Medición de la respiración mitocondrial en fibras musculares esqueléticas humanas y de ratón mediante respirometría de alta resolución

Todos los procedimientos con ratones fueron aprobados por el Comité Institucional de Cuidado y Uso de Animales de la Universidad de Washington. Se pueden utilizar ratones de cualquier sexo, edad y peso para estos experimentos y dependerán de la naturaleza de la pregunta experimental que se pretenda abordar. Los ratones utilizados aquí son ratones adultos (12-16 semanas de edad), machos de tipo salvaje C57BL/6. Todos los procedimientos humanos fueron aprobados por la Junta de Revisión Institucional de la Universidad de Washington. Los sujetos del estudio dieron su consentimiento para el uso de datos, y los datos representativos de sujetos humanos incluidos en este protocolo provienen de un estudio publicado14. Los datos aquí son de mujeres posmenopáusicas no diabéticas (55-75 años). En la Tabla 1 se presentan los detalles para la preparación de los reactivos necesarios para el ensayo. La información sobre los reactivos, herramientas y máquinas específicos utilizados en el ensayo se enumeran en la Tabla de materiales. En la Figura 1 se presenta una descripción general esquemática del protocolo. Figura 1: Esquema de respirometría de alta resolución en muestras de músculo esquelético permeabilizado. El método detallado en este manuscrito se divide en 6 secciones: 1) preparación de tampones y reactivos de respiración, 2) preparación de instrumentos y reactivos el día del ensayo, 3) preparación y permeabilización de muestras musculares, 4) preparación de muestras e instrumentos, 5) ejecución del ensayo de respiración y 6) análisis de datos. Creado con BioRender.com Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura. 1. Preparación de ensayos y calibración de instrumentos El día del ensayo, retire el número necesario de alícuotas de cada compuesto respiratorio (blebbistatina, palmitoil-carnitina, glutamato, malato, ADP, succinato, citocromo C, FCCP) y descongele en hielo. Descongele los viales de BIOPS y MiR05 en hielo. Prepare las soluciones de saponina y piruvato como se indica en la Tabla 1. Prepare una solución de trabajo de MiR05 como se muestra en la Tabla 1. Prepare 5 mL de solución de trabajo de MiR05 por instrumento (2 cámaras). Escale verticalmente según sea necesario. Encienda el sistema de respirometría de alta resolución y el sistema de vacío. Retire los tapones, retire la solución de almacenamiento de etanol al 70% al vacío y vuelva a llenar la cámara con H2O de grado molecular ultrapuro. Retire H2O al vacío y vuelva a llenar. Repita para un total de 3 lavados. Después del lavado final, añadir 2 mL de MiR05 (sin creatina ni blebbistatina) a cada cámara. Abra el software de respirometría. Una vez que se inicie el software, se abrirá un cuadro emergente para la configuración del instrumento. Ajuste la velocidad de agitación de la cámara a 750 rpm, la temperatura a 37 °C y el intervalo de registro de datos a 2 s. Ajuste la ganancia a 1 y el voltaje de polarización a 800 mV para los sensores de oxígeno. Haga clic en Conectar al oxígrafo para establecer comunicación con el instrumento. Una vez establecida la comunicación, se abrirá un cuadro de diálogo para nombrar y guardar el archivo experimental. Guarde el archivo con la fecha actual y la calibración. Después de guardar el archivo, aparecerá un cuadro de diálogo emergente para los detalles experimentales. No se necesita información para la ejecución de la calibración y la caja se puede cerrar. Registre la concentración de oxígeno durante al menos 30 minutos para permitir que las cámaras se calienten y para registrar señales para la calibración del aire. Esto se puede hacer mientras se preparan las fibras musculares, como se detalla en el paso 2 a continuación. Al final del período de calibración, marque una región de calibración en la que la concentración de oxígeno (línea azul) sea estable. Para ello, mantenga pulsada la tecla Mayús y el botón izquierdo del ratón y arrastre por una región de la línea de tiempo. Abra la ventana de calibración yendo al Oxígrafo > Calibración de O2. En Calibración de aire, seleccione la marca generada en el paso 1.8. Haga clic en Calibrar y copiar en el portapapeles. Repita los pasos 1.6-1.8 para la cámara restante. Realice la calibración del aire a diario. Detenga la grabación de calibración de aire y guarde el archivo desconectándolo del instrumento. Una vez que las muestras estén listas, continúe con el paso 3 para realizar el ensayo. 2. Recolección y permeabilización de las fibras del músculo esquelético Aislamiento de tejido de ratónPara cada muestra que se vaya a analizar, llene un pocillo de una placa de cultivo de 12 pocillos con 1 ml de BIOPS. Coloque el plato sobre hielo para que se enfríe. Después de sacrificar al ratón por inhalación de dióxido de carbono seguida de dislocación cervical, extraiga el músculo esquelético de interés, asegurándose de eliminar todo el tejido conectivo y la grasa (Figura 2A). Coloque el músculo en uno de los pocillos que contienen BIOPS. Coloque en hielo hasta la preparación de la fibra.NOTA: Cualquier músculo esquelético puede ser examinado usando este protocolo: el tipo de músculo examinado dependerá de la pregunta experimental que se busque abordar. En el caso de los músculos esqueléticos con tipos de fibras mixtas, como el gastrocnemio, es posible separar el tejido en secciones blancas y rojas para medir las fibras predominantemente de contracción rápida (secciones blancas) y predominantemente de contracción lenta (secciones rojas) (Figura 2B). Aislamiento de tejidos humanosRecolectar tejido siguiendo el protocolo clínico14. Enjuague rápidamente el tejido con PBS frío y estéril y colóquelo en un tubo cónico que contenga 2 ml de solución BIOPS. Mantenga el pañuelo en hielo hasta que se prepare la fibra. Preparación de la fibraLa permeabilización se llevará a cabo en una placa de cultivo de tejidos de 6 pocillos. Agregue 2 mL de solución BIOPS a un conjunto de pocillos y 2 mL de MiR05 a otro conjunto de pocillos. Se requerirá un conjunto de pocillos para cada muestra que se ensaye. Empaque una bandeja con hielo y coloque una placa de Petri de vidrio boca abajo sobre el hielo. Asegúrate de mantener siempre el músculo en hielo. Transfiera las muestras de músculo recolectadas a la plataforma de la placa de Petri refrigerada con pinzas. Con dos pinzas de punta fina y un microscopio de disección con una fuente de luz, limpie suavemente el tejido eliminