מדידת נשימה מיטוכונדריאלית בסיבי שרירי שלד של בני אדם ועכבר על ידי ספירומטריה ברזולוציה גבוהה

כל הליכי העכבר אושרו על ידי הוועדה המוסדית לטיפול ושימוש בבעלי חיים של אוניברסיטת וושינגטון. עכברים מכל מין, גיל ומשקל עשויים לשמש לניסויים אלה ויהיו תלויים באופי השאלה הניסויית שאליה מבקשים להתייחס. עכברים המשמשים כאן הם בוגרים (בני 12-16 שבועות), עכברי בר זכרים מסוג C57BL/6. כל ההליכים האנושיים אושרו על ידי מועצת הביקורת המוסדית של אוניברסיטת וושינגטון. נבדקי המחקר הסכימו לשימוש בנתונים, ונתונים מייצגים של נבדקים אנושיים הכלולים בפרוטוקול זה הם ממחקרשפורסם 14. הנתונים כאן הם מנשים לא סוכרתיות לאחר גיל המעבר (55-75 שנים). פרטים להכנת ריאגנטים הדרושים לבדיקה מוצגים בטבלה 1. מידע על ריאגנטים, כלים ומכונות ספציפיים המשמשים בבדיקה מופיע בטבלת החומרים. סקירה סכמטית של הפרוטוקול מוצגת באיור 1. איור 1: סכמטי עבור רספירומטריה ברזולוציה גבוהה על דגימות שרירי שלד חדירות. השיטה המפורטת בכתב יד זה מחולקת ל-6 חלקים: 1) הכנת מאגרי נשימה וריאגנטים, 2) הכנת מכשירים ומגיבים ביום הבדיקה, 3) הכנה וחדירה של דגימות שריר, 4) הכנת דגימה ומכשיר, 5) הפעלת בדיקת הנשימה, 6) ניתוח נתונים. נוצר באמצעות BioRender.com לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה. 1. הכנת בדיקה וכיול מכשירים ביום הבדיקה, להסיר את המספר הדרוש של aliquots של כל תרכובת נשימה (blebbistatin, palmitoyl-carnitine, גלוטמט, malate, ADP, succinate, cytochrome C, FCCP) ולהפשיר על קרח. הפשירו בקבוקונים של BIOPS ו-MiR05 על קרח. הכינו תמיסות סאפונין ופירובט כמצוין בטבלה 1. הכן פתרון עבודה של MiR05 כמו בטבלה 1. הכן 5 מ”ל של פתרון עבודה של MiR05 לכל מכשיר (2 תאים). הרחב לפי הצורך. הפעל את מערכת הספירומטריה ברזולוציה גבוהה ואת מערכת הוואקום. הסר את הפקקים, הסר את תמיסת אחסון האתנול 70% על ידי ואקום, ומלא מחדש את התא עם כיתה מולקולרית טהורה במיוחד H2O. הסר H2O על ידי ואקום ומלא מחדש. חזרו על הפעולה במשך 3 כביסות בסך הכל. לאחר השטיפה הסופית, יש להוסיף 2 מ”ל של MiR05 (ללא קריאטין או בלביסטטין) לכל חדר. פתח את תוכנת הספירומטריה. לאחר אתחול התוכנה, תיפתח תיבה קופצת עבור הגדרות המכשיר. כוונו את מהירות ערבוב התא ל-750 סל”ד, את הטמפרטורה ל-37°C ואת מרווח הקלטת הנתונים ל-2 שניות. הגדר את הרווח ל- 1 ואת מתח הקיטוב ל- 800 mV עבור חיישני החמצן. לחץ על התחבר לאוקסיגרף כדי ליצור תקשורת עם המכשיר. לאחר יצירת התקשורת, תיפתח תיבת דו-שיח כדי לתת שם לקובץ הניסוי ולשמור אותו. שמור את הקובץ עם התאריך והכיול הנוכחיים. לאחר שמירת הקובץ, תופיע תיבת דו-שיח נפתחת לפרטים ניסיוניים. אין צורך במידע להפעלת הכיול, וניתן לסגור את התיבה. רשום את ריכוז החמצן למשך 30 דקות לפחות כדי לאפשר לתאים להתחמם ולהקליט אותות לכיול אוויר. ניתן לעשות זאת בעת הכנת סיבי שריר, כמפורט בשלב 2 להלן. בתום תקופת הכיול, סמן אזור כיול ברחבי האזור שבו ריכוז החמצן (הקו הכחול) יציב. לשם כך, החזק את מקש Shift לחוץ ואת לחצן העכבר השמאלי וגרור לאורך אזור בציר הזמן. פתח את חלון הכיול על-ידי מעבר אל כיול Oxygraph > O2. בתיבה ‘כיול אוויר’, בחר בסימן שנוצר בשלב 1.8. לחץ על כיול והעתק ללוח. חזור על שלבים 1.6-1.8 עבור התא הנותר. בצע כיול אוויר מדי יום. עצור את הקלטת כיול האוויר ושמור את הקובץ על-ידי התנתקות מהמכשיר. לאחר שהדגימות מוכנות, המשך לשלב 3 כדי לבצע את הבדיקה. 2. קציר וחדירה של סיבי שרירי השלד בידוד רקמת עכברעבור כל מדגם להיות מנותח, למלא באר אחת של צלחת תרבית 12 בארות עם 1 מ”ל של BIOPS. מניחים את הצלחת על קרח כדי לצנן. לאחר המתת חסד של העכבר על-ידי שאיפת פחמן דו-חמצני ואחריה פריקת צוואר הרחם, קצרו את שרירי השלד המעניינים אתכם, והקפידו להסיר את כל רקמת החיבור והשומן (איור 2A). מניחים את השריר באחת הבארות המכילות BIOPS. מניחים על קרח עד להכנת סיבים.הערה: ניתן לבחון כל שריר שלד באמצעות פרוטוקול זה – סוג השריר שייבדק יהיה תלוי בשאלת הניסוי אליה מבקשים להתייחס. במקרה של שרירי שלד עם סוגי סיבים מעורבים, כמו למשל הגסטרוקנמיוס, אפשר להפריד את הרקמה לחלקים לבנים ואדומים כדי למדוד בעיקר עווית מהירה (חתכים לבנים) ובעיקר סיבים איטיים (חתכים אדומים) (איור 2B). בידוד רקמות אנושיותאיסוף רקמות לפי פרוטוקול קליני14. שטפו במהירות את הרקמה עם PBS קר וסטרילי והניחו אותה בצינור חרוטי המכיל 2 מ”ל של תמיסת BIOPS. שומרים את הרקמה על קרח עד להכנת סיבים. הכנת סיביםהחדירה תתבצע בצלחת תרבית רקמה בת 6 בארות. הוסף 2 מ”ל של פתרון BIOPS לקבוצה אחת של בארות ו -2 מ”ל של MiR05 לקבוצה אחרת של בארות. סט אחד של בארות יידרש עבור כל דגימה שנבדקת. ארזו מגש עם קרח והניחו צלחת פטרי מזכוכית הפוכה על הקרח. הקפד תמיד לשמור את השריר על קרח. העבירו דגימות שריר שנקטפו למשטח צלחת הפטרי המצוננת באמצעות מלקחיים. בעזרת שני מלקחיים עדינים ומיקרוסקופ מנתח עם מקור אור, נקו בעדינות את הרקמה על ידי הסרת גידים, פאשיה ורקמת שומן המחוברים לשריר. לאחר שכל הרקמה החיצונית שאינה שריר הוסרה, משכו בעדינות את סיבי השריר זה מזה בעזרת המלקחיים העדינים עד שהם יהיו צרורות קטנים של סיבים שקופים באורך של 0.75 עד 1.0 מ”מ (איור 2C-D). לאחר הפרדת הסיבים, השתמשו במלקחיים כדי להעביר את צרורות הסיבים לבאר על צלחת 6 בארות המכילה תמיסת BIOPS על קרח. הוסף 20 μL של 5 מ”ג / מ”ל תמיסת סאפונין לכל BIOPS היטב לדגור את הצלחת על קרח תוך נדנוד עדין בחדר קר במשך 20 דקות. לאחר הטיפול בסאפונין יש להעביר את סיבי השריר לבאר המכילה MiR05 לשטיפה לפני הבדיקה. יש לדגור על קרח תוך כדי נדנוד עדין בחדר קר למשך 15 דקות. לאחר השלמת הדגירה של הסיבים ב-MiR05, אספו את הסיבים בעזרת מלקחיים חדים וייבשו בעדינות את סיבי השריר על מגבון משימה. יש להניח צינור מיקרוצנטריפוגה פלסטי בנפח 1.5 מ”ל על איזון עדין ולהניח 2-3 מ”ג סיבים בצינור. רשום את משקל הסיב הסופי בצד של כל צינור. מניחים את הצינור על קרח. חזור על הפעולה עם דוגמאות אחרות. המשך מיד לשלב 3. איור 2: הפרדה של סיבי שרירי שלד עכברים. (A) מורפולוגיה גסה של גסטרוקנמיוס עכברי לאחר הקציר. (B) דיסקציה של גסטרוקנמיוס למקטעים אדומים (משמאל) ולבנים (מימין). (C) סיבי שריר מופרדים מכנית. (D) תמונה של 10x של סיבי שריר שהופרדו בהצלחה. סרגל קנה המידה הוא 1 מ”מ. לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה. 