi la SAP idratata con la soluzione nutritiva mMS-1 potrebbe non essere adatta a germinare le spore di altre specie fungine AM. La germinazione delle spore su SAP idratato con la soluzione nutritiva mMS-1 è stata testata per selezionare specificamente le spore vitali per la fase di inoculazione utilizzando solo inoculo di R. irregularis .

L’inoculazione e il monitoraggio dello sviluppo della simbiosi AM sono facilmente eseguibili in SAP-AS. Le piastre di Petri a due compartimenti modificate consentono la coltivazione di diverse specie fungine AM. Paré et al.12 hanno propagato sette diverse specie di AMF di sei generi e tre famiglie. La modifica delle piastre di Petri a due scomparti è facilmente eseguibile con strumenti economici. Il costo e la quantità dei materiali (vermiculite, SAP, pipetta Pasteur, ecc.) e dei reagenti (mMS-1) necessari per preparare e mantenere il SAP-AS sono limitati, consentendo di gestire un gran numero di SAP-AS a costi minimi. La capacità di impilare il SAP-AS riduce anche significativamente l’ingombro delle colture fungine AM rispetto alle colture in vaso. Ad esempio, 50 SAP-AS (5 pile da dieci) possono stare su uno scaffale lungo 1 m (Figura 2 supplementare). Queste caratteristiche rendono il SAP-AS una tecnica semplice ed economica, compatibile con l’insegnamento della simbiosi AM nei corsi di laboratorio delle scuole superiori o a livello universitario nelle università. I grani colonizzati di SAP possono essere utilizzati per inoculare nuovi SAP-AS o colture in vaso.

La presenza di un vetrino coprioggetti sul retro del fondo della capsula di Petri consente la fotografia e il video ad alta risoluzione delle strutture fungine extraradicali. Il flusso citoplasmatico può essere facilmente studiato in condizioni di vita molto vicine alle condizioni naturali. Ciò è di grande importanza per gli studi sulle funzioni dei funghi AM correlate ai loro miceli (nutrienti, trasporto dell’acqua, struttura del suolo, ecc.) e per gli studi sulla morfogenesi ifale.

Gli AMF completano il loro ciclo biologico nelle radici delle piante e all’interno della rizosfera. Lo studio dei microrganismi del suolo è complesso a causa della difficoltà intrinseca di osservare l’ambiente del suolo. L’obiettivo principale del SAP-AS è quello di ricreare un ambiente il più simile possibile alla rizosfera per la propagazione dei funghi AM mantenendo la capacità di osservare lo sviluppo dei funghi AM in grande dettaglio. Poiché ciò implica condizioni non sterili, la quantità di carbonio disponibile dovrebbe essere limitata per evitare la proliferazione di microrganismi saprotrofi. La conoscenza del comportamento dei funghi AM nella rizosfera è ancora estremamente limitata, e il SAP-AS offre la possibilità di fare confronti dettagliati tra le specie per quanto riguarda la loro capacità di foraggiare in ambiente extraradicale, la loro produzione di spore e la loro colonizzazione radicale. Questo può essere ulteriormente complicato aggiungendo interazioni con altre specie del suolo come batteri, nematodi, protisti e patogeni fungini delle radici, e la conoscenza delle interazioni del microbiota del suolo può essere migliorata grazie al SAP-AS.

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Ringraziamo i due revisori anonimi per i loro suggerimenti. Il finanziamento per questa ricerca è stato fornito da Agriculture and Agri-Food Canada (AAFC) nell’ambito del progetto J-002295 (Gestione e valorizzazione delle collezioni biologiche dell’AAFC).

