Misurazione della respirazione mitocondriale nelle fibre muscolari scheletriche umane e di topo mediante repirometria ad alta risoluzione

Tutte le procedure per i topi sono state approvate dal Comitato Istituzionale per la Cura e l’Uso degli Animali della Washington University. Topi di qualsiasi sesso, età e peso possono essere utilizzati per questi esperimenti e dipenderanno dalla natura della domanda sperimentale che si cerca di affrontare. I topi utilizzati qui sono topi adulti (12-16 settimane), maschi di tipo selvatico C57BL/6. Tutte le procedure umane sono state approvate dall’Institutional Review Board della Washington University. I soggetti dello studio hanno acconsentito all’utilizzo dei dati e i dati rappresentativi dei soggetti umani inclusi in questo protocollo provengono da uno studio pubblicato14. I dati qui provengono da donne non diabetiche in post-menopausa (55-75 anni). I dettagli per la preparazione dei reagenti necessari per il test sono presentati nella Tabella 1. Le informazioni sui reagenti, gli strumenti e le macchine specifici utilizzati nel test sono elencate nella Tabella dei materiali. Una panoramica schematica del protocollo è presentata nella Figura 1. Figura 1: Schema per la respirometria ad alta risoluzione su campioni di muscolo scheletrico permeabilizzato. Il metodo descritto in questo manoscritto è diviso in 6 sezioni: 1) preparazione dei tamponi e dei reagenti per la respirazione, 2) preparazione dello strumento e del reagente il giorno del test, 3) preparazione e permeabilizzazione dei campioni muscolari, 4) preparazione del campione e dello strumento, 5) esecuzione del test di respirazione e 6) analisi dei dati. Creato con BioRender.com Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura. 1. Preparazione del saggio e taratura dello strumento Il giorno del test, rimuovere il numero necessario di aliquote di ciascun composto respiratorio (blebbistatina, palmitoil-carnitina, glutammato, malato, ADP, succinato, citocromo C, FCCP) e scongelare con ghiaccio. Scongelare le fiale di BIOPS e MiR05 con ghiaccio. Preparare le soluzioni di saponina e piruvato come indicato nella Tabella 1. Preparare una soluzione funzionante di MiR05 come nella Tabella 1. Preparare 5 mL di soluzione di lavoro di MiR05 per strumento (2 camere). Aumenta le prestazioni in base alle esigenze. Accendere il sistema di respirometria ad alta risoluzione e il sistema del vuoto. Rimuovere i tappi, rimuovere la soluzione di conservazione dell’etanolo al 70% con il vuoto e riempire la camera con H2O di grado molecolare ultrapuro. Rimuovere l’H2O con il vuoto e ricaricare. Ripetere per un totale di 3 lavaggi. Dopo il lavaggio finale, aggiungere 2 ml di MiR05 (senza creatina o blebbistatina) in ciascuna camera. Aprire il software di respirometria. Dopo l’avvio del software, si aprirà una finestra pop-up per le impostazioni dello strumento. Impostare la velocità di agitazione della camera a 750 giri/min, la temperatura a 37 °C e l’intervallo di registrazione dei dati a 2 s. Impostare il guadagno su 1 e la tensione di polarizzazione su 800 mV per i sensori di ossigeno. Fare clic su Connetti a Oxygraph per stabilire la comunicazione con lo strumento. Dopo aver stabilito la comunicazione, si aprirà una finestra di dialogo per nominare e salvare il file sperimentale. Salvare il file con la data e la calibrazione correnti. Dopo aver salvato il file, verrà visualizzata una finestra di dialogo pop-up per i dettagli dell’esperimento. Non sono necessarie informazioni per la corsa alla calibrazione e la scatola può essere chiusa. Registrare la concentrazione di ossigeno per almeno 30 minuti per consentire il riscaldamento delle camere e per registrare i segnali per la calibrazione dell’aria. Questo può essere fatto durante la preparazione delle fibre muscolari, come descritto nel passaggio 2 di seguito. Al termine del periodo di taratura, contrassegnare una regione di taratura in tutta la regione in cui la concentrazione di ossigeno (linea blu) è stabile. Per fare ciò, tieni premuto il tasto Maiusc e il pulsante sinistro del mouse e trascina su una regione della timeline. Apri la finestra di calibrazione andando su Oxygraph > O2 Calibration. Per Calibrazione aria, selezionare il segno generato nel passaggio 1.8. Fare clic su Calibra e copia negli Appunti. Ripetere i passaggi 1.6-1.8 per la camera rimanente. Eseguire la calibrazione dell’aria ogni giorno. Interrompere la registrazione della calibrazione dell’aria e salvare il file scollegandolo dallo strumento. Dopo che i campioni sono pronti, procedere alla fase 3 per eseguire il saggio. 