3. הכנת דגימות שריר ברספירומטר שאב החוצה את MiR05 המשמש לכיול מכשירים כמפורט בשלב 1 לעיל והוסף 2.1 מ”ל של פתרון MiR05 עובד לכל תא. התחל קובץ חדש עבור הניסוי באמצעות אותן הגדרות מכשיר כמפורט בשלב 1.5. מעל. הגדר את שם הקובץ ואת הגדרות השמירה. לאחר הגדרת שם הקובץ, תיבת הדו-שיח הבאה במסך תהיה עבור פרטי ניסוי ספציפיים. הזן את נתוני הדגימה ואת המשקל של כל דגימה שנוספה לכל תא. סגור את תיבת הדו-שיח. לאחר הכניסה לקובץ הניסוי החדש, הגדר את הכיול על-ידי פתיחת חלון הכיול O2. לחץ על העתק מקובץ ובחר את הקובץ שנשמר משלב 1.9. מעל. לחץ על הלחצן כייל והעתק ללוח . חזור על התהליך עבור החדר הנותר. בעזרת מלקחיים עדינים, מעבירים בזהירות צרורות סיבי שריר לתמיסת הנשימה לחדר המתאים. חזור על הפעולה עבור החדר הנותר. הניחו את הפקקים על התא וסגרו בזהירות למחצה את התא על ידי דחיפת הפקקים בערך באמצע הדרך לתחתית. ברגע שטבעות ה-O על הפקקים מתחברות עם דופן התא ויש התנגדות, השתמשו בתנועת פיתול תוך כדי לחיצה למטה כדי להיסגר. כאשר התא סגור למחצה, ניתן להבחין בבועת אוויר קטנה בחלק העליון של החדר.הערה: סיבים חדירתיים כפופים למגבלות פיזור חמצן בתנאי נשימה רגילים. כדי לעקוף מגבלה זו, הבדיקה מתבצעת תחת ריכוזי חמצן גבוהים11. מלא מזרק פלסטיק 10 מ”ל עם חמצן טהור ממיכל חמצן. הניחו את המחט הארוכה והקהה שסופקה עם המכשיר על המזרק. הניחו את המחט בתא הראשון והעבירו לאט כ-1 מ”ל חמצן לתוך החדר. עקוב אחר ריכוז החמצן בתא בתוכנת הספירומטריה. כאשר ריכוז החמצן בתא מגיע ל-350-400nmol/mL, סובבו בעדינות את הפקק תוך כדי לחיצה כלפי מטה כדי לסגור את החדר במלואו. הסתכלו לתוך התא וודאו שלא נותרו בועות אוויר. אם קיימת בועת אוויר, פתח מחדש בזהירות ובמהירות את התא, הוסף 100 μL של תמיסת MiR05 עובדת נוספת, וסגור במהירות את התא שוב. חזור על הפעולה עם שאר החדרים. יש לשמור על ריכוזי חמצן מעל 250nmol/mL במהלך הבדיקה. הוסיפו חמצן לפי הצורך על ידי פתיחה חלקית של התא, הוספת חמצן נוסף מהמזרק לבועת האוויר, וסגירה זהירה של התא שוב. נרמל את נתוני שטף החמצן למסת הרקמה המשמשת לניסוי. כדי להתאים את הגרפים, שנה את הפריסה כך שתשקף את O2 שטף (pmol O2 / (s x mg)). מתפריט הפריסה, בחר בפריסה 06 – Specific Flux per Unit Sample. הנתונים יוצגו כעת מנורמלים לכמות הרקמה בכל חדר. 4. רספירומטריה ברזולוציה גבוהה כאשר ריכוז החמצן (הקו הכחול) ושטף O2 (הקו האדום) מתייצבים בעקבות הוספת חמצן, יש להתחיל בפרוטוקול הנשימה. חמצן יכול להיחשב יציב כאשר הקו הכחול שטוח או יורד לאט. O2 שטף צריך גם להיות שטוח בתוך 5 pmol O2 / s x mg. מוסיפים את כל הריאגנטים באמצעות מזרקי זכוכית. חשוב לא להשתמש באותו מזרק עבור מצעים, מעכבים, uncouplers. יש מזרק נפרד עבור כל אחד. לאחר הוספת כל תרכובת, רשום שטף חמצן למשך 1-2 דקות לאחר שקצב הנשימה מתייצב לפני הוספת המגיב הבא. מדידת נשימהבאמצעות מזרק זכוכית 10 μL, להוסיף 2.5 μL של 0.8 M malate לכל תא. הקש F4 כדי לסמן את ציר הזמן ולתייג את הסימון ב- M. הקלט שטף יציב O2 למשך 1-2 דקות. הוסף ריאגנטים ספציפיים לחומרים מזינים כמתואר להלן.