高吸水性ポリマー系独立栄養系におけるアーバスキュラー菌根培養物の接種と観察

1. 2コンパートメントシャーレの改造 注意: この手順に必要な材料は、 材料の表に記載されています。 ペトリ皿の蓋を変更します。回転工具と適切なカービングビットを使用して、蓋の上部に2つの穴(直径~7mm)を開け、側面に1cmの開口部を開けます。1つの穴は根(バーミキュライト)コンパートメントの灌漑に使用され、もう1つの穴は菌糸(SAP)コンパートメントの灌漑に使用されます。 ペトリ皿の底を変更します。電動回転工具を使用して、植物の茎のためにペトリ皿の底の側面に切り込みを開けます。液体が排出されるのを防ぐために、ノッチが深すぎないことを確認してください。この切り込みは、蓋の1cmの開口部に合わせられます(ステップ1.1)。 デュアルコンパートメントペトリ皿のプラスチックバリアをナイロンメッシュフィルターメンブレンに置き換えるには、電動回転ツールを使用して、ペトリ皿の底まで30mmの長方形のノッチをドリルで穴を開けます。 高解像度の観察のために、ペトリ皿の底に直径~25mmの円形の穴を開けます。要件に応じて、SAP側に1つの穴(または複数の穴)を開けるか、各コンパートメントに1つの穴を開けます。穴が蓋の灌漑穴の真下に開けられていないことを確認してください。 ナイロンメッシュフィルターメンブレンを取り付けます。金属製のガイドとペーパークリップを使用して、ナイロンメッシュフィルターメンブレンの一部を所定の位置に押し込み、プラスチックバリアにしっかりと押し付けます。メンブレンの上部をプラスチックバリアの上部に合わせます。メンブレンがガイドの下部から突き出ていることを確認してください。 パイログラフィーキットを使用して、金属ガイドの端に沿って切断し、膜を溶かしてシャーレの底と2つのコンパートメントを分離するプラスチックバリアに密封します。 金属製のガイドとペーパークリップを所定の位置に残したまま、ピンセットで余分なナイロンメッシュフィルターメンブレムを慎重に取り除きます。 解剖顕微鏡で、ナイロンメッシュフィルターメンブレンがプラスチックに適切に密封されていることを確認して、根が菌糸(SAP)コンパートメントに浸透するのを防ぎます。 カバースリップを取り付けます。注意: カバーガラスはペトリ皿の下に置かれます。これにより、浸漬油を使用し、カバーガラスを洗浄することができます。シリコンシーラントを円形の穴の端(ペトリ皿の底の外側)に沿って置きます。 カバースリップをペトリ皿の底の外側に置き、そっと押して完全に接着します。 乾燥させ、かみそりの刃で余分なシーラントを取り除きます。 点検して清掃します。エアブラストを使用して、ペトリ皿に付着した可能性のあるほこりやプラスチック片を取り除きます。 解剖顕微鏡で検査し、欠陥を特定して修正します。注意: ペトリ皿に指紋がつかないように手袋を着用してください 2. 1Lの養液mMS-1の調製 ストック溶液を準備します。主要栄養素:以下を秤量し、1Lの蒸留水に溶解します。7.31 g の MgSO4·7 H2O、0.80 g の KNO3、0.65 g の KCl、および 0.048 g の KH2PO4。 重量 2.88 g の Ca(NO3)2·4H2Oを1Lの蒸留水に溶解します。 0.80 gのNaFeEDTAを秤量し、0.5 Lの蒸留水に溶解します。 0.375gのKIを秤量し、0.5Lの蒸留水に溶解します。 微量栄養素3 gのMnCl2·蒸留水100mL中に4H2O。 1.325 gのZnSO4·100mLの蒸留水に7H2O。 0.75gのH3BO3 を100mlの蒸留水に溶解する。 溶解したら、ステップ2.1.5.1-2.1.5.3で調製した溶液を混合します。 重量 0.65 g の CuSO4·5H2Oを蒸留水50 mLに溶解する。 0.12 gのNa2MoO4·100mLの蒸留水に2H2O。 ステップ 2.1.5.5 の溶液 5 mL とステップ 2.1.5.6 の 1 mL をステップ 2.1.5.4 の溶液に加えます。 ステップ2.1.5.7で得られた溶液の量を蒸留水で500mLに調整します。 mMS-1メディアを1L用意します。2 Lのガラス瓶に700 mLの蒸留水を加えます。 磁気バーで絶えず攪拌しながら、100 mLの主要栄養素溶液(ステップ2.1.1)、100 mLの硝酸カルシウム溶液(ステップ2.1.2)、5 mLの第二鉄EDTA溶液(ステップ2.1.3)、1 mLのKI溶液(ステップ2.1.4)、および1 mLの微量栄養素溶液(ステップ2.1.5)を加えます。 溶液の量を1000mLに調整します。