Materials

100 x 15 mm Stackable Bi-Plate Kord Valmark 1204U09 https://www.thomassci.com/Laboratory-Supplies/Petri-Dishes/_/100-x-15-mm-Stackable-Bi-Plate
12-well plate  Greiner Bio-one 665180 https://shop.gbo.com/en/row/products/bioscience/cell-culture-products/cellstar-cell-culture-multiwell-plates/665180.html
18 mm round glass coverslips Fisher Scientific 12-545-100 https://www.fishersci.com/shop/products/fisherbrand-cover-glasses-circles-11/12545100#?keyword=12-545-100
20 mL Syringe PP/PE without needle Millipore Sigma Z683620-100EA https://www.sigmaaldrich.com/CA/en/product/aldrich/z683620?utm_source=google&utm_medium=
cpc&utm_campaign=20674735406
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Acupuncture needle  Lierre A143-LP1-3075 https://www.lierre.ca/products/lierre-plus-acupuncture-needles-100pcs?gad
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CnARIsAN11vgTwupmw51UTdR
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Blotting paper FLINN  FB0678 https://www.flinnsci.ca/blotting-paper-12-x-19-pkg.-of-10/fb0678/
Commercial or scientific blender or kitchen hand blender kitchenaid KHBV53DG https://www.kitchenaid.ca/en_ca/countertop-appliances/hand-blenders/hand-blender-products/p.variable-speed-corded-hand-blender.khbv53dg.html 
Dremel 199 Carving Bit Dremel 2615000199 https://www.dremel.com/ca/en/p/199-2615000199
Dry SAP medium granulometry 1–2 mm HORTA-SORB MD 00810085242789 https://www.horticulturalalliance.com/product/horta-sorb-md-granule/
Feather Stainless-Steel Blades for Dissecting Knife Handles  Fisher Scientific 08-916-5B https://www.fishersci.ca/shop/products/graham-field-stainless-steel-blades-dissecting-knife-handles-8/089165b
Glass Pasteur pipettes 230 mm Kimble RK-25554-14 https://www.coleparmer.ca/i/dwk-life-sciences-kimble-disposable-pasteur-pipettes-plugged-end-borosilicate-glass-230-mm-1000-cs/2555414
Ink Sheaffer 94321 https://www.amazon.com/Sheaffer-Skrip-Bottled-Black-94231/dp/B002IKKKUU
Melting guide: modified paint Scraper, 2-in Mastercraft #049-7335-8 https://www.canadiantire.ca/en/pdp/mastercraft-carbon-steel-flexible-spackling-putty-knife-wall-paint-scraper-2-in-0497335p.0497335.html?loc=plp
Microscopy glass slide Fisher Scientific 12-552-5 https://www.fishersci.com/shop/products/fisherbrand-frosted-microscope-slides-4/125525
Nitex nylon mesh filter screen  Dynamic Aqua-Supply Ltd. NTX30-108 https://dynamicaquasupply.com/products/nitex-screen?_pos=1&_sid=ffc105328&_ss=r&
variant=6945749106731
Paper clip Makanu ‎Clips-BK-41mm-24 https://www.amazon.ca/classeur-standard-grandes-trombones-excellentes
Parafilm Avantor/vwr 470201-930 https://www.avantorsciences.com/ca/en/product/8882964/parafilm
Plantago lanceolata seeds ecoumene NA https://www.ecoumene.com/produit/semences/herbacees/plantain-lanceole-bio/
Polyvinyl alcohol-lactic acid-glycerol (PVLG). NA NA https://invam.ku.edu/recipes
Pyrography kit with fine tip Walnut Hollow 483103 https://www.walnuthollow.com/collections/creative-wood-burning/products/walnut-hollow-creative-versa-tool
Silicone sealant Aqueon 100165003 https://www.aqueon.com/products/aquariums/silicone-sealant
Surgeon scalpel handle Fisher Scientific 22-079657 https://www.fishersci.ca/shop/products/surgical-design-scalpel-handles-blades/22079657#?keyword=scalpel
Two Speed Rotary Tool Kit Dremel 200-1/21 https://www.dremel.com/ca/en/p/200-1-21-f0130200ah
Vermiculite PRO-MIX 4981110 https://www.canadiantire.ca/fr/pdp/vermiculite-pro-mix-9-l-0597936p.0597936.html
X1000 Round Coverslip dia. 30 mm #1 (0.13–0.16 mm) Fisher Scientific 12164692 https://www.fishersci.fi/shop/products/x1000-cover-slip-diam-30-mm-n-1-1/12164692
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References

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Paré, L., Banchini, C., Stefani, F. Inoculating and Observing Arbuscular Mycorrhizal Cultures on Superabsorbent Polymer-Based Autotrophic Systems. J. Vis. Exp. (208), e66848, doi:10.3791/66848 (2024).
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