高解像度呼吸測定法によるヒトおよびマウス骨格筋線維のミトコンドリア呼吸の測定

すべてのマウス手順は、ワシントン大学の動物管理および使用委員会によって承認されました。これらの実験には、性別、年齢、体重を問わずマウスを使用することができ、対処しようとする実験問題の性質によって異なります。ここで使用するマウスは成体(12-16週齢)の雄性野生型C57BL/6マウスです。すべての人間の手順は、ワシントン大学の治験審査委員会によって承認されました。データの使用に同意した被験者、およびこのプロトコルに含まれる代表的なヒト被験者データは、公開された研究14 からのものです。ここでのデータは、非糖尿病性閉経後(55〜75歳)の女性からのものです。アッセイに必要な試薬の調製に関する詳細は、 表1に示されている。アッセイに使用された特定の試薬、ツール、およびマシンに関する情報は、 材料表に記載されています。プロトコルの概略図の概要を 図1に示します。 図1:透過処理された骨格筋サンプルの高解像度呼吸測定の概略図。 この原稿で詳述されている方法は、1)呼吸緩衝液と試薬の調製、2)アッセイ当日の器具と試薬の準備、3)筋肉サンプルの調製と透過化、4)サンプルと器具の調製、5)呼吸アッセイの実行、6)データ解析の6つのセクションに分かれています。BioRender.com で作成 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。 1. アッセイ調製と装置のキャリブレーション アッセイ当日は、各呼吸化合物(ブレビスタチン、パルミトイルカルニチン、グルタミン酸、リンゴ酸、ADP、コハク酸、シトクロムC、FCCP)の必要な数のアリコートを除去し、氷上で解凍します。BIOPSとMiR05のバイアルを氷上で解凍します。 表1に示すように、サポニンとピルビン酸溶液を調製します。表05のようにMiR1の作業溶液を準備します。装置あたり 5 mL の MiR05 の作業溶液を調製します (2 チャンバー)。必要に応じてスケールアップします。 高解像度呼吸計システムと真空システムの電源を入れます。ストッパーを取り外し、70%エタノール貯蔵液を真空で取り出し、チャンバーに超高純度分子グレードのH2Oを補充します。合計3回の洗浄を繰り返します。最終洗浄後、各チャンバーに 2 mL の MiR05 (クレアチンまたはブレビスタチンを含まない) を加えます。 呼吸器測定ソフトウェアを開きます。ソフトウェアが開始されると、機器設定用のポップアップボックスが開きます。チャンバーの攪拌速度を750 rpm、温度を37 °C、データ記録間隔を2秒に設定します。酸素センサーのゲインを1に、分極電圧を800mVに設定します。「 Oxygraph に接続」 をクリックして、装置との通信を確立します。 通信が確立されると、実験ファイルに名前を付けて保存するためのダイアログボックスが開きます。現在の日付とキャリブレーションでファイルを保存します。ファイルを保存すると、実験の詳細を示すポップアップダイアログボックスが表示されます。キャリブレーションの実行には情報は必要なく、ボックスを閉じることができます。 酸素濃度を少なくとも30分間記録して、チャンバーをウォームアップし、空気校正の信号を記録することができます。これは、以下のステップ2で詳しく説明するように、筋繊維を準備しながら行うことができます。 校正期間の終了時に、酸素濃度が安定している領域(青い線)を横切る校正領域をマークします。これを行うには、 Shift キーと マウスの左 ボタンを押したまま、タイムライン上の領域をドラッグします。 Oxygraph > O2 Calibrationに移動して、キャリブレーションウィンドウを開きます。[Air Calibration] で、手順 1.8 で生成されたマークを選択します。[キャリブレーションしてクリップボードにコピー] をクリックします。 残りのチャンバーについて、手順1.6〜1.8を繰り返します。毎日空気校正を行います。エアキャリブレーションの記録を停止し、保存します file 機器から切断して。サンプルの準備ができたら、ステップ3に進み、アッセイを実施します。 2. 骨格筋線維の採取と透過化 マウス組織の単離分析するサンプルごとに、12ウェル培養皿の1ウェルに1 mLのBIOPSを満たします。プレートを氷の上に置いて冷やします。 二酸化炭素の吸入とそれに続く頸部脱臼によってマウスを安楽死させた後、目的の骨格筋を採取し、すべての結合組織と脂肪を確実に除去します(図2A)。BIOPSを含むウェルの1つに筋肉を置きます。繊維が準備されるまで氷の上に置きます。注:このプロトコルを使用して、どの骨格筋も検査することができます – 検査される筋肉のタイプは、対処しようとする実験的な問題によって異なります。腓腹筋など、繊維の種類が混在する骨格筋の場合、組織を白と赤の切片に分離して、主に速筋線維(白切片)と主に遅筋線維(赤切片)を測定することができます(図2B)。 ヒト組織の分離臨床プロトコル14に従って組織を採取します。冷たく滅菌したPBSで組織をすばやくすすぎ、2 mLのBIOPS溶液が入った円錐形のチューブに入れます。繊維が調製されるまで組織を氷上に保ちます。 繊維の調製透過化は、6ウェル組織培養プレートで行われます。2 mL の BIOPS 溶液を 1 つのウェルセットに加え、2 mL の MiR05 を別のウェルセットに加えます。アッセイするサンプルごとに1セットのウェルが必要になります。 トレイに氷を詰め、ガラスのペトリ皿を逆さまにして氷の上に置きます。常に筋肉を氷の上に置いておくようにしてください。 採取した筋肉サンプルを鉗子を使用して冷やしたペトリ皿プラットフォームに移します。先端の細い2つの鉗子と光源付きの解剖顕微鏡を使用して、筋肉に付着している腱、筋膜、脂肪組織を取り除き、組織をやさしく洗浄します。 無関係な非筋肉組織をすべて取り除いたら、先端の細い鉗子で筋線維をそっと引き離し、長さ0.75〜1.0mmの半透明繊維の小さな束になるまで引き離します(図2C-D)。繊維を分離した後、鉗子を使用して、氷上のBIOPS溶液を含む6ウェルプレート上のウェルに繊維束を移します。 各BIOPSウェルに20 μLの5 mg/mLサポニン溶液を加え、プレートを氷上でインキュベートし、冷蔵室で20分間静かに揺さぶります。 サポニン処理後、アッセイ前に筋繊維を MiR05 を含むウェルに移し、すすぎます。冷たい部屋で15分間静かに揺れながら、氷上でインキュベートします。 MiR05 での繊維のインキュベーションが完了したら、鋭利な鉗子で繊維を集め、タスクワイプで筋繊維をやさしく拭いて乾かします。1.5 mLのプラスチック製微量遠心チューブをバランスよく風袋引きし、チューブに2〜3 mgの繊維を入れます。各チューブの側面に最終的な繊維重量を記録します。チューブを氷の上に置きます。他のサンプルでも繰り返します。すぐに手順3に進みます。 図2:マウス骨格筋線維の分離。 (A)収穫後のマウス腓腹筋の全形態。(B)腓腹筋を赤(左)と白(右)のセグメントに解剖します。(C)機械的に分離された筋繊維。(D)正常に分離された筋線維の10倍画像。スケールバーは1 mmです。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。 3. 呼吸計での筋肉サンプルの準備 上記のステップ 1 で詳述したように、機器のキャリブレーションに使用した MiR05 を真空引きし、各チャンバーに 2.1 mL の作業用 MiR05 溶液を追加します。 ステップ 1.5 で説明したのと同じ装置設定を使用して、実験用の新しいファイルを開始します。上。ファイル名と保存設定を行います。 ファイル名を設定した後、次の画面は特定の実験の詳細に関するダイアログボックスになります。