2. Raccolta e permeabilizzazione delle fibre muscolari scheletriche Isolamento del tessuto di topoPer ogni campione da analizzare, riempire un pozzetto di una piastra di coltura a 12 pozzetti con 1 mL di BIOPS. Mettere il piatto sul ghiaccio per raffreddare. Dopo aver soppresso il topo mediante inalazione di anidride carbonica seguita da lussazione cervicale, prelevare il muscolo scheletrico di interesse, assicurandosi di rimuovere tutto il tessuto connettivo e il grasso (Figura 2A). Posizionare il muscolo in uno dei pozzetti contenenti BIOPS. Mettere su ghiaccio fino alla preparazione delle fibre.NOTA: Qualsiasi muscolo scheletrico può essere esaminato utilizzando questo protocollo: il tipo di muscolo esaminato dipenderà dalla domanda sperimentale che si cerca di affrontare. Nel caso di muscoli scheletrici con tipi di fibre miste, come il gastrocnemio, è possibile separare il tessuto in sezioni bianche e rosse per misurare le fibre prevalentemente a contrazione rapida (sezioni bianche) e prevalentemente a contrazione lenta (sezioni rosse) (Figura 2B). Isolamento dei tessuti umaniRaccogliere il tessuto seguendo il protocollo clinico14. Sciacquare rapidamente il fazzoletto con PBS freddo e sterile e metterlo in una provetta conica contenente 2 ml di soluzione BIOPS. Tenere il fazzoletto sul ghiaccio fino alla preparazione delle fibre. Preparazione delle fibreLa permeabilizzazione avverrà in una piastra di coltura tissutale a 6 pozzetti. Aggiungere 2 mL di soluzione BIOPS a una serie di pozzetti e 2 mL di MiR05 a un’altra serie di pozzetti. Sarà necessario un set di pozzetti per ogni campione analizzato. Prepara un vassoio con ghiaccio e posiziona una capsula di Petri di vetro capovolta sul ghiaccio. Assicurati di mantenere sempre il muscolo sul ghiaccio. Trasferire i campioni muscolari raccolti sulla piattaforma raffreddata della piastra di Petri utilizzando una pinza. Utilizzando due pinze a punta fine e un microscopio da dissezione con una fonte di luce, pulire delicatamente il tessuto rimuovendo eventuali tendini, fascia e tessuto adiposo attaccati al muscolo. Dopo che tutto il tessuto non muscolare estraneo è stato rimosso, separare delicatamente le fibre muscolari con la pinza a punta fine fino a quando non sono piccoli fasci di fibre traslucide di lunghezza compresa tra 0,75 e 1,0 mm (Figura 2C-D). Dopo aver separato le fibre, utilizzare la pinza per trasferire i fasci di fibre in un pozzetto sulla piastra a 6 pozzetti contenente la soluzione BIOPS su ghiaccio. Aggiungere 20 μL di soluzione di saponina da 5 mg/mL a ciascun pozzetto BIOPS e incubare la piastra su ghiaccio mentre la si dondola delicatamente in una stanza fredda per 20 minuti. Dopo il trattamento con saponine, trasferire le fibre muscolari nel pozzetto contenente MiR05 per risciacquare prima del test. Incubare con ghiaccio mentre si dondola delicatamente in una stanza fredda per 15 minuti. Al termine dell’incubazione delle fibre in MiR05, raccogliere le fibre con una pinza affilata e asciugare delicatamente le fibre muscolari su una salvietta da lavoro. Tarare una provetta da microcentrifuga in plastica da 1,5 ml con una bilancia fine e inserire 2-3 mg di fibre nella provetta. Registrare il peso finale della fibra sul lato di ciascun tubo. Metti il tubo sul ghiaccio. Ripetere con altri campioni. Procedere immediatamente al passaggio 3. Figura 2: Separazione delle fibre muscolari scheletriche del topo. (A) Morfologia macroscopica del gastrocnemio di topo dopo il raccolto. (B) Dissezione del gastrocnemio nei segmenti rosso (a sinistra) e bianco (a destra). (C) Fibre muscolari separate meccanicamente. (D) Un’immagine 10x di fibre muscolari separate con successo. La barra della scala è di 1 mm. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura. 3. Preparazione di campioni muscolari nel respirometro Aspirare il MiR05 utilizzato per la calibrazione dello strumento come descritto nel passaggio 1 sopra e aggiungere 2,1 ml di soluzione MiR05 funzionante a ciascuna camera. Avviare un nuovo file per l’esperimento utilizzando le stesse impostazioni dello strumento descritte nel passaggio 1.5. sopra. Imposta il nome del file e salva le impostazioni. Dopo aver impostato il nome del file, la finestra di dialogo della schermata successiva sarà per dettagli sperimentali specifici. Inserire le informazioni sul campione e il peso di ogni campione aggiunto a ciascuna camera. Chiudete la finestra di dialogo. Una volta nel nuovo file sperimentale, impostare la calibrazione aprendo la finestra Calibrazione O2. Fare clic su Copia da file e selezionare il file salvato dal passaggio 1.9. sopra. Fare clic sul pulsante Calibra e copia negli Appunti . Ripetere il processo per la camera rimanente. Utilizzando una pinza fine, trasferire con cura i fasci di fibre muscolari nella soluzione respiratoria per la camera appropriata. Ripetere per la camera rimanente. Posizionare i tappi sulla camera e semichiudere con cura la camera spingendo i tappi circa a metà verso il fondo. Una volta che gli o-ring sui tappi si innestano con la parete della camera e c’è resistenza, utilizzare un movimento rotatorio mentre si spinge verso il basso per chiudere. Quando la camera è chiusa a metà, si può osservare una piccola bolla d’aria nella parte superiore della camera.NOTA: Le fibre permeabilizzate sono soggette a limitazioni di diffusione dell’ossigeno in condizioni respiratorie regolari. Per aggirare questa limitazione, il test viene condotto a concentrazioni elevate di ossigeno11. Riempire una siringa di plastica da 10 ml con ossigeno puro da una bombola di ossigeno. Posizionare l’ago lungo e smussato fornito con lo strumento sulla siringa. Posizionare l’ago nella prima camera ed erogare lentamente circa 1 mL di ossigeno nella camera. Monitorare la concentrazione di ossigeno della camera nel software di respirometria. Quando la concentrazione di ossigeno della camera raggiunge i 350-400 nmol/mL, ruotare delicatamente il tappo mentre si spinge verso il basso per chiudere completamente la camera. Guardare all’interno della camera e assicurarsi che non rimangano bolle d’aria. Se è presente una bolla d’aria, riaprire con cautela e rapidamente la camera, aggiungere 100 μl di soluzione MiR05 di lavoro aggiuntiva e richiudere rapidamente la camera. Ripetere con le camere rimanenti. Le concentrazioni di ossigeno devono essere mantenute al di sopra di 250 nmol/mL durante il test. Aggiungere ulteriore ossigeno secondo necessità aprendo parzialmente la camera, aggiungendo altro ossigeno dalla siringa nella bolla d’aria e richiudendo con cura la camera. Normalizzare i dati del flusso di ossigeno in base alla massa di tessuto utilizzata per l’esperimento. Per regolare i grafici, modificare il layout in modo che rifletta il flusso di O2 (pmol O2 / (s x mg)). Dal menu di layout, selezionare il layout 06 – Flusso specifico per unità di esempio. I dati saranno ora presentati normalizzati alla quantità di tessuto in ciascuna camera. 4. Respirometria ad alta risoluzione Quando la concentrazione di ossigeno (linea blu) e il flusso di O2 (linea rossa) si sono stabilizzati dopo l’aggiunta di ossigeno, iniziare il protocollo di respirazione. L’ossigeno può essere considerato stabile quando la linea blu è piatta o diminuisce lentamente. Anche il flusso di O2 deve essere piatto ed entro 5 pmol O2 / s x mg. Aggiungere tutti i reagenti utilizzando siringhe di vetro. È importante non utilizzare la stessa siringa per substrati, inibitori e disaccoppiatori. Avere una siringa separata per ciascuno. Dopo aver aggiunto ciascun composto, registrare il flusso di ossigeno per 1-2 minuti dopo che la frequenza respiratoria si è stabilizzata prima di aggiungere il reagente successivo. Misurazione della respirazioneUtilizzando una siringa di vetro da 10 μl, aggiungere 2,5 μl di malato 0,8 M in ciascuna camera. Premere F4 per contrassegnare la timeline ed etichettare il segno con M. Registrare un flusso O2 stabile per 1-2 minuti. Aggiungere reagenti