注:mMS-1はBécard and Fortin(1988)14から適応されています。SAP-ASは滅菌されていないため、121°Cで15分間の滅菌はオプションです。SAPには強力な緩衝効果があるため、pHは調整されておらず、Paré et al.(2022)12 では、SAPの条件が比較的中性(6.7〜7.4)であることが示されました。 3. SAPの準備 注意: この手順に必要な材料は、 材料の表に記載されています。 SAPを水和する:5 gの乾燥SAPを500 mLのmMS-1栄養溶液と混合します(ステップ2.2)。 室温(RT)で12時間(一晩)水和させます。 水和したSAP穀物を排出して収集します。水和したSAPを使用して12ウェルプレート(セクション7)を充填する場合は、水和したSAPを排出せず、水和した穀物と残りのmMS-1栄養溶液を混合しないでください。注:乾燥SAPの3つの粒度(小、中、大)が利用可能です。中粒度計(1〜2 mm)が最適です。大粒粒測定のSAPは水和すると飲み込みすぎてペトリ皿の蓋を閉じることができませんが、小さな粒粒測定のSAPはそれらの間にほとんどスペースを残さないため、粒子間の真菌構造の観察には制限があります。 4.苗の準備 注意: この手順に必要な材料は、 材料の表に記載されています。 P. lanceolataの種子を、ペトリ皿のmMS-1栄養溶液で湿らせた吸い取り紙で発芽させます。 RTで暗闇の中でインキュベートします。 細根の長さが少なくとも2cmになるまで、必要に応じて水分を補給します。 5. SAP-ASの組立・管理 注意: この手順に必要な材料は、 材料の表に記載されています。 SAP-AS の組立 (ステップ 1 + ステップ 2 + ステップ 3 + ステップ 4)苗の茎をペトリ皿の側面の切り欠きに置き、根を内側に、子葉/葉と茎を外側にします。 根を約1.5〜2gのバーミキュライトで覆います。 ルートコンパートメントを8mLのmMS-1栄養溶液で水和します。これは、ルートとバーミキュライトを安定させるのに役立ちます。 ルートコンパートメントの側面にあるナイロンメッシュフィルターメンブレンに沿って5gの水和SAPを追加します。 15 gの水和SAPを菌糸コンパートメントに加えます。ハイフコンパートメントは、ペトリ皿の底の側面にノッチがないコンパートメントです。 蓋をしてペトリ皿を閉じる前に、ステムを傷つけないように、蓋の側面のノッチとペトリ皿の底が揃っていることを確認してください。 若い茎をつぶさないように注意しながら、ベースと蓋を結合するパラフィンのストリップでシャーレを密封します。 ペトリ皿の平均重量を量って記録し、SAP-ASをいつ再水和する必要があるかを判断します。 スペースを最適化するためにペトリ皿を積み重ねます。ペトリ皿は、苗の側面に開口部がある不透明なカバーを使用して暗所に保管します。 SAP-AS の管理。ペトリ皿をmMS-1栄養溶液のみで水和します。 平均重量を参考にしてください。ペトリ皿が5〜6 g軽くなったら、mMS-1栄養溶液を追加して元の重量に戻します。バーミキュライトとSAPが水和されているが、浸水していないことを確認してください。根は酸素にアクセスできる必要があります。 苗とその真菌のパートナーが成長するにつれて、それらをより頻繁に灌漑します。両方のコンパートメントに同時に水をやる必要はありません。灌漑要件は、苗の発育によって異なりますが、SAP-ASがインキュベートされる環境条件によっても異なります。 植物に健康な葉が3枚以上ある場合は、古い葉を取り除くことにより、灌漑要件を減らします。枯れ葉を取り除きます。注:mMS-1栄養溶液中にK+、Mg2+、Ca2+ などの陽イオンが存在すると、SAPネットワーク13 の拡張が時間とともに減少する傾向がある。 6. SAP-ASの胞子1種への接種 注意: この手順に必要な材料は、 材料の表に記載されています。 単一の胞子で接種します。ガラスピペットを炎のキャンドルまたはブンゼンバーナーで加熱します。ガラスが溶けたら引っ張って、ガラス管が分離するまで伸ばします。 実体顕微鏡で、ガラスピペットの先端を折って内径(通常は100〜300μm)を小さくします。これにより、個々の胞子の操作が大幅に容易になります。 ペトリ皿を開き、胞子を配置する場所を特定し、ナイロンメッシュフィルターメンブレンに沿って5gの水和SAPの間のスペースを空けて、根の一部を露出させます。 解剖顕微鏡の下で、押し出しピペットで胞子を拾います。胞子をピペッティングする前に、液体をピペットで動かしてください。胞子を採取した後は、液体をピペッティングしないでください。 解剖顕微鏡の下で、胞子を根に注意深く沈着させます。