גליקוליטי אירובי: באמצעות מזרק זכוכית 10 μL, להוסיף 10 μL של 2 M גלוטמט ו 5 μL של 2 M pyruvate לכל חדר. הקש F4 כדי לסמן את ציר הזמן ולתייג את הסימון עם G P. הקלט שטף O2 יציב למשך 1-2 דקות. חומצת שומן: באמצעות מזרק זכוכית 10 μL, להוסיף 10 μL של 2 M גלוטמט ו 10 μL של 10 mM palmitoyl-carnitine לכל חדר. הקש F4 כדי לסמן את ציר הזמן ולסמן את הסימון ב-G PC. הקלט שטף O2 יציב למשך 1-2 דקות. באמצעות מזרק זכוכית 25 μL, להוסיף 20 μL של 0.5 M (עם MgCl2) ADP לכל תא. הקש F4 כדי לסמן את ציר הזמן ולתייג את הסימון ב- ADP. הקלט שטף O2 יציב למשך 1-2 דקות. באמצעות מזרק זכוכית 25 μL, להוסיף 20 μL של 1 M succinate לכל תא. הקש F4 כדי לסמן את ציר הזמן ולתייג את הסימון ב- S. הקלט שטף יציב O2 למשך 1-2 דקות. באמצעות מזרק זכוכית 10 μL, להוסיף 5 μL של 4 mM Cytochrome C לכל תא. הקש F4 כדי לסמן את ציר הזמן ולתייג את הסימון עם Cyt C. הקלט שטף O2 יציב למשך 1-2 דקות. טיטראט בשלושה בולוסים 1 μL של 1 mM FCCP באמצעות מזרק זכוכית 10 μL. בדרך כלל יש אפקט ערבוב בעת הוספת FCCP שמביא לירידה קצרה ברמות השטף O2 . המתן עד ששטף O2 יגדל ויתייצב לפני שתמשיך לשלב הבא. הקש F4 לאחר כל תוספת כדי לסמן את ציר הזמן ואת סימון התווית ב- FCCP. הקלט שטף O2 יציב למשך דקה אחת לאחר כל תוספת. כאשר בדיקת הנשימה הושלמה, הסר בעדינות את הפקקים על ידי פיתול ומשיכה כלפי מעלה. יש לשטוף את התאים 3x עם H2O טהור במיוחד מבקבוק להשפריץ, ולאחר מכן 3x עם 70% אתנול מבקבוק להשפריץ. לאחר שטיפת האתנול הסופית, ממלאים את התאים באתנול 70% לאחסון. הניחו את הפקקים בתאים עד שתרגישו התנגדות. אין לסגור את הפקקים עד הסוף. מניחים מכסים מעל הפקקים, שומרים את קובץ הבדיקה ומנתקים את המכשיר מתוכנת Respirometry. כבה את המכשיר. 5. ניתוח נתונים פתח את קובץ הניתוח בתוכנת הרספירומטריה. חלץ נתונים מאזורי שטף חמצן יציבים המתקבלים לאחר הזרקת תרכובות נשימה. כדי לסמן אזורי עניין, החזק את מקש Shift לחוץ, לחץ על לחצן העכבר השמאלי וגרור את התיבה על-פני אזור קצב השטף היציב O2 עבור שלבי הבדיקה המפורטים להלן. שלבי הבדיקה 14,15,16,17,18,19,20סמן את ציר הזמן לאחר הוספת מלאט/גלוטמט/פירובט (פרוטוקול גליקוליטי אירובי) או מלאט/גלוטמט/פלמיטויל-קרניטין (פרוטוקול חומצות שומן). קצב זה מייצג את קצב הנשימה Complex I State 2 (LEAK(n)). סמן את ציר הזמן לאחר הוספת ADP. קצב זה מייצג קצב נשימה מורכב I State 3 (CI OXPHOS). סמן את ציר הזמן לאחר הוספת succinate. קצב זה מייצג קצב נשימה מורכב I+II State 3 (CI+II OXPHOS). סמן את ציר הזמן לאחר הוספת Cytochrome C. קצב זה מייצג קצב נשימה מורכב I+II+Cytochrome State 3 (CI+II+Cyt C OXPHOS). סמן את ציר הזמן עבור הטיטרציה של FCCP עם קצב השטף הגבוה ביותר של O2 . שיעור זה מייצג קצב נשימה מרבי (MAX ETS). אחזר את ערכי הנתונים עבור האזורים המסומנים בציר הזמן על-ידי בחירה באפשרות סמן סטטיסטיקה >. העתק את קצב השטף O2 (pmol O2/(s x mg)) עבור התא המסומן לגיליון אלקטרוני. סימון חוזר וחילוץ נתונים עבור התאים הנוספים. חשב את יחס בקרת הנשימה (RCR) על ידי חלוקת קומפלקס I+II מצב 3 (לאחר הוספת סוקצינאט) במצב קומפלקס I 2 (לפני הוספת ADP).