サンプル情報と、各チャンバーに追加された各サンプルの重量を入力します。ダイアログボックスを閉じます。 新しい実験ファイルに移動したら、O2 Calibrationウィンドウを開いてキャリブレーションを設定します。「 ファイルからコピー 」をクリックし、手順1.9で保存したファイルを選択します。上。[ キャリブレーションしてクリップボードにコピー ]ボタンをクリックします。残りのチャンバーについてもこのプロセスを繰り返します。 細い鉗子を使用して、筋繊維の束を慎重に呼吸溶液に移し、適切なチャンバーに移動します。残りのチャンバーについても繰り返します。 ストッパーをチャンバーに置き、ストッパーを底まで約半分押してチャンバーを慎重に半閉じます。ストッパーのOリングがチャンバー壁にかみ合って抵抗が生じたら、押し下げながらねじる動作で閉じます。チャンバーを半分閉じると、チャンバーの上部に小さな気泡が観察できます。注:透過処理された繊維は、通常の呼吸器条件下では酸素拡散制限の対象となります。この制限を回避するために、アッセイは高い酸素濃度11の下で行われる。 10mLのプラスチックシリンジに酸素タンクからの純酸素を入れます。機器に付属の長くて鈍い針をシリンジに置きます。.針を最初のチャンバーに置き、約1 mLの酸素をゆっくりとチャンバーに供給します。 呼吸器測定ソフトウェアでチャンバーの酸素濃度を監視します。チャンバーの酸素濃度が350〜400 nmol / mLに達したら、ストッパーを押し下げながらゆっくりとひねり、チャンバーを完全に閉じます。チャンバーを覗き込み、気泡が残っていないことを確認します。気泡がある場合は、チャンバーを慎重にすばやく再度開き、100 μL の作業用 MiR05 溶液を追加して、チャンバーをすばやく再度閉じます。残りのチャンバーで繰り返します。 アッセイ中は、酸素濃度を250 nmol / mL以上に維持する必要があります。必要に応じて、チャンバーを部分的に開き、シリンジから気泡に酸素を追加し、チャンバーを再度慎重に閉じて、酸素を追加します。 酸素フラックスデータを実験に使用した組織の質量に正規化します。グラフを調整するには、O2 フラックス (pmol O2 / (s x mg)) を反映するようにレイアウトを変更します。レイアウトメニューから、「 06 – Specific Flux per Unit Sample」レイアウトを選択します。データは、各チャンバー内の組織の量に正規化されて表示されます。 4.高解像度呼吸測定 酸素添加後、酸素濃度(青線)とO2 フラックス(赤線)が安定したら、呼吸プロトコルを開始します。酸素は、青い線が平坦であるか、ゆっくりと減少している場合に安定していると見なすことができます。O2 フラックスも平坦で、5pmol O2 / s x mg以内である必要があります。 ガラスシリンジを使用してすべての試薬を添加します。基材、阻害剤、およびアンカプラーに同じシリンジを使用しないことが重要です。それぞれに別々のシリンジを用意してください。各化合物を添加した後、呼吸数が安定してから1〜2分間酸素流束を記録してから、次の試薬を添加します。 呼吸測定10 μLのガラスシリンジを使用して、各チャンバーに2.5 μLの0.8 Mリンゴ酸を加えます。 F4 を押してタイムラインをマークし、マークにM.安定したO2 フラックスを1〜2分間記録します。 以下に説明するように、栄養素特異的試薬を添加します。好気性解糖系:10 μLのガラス製シリンジを使用して、2 Mグルタミン酸10 μLと2 Mピルビン酸5 μLを各チャンバーに加えます。 F4 を押してタイムラインをマークし、マークにGPのラベルを付けます。 安定したO2 フラックスを1〜2分間記録します。 脂肪酸:10 μLのガラス製シリンジを使用して、2 Mグルタミン酸10 μLと10 μLの10 mMパルミトイルカルニチンを各チャンバーに加えます。 