specifici per i nutrienti come descritto di seguito.Glicolitico aerobico: utilizzando una siringa di vetro da 10 μl, aggiungere 10 μl di glutammato 2 M e 5 μl di piruvato 2 M in ciascuna camera. Premere F4 per contrassegnare la timeline ed etichettare il segno con G P. Registrare un flusso O2 stabile per 1-2 minuti. Acido grasso: utilizzando una siringa di vetro da 10 μL, aggiungere 10 μL di glutammato 2 M e 10 μL di palmitoyl-carnitina 10 mM in ciascuna camera. Premere F4 per contrassegnare la timeline ed etichettare il segno con G PC. Registrare un flusso di O2 stabile per 1-2 minuti. Utilizzando una siringa di vetro da 25 μl, aggiungere 20 μl di ADP 0,5 M (con MgCl2) in ciascuna camera. Premere F4 per contrassegnare la sequenza temporale ed etichettare il contrassegno con ADP. Registrare un flusso di O2 stabile per 1-2 minuti. Utilizzando una siringa di vetro da 25 μl, aggiungere 20 μl di succinato 1 M in ciascuna camera. Premere F4 per contrassegnare la timeline ed etichettare il segno con S. Registrare un flusso O2 stabile per 1-2 minuti. Utilizzando una siringa di vetro da 10 μl, aggiungere 5 μl di citocromo C da 4 mM in ciascuna camera. Premere F4 per contrassegnare la timeline ed etichettare il segno con Cyt C. Registrare un flusso O2 stabile per 1-2 minuti. Titolare in tre boli da 1 μL di FCCP da 1 mM utilizzando una siringa di vetro da 10 μL. C’è generalmente un effetto di miscelazione quando si aggiunge FCCP che si traduce in una breve diminuzione dei livelli di flusso di O2 . Attendere che il flusso di O2 aumenti e si stabilizzi prima di procedere al passaggio successivo. Premere F4 dopo ogni aggiunta per contrassegnare la sequenza temporale e contrassegnare l’etichetta con FCCP. Registrare un flusso stabile di O2 per 1 minuto dopo ogni aggiunta. Al termine del test respiratorio, rimuovere delicatamente i tappi ruotandoli e tirandoli verso l’alto. Sciacquare le camere 3 volte con H2O ultrapuro da un flacone a spruzzo, quindi 3 volte con etanolo al 70% da un flacone a spruzzo. Dopo l’ultimo risciacquo con etanolo, riempire le camere con etanolo al 70% per la conservazione. Posizionare i tappi nelle camere finché non si avverte resistenza. Non chiudere completamente i tappi. Posizionare i tappi sui tappi, salvare il file del test e scollegare lo strumento dal software di respirometria. Spegnere lo strumento. 5. Analisi dei dati Aprire il file di analisi nel software di respirometria. Estrarre i dati dalle regioni stabili del flusso di ossigeno ottenute dopo l’iniezione di composti per la respirazione. Per contrassegnare le regioni di interesse, tenere premuto il tasto Maiusc , fare clic con il pulsante sinistro del mouse e trascinare la casella sulla regione della velocità di flusso O2 stabile per le fasi di analisi descritte di seguito. Fasi di analisi 14,15,16,17,18,19,20 Segnare la sequenza temporale dopo l’aggiunta di malato/glutammato/piruvato (protocollo glicolitico aerobico) o malato/glutammato/palmitoil-carnitina (protocollo degli acidi grassi). Questo tasso rappresenta il tasso di respirazione del complesso I Stato 2 (LEAK(n)). Segna la sequenza temporale dopo l’aggiunta di ADP. Questo tasso rappresenta il tasso di respirazione del complesso I Stato 3 (CI OXPHOS). Segna la sequenza temporale dopo l’aggiunta di succinato. Questo tasso rappresenta il tasso di respirazione del complesso I+II Stato 3 (CI+II OXPHOS). Segna la sequenza temporale dopo aver aggiunto il citocromo C. Questo tasso rappresenta il tasso di respirazione del complesso I+II+Stato del citocromo 3 (CI+II+Cyt C OXPHOS). Segnare la tempistica per la titolazione FCCP con il tasso di flusso di O2 più alto. Questo tasso rappresenta la frequenza respiratoria massima (MAX ETS). Recupera i valori dei dati per le regioni contrassegnate sulla sequenza temporale selezionando Segna > statistiche. Copiare la velocità di flusso di O2 (pmol O2/(s x mg)) per la camera contrassegnata su un foglio di calcolo. Ripetere la marcatura e l’estrazione dei dati per le camere aggiuntive. Calcolare il rapporto di controllo respiratorio (RCR) dividendo il complesso I+II stato 3 (dopo l’aggiunta di succinato) per il complesso I stato 2 (prima dell’aggiunta di ADP).