胞子をピペッティングする前にピペッティングした液体は、胞子を排出するのに役立ちます。胞子が最適な場所に沈着しない場合は、鍼またはブラシの毛を使用して、胞子を根元に接触させます。必要に応じて、参照用に根に堆積した胞子の写真を撮り、マーカーを使用して接種部位を特定します。 ルートフラグメント上のSAPを置き換えて、ルートと胞子に湿った微小環境を提供します。根のコンパートメントを灌漑する前に少なくとも24時間待ち、根から胞子を洗い流さないように注意してください。 蓋をしてシャーレを閉じる前に、苗の茎を傷つけないように、蓋の側面のノッチとシャーレの底が揃っていることを確認してください。注:SAP-ASは、根がナイロンメッシュフィルター膜に到達したとき、理想的には灌漑の数日後に接種する準備ができているため、遊離液はありません。 7. SAPでの胞子発芽(オプション) 注意: この手順に必要な材料は、 材料の表に記載されています。 胞子の発芽。水和したSAPをブレンドして、滑らかな食感を得ます(手順3.3.1を参照)。気泡は通常、24時間以内に、またはブレンドされたSAPをオートクレーブ(オプション)することで消えます。 針なしの20 mLシリンジを使用して、約2 g(2 mLに相当)のブレンドされたSAPを12ウェルプレートの各ウェルにピペットで移します。 解剖顕微鏡で胞子を選択し、セクション6で説明されているように押し出しピペットを使用します。 解剖顕微鏡の下で、各ウェルの中央に胞子を置きます。 12ウェルプレートを暗闇の室温でインキュベートし、発芽を定期的にモニタリングします。 解剖顕微鏡下で、菌糸が成長している胞子(少なくとも数ミリメートルの長さ)を選択します。 1 mLのmMS-1栄養溶液をウェルに加え、培地がより滑らかになるまで数分待ちます。 必要に応じて、鍼治療の針を使用して、胞子と菌糸を基質から穏やかに取り除きます。 ピペットで胞子を集めるか、苗の根を培地の表面に持ってきて、胞子と菌糸を根に貼り付けます。次に、手順5.1.3で説明したように、苗をペトリ皿に入れます。注:胞子の発芽と苗の成長を調整します。この方法は 、R. irregularis 胞子でのみテストされています。 8. 共生発達のライブモニタリング 注意: この手順に必要な材料は、 材料の表に記載されています。 解剖顕微鏡、直立顕微鏡、または倒立顕微鏡で日常的に観察します。白色照明と暗視野を備えた解剖顕微鏡を使用して、各コンパートメントの上部を20倍〜40倍で観察します。 倒立顕微鏡が利用できない場合は、ペトリ皿を逆さにして、解剖顕微鏡または直立顕微鏡で各コンパートメントの底を観察します。ペトリ皿をひっくり返す前に、SAP-ASを2日間乾燥させて、SAPがペトリ皿の底にわずかに付着するようにします。 ペトリ皿の底部から40倍、カバーガラスから最大100倍(油浸)で詳細な観察を行います。 胞子と菌糸ネットワークを観察します。注:SAP粒子の内部で発生している真菌構造は染色される可能性があります。Vierheilig et al. (1998)15に従ってインクと酢の溶液を調製します。加熱しないでください。 菌糸と胞子を含むSAP粒子を抽出し、RTのインクに入れます。インクはSAPグレインに浸透し、数分以内に菌糸と胞子を染色します。 SAPグレインを取り出し、mMS-1養液または水道水に入れます。インクは12時間以内に穀物から出ますが、胞子と菌糸は汚れたままになります。 2つの顕微鏡スライドの間にSAPグレインを押し込み、写真撮影や胞子のカウントのために平らにします。 アーバスキュールを観察します。ルートコンパートメントからいくつかの根を抽出し、Vierheiligら(1998)15に従ってインクと酢のプロトコルを使用して染色します。根をKOH溶液に2〜3分以上浸さないように注意してください。そうしないと、根が壊れやすくなりすぎて次の手順を実行できず、分解して使用できなくなる破片になります。 解剖顕微鏡下で、アーバスキュールを含む可能性のある長さ約5mmの根片を選択し、水滴のスライドに置きます。 鍼または非常に細いピンセットを使用して、数細胞の厚さの層で根を引きちぎります。 水を吸収し、顕微鏡でアーバスキュールのあるセグメントがまだ存在し、満足のいく品質であり、スライドに正しく配置されていることを確認します。この時点で、アーバスキュールはルートセル層内で簡単に見える必要があります。 ルート層がスライドに付着するように、2〜3分間乾燥させます。ポリビニルアルコール-乳酸グリセロール(PVLG)バッファーを一滴加え、カバースリップを追加します。標準的な顕微鏡法で観察します。