F4 キーを押してタイムラインをマークし、マークに G PC のラベルを付けます。安定したO2 フラックスを1〜2分間記録します。 25 μLガラスシリンジを使用して、0.5 M(MgCl2を含む)ADPを20 μLを各チャンバーに加えます。 F4 キーを押してタイムラインをマークし、マークに ADP のラベルを付けます。安定したO2 フラックスを1〜2分間記録します。 25 μLのガラスシリンジを使用して、各チャンバーに20 μLの1 Mコハク酸を加えます。 F4 を押してタイムラインをマークし、マークにSのラベルを付けます。 安定したO2 フラックスを1〜2分間記録します。 10 μLガラスシリンジを使用して、5 μLの4 mMシトクロムCを各チャンバーに加えます。 F4 を押してタイムラインをマークし、マークにCyt Cのラベルを付けます。安定したO2 フラックスを1〜2分間記録します。 10 μL ガラスシリンジを使用して、1 mM FCCP の 3 つの 1 μL ボーラスで滴定します。一般に、FCCPを追加すると、O2 フラックスレベルが一時的に減少するミキシング効果があります。O2 フラックスが増加して安定するのを待ってから、次のステップに進みます。追加するたびに F4 を押して、タイムラインとラベルマークをFCCPでマークします。各添加後1分間、安定したO2 フラックスを記録します。 呼吸アッセイが完了したら、ストッパーをねじって上に引っ張って優しく取り外します。噴出ボトルから超高純度H2Oでチャンバーを3回すすぎ、続いて噴出ボトルから70%エタノールで3回すすぎます。最終的なエタノールすすぎ後、チャンバーに70%エタノールを充填して保存します。 抵抗を感じるまでストッパーをチャンバーにセットします。ストッパーを完全に閉じないでください。ストッパーにキャップをかぶせ、アッセイファイルを保存し、装置を呼吸器測定ソフトウェアから切断します。機器の電源を切ります。 5. データ分析 呼吸器測定ソフトウェアで分析ファイルを開きます。呼吸化合物の注入後に得られた安定した酸素フラックス領域からデータを抽出します。 関心領域をマークするには、 Shift キーを押しながら マウスの左 ボタンをクリックし、以下に詳述するアッセイステージの安定したO2 フラックスレート領域を横切ってボックスをドラッグします。 アッセイステージ 14,15,16,17,18,19,20リンゴ酸/グルタミン酸/ピルビン酸(好気性解糖プロトコル)またはリンゴ酸/グルタミン酸/パルミトイルカルニチン(脂肪酸プロトコル)の添加後にタイムラインをマークします。このレートは、コンプレックス I 状態 2 の呼吸 (LEAK(n)) レートを表します。 ADPの追加後にタイムラインをマークします。この率は、複合体 I 状態 3 の呼吸 (CI OXPHOS) 率を表します。 コハク酸を追加した後、タイムラインをマークします。この速度は、複雑性 I+II 状態 3 呼吸 (CI+II OXPHOS) 速度を表します。 シトクロムCを追加した後、タイムラインをマークします。この速度は、Complex I+II+Cytochrome State 3 呼吸 (CI+II+Cyt C OXPHOS) 率を表します。 FCCP滴定のタイムラインを、O2 フラックスレートが最も高いものにマークします。このレートは、最大呼吸数 (MAX ETS) を表します。 タイムライン上のマークされた領域のデータ値を取得するには 、[>統計をマーク] を選択します。マークされたチャンバーのO2 フラックスレート(pmol O2/(s x mg))をスプレッドシートにコピーします。 追加のチャンバーに対してマーキングとデータ抽出を繰り返します。 コンプレックス I+II 状態 3 (コハク酸追加後) をコンプレックス I 状態 2 (ADP 追加前) で割ることにより、呼吸制御比 (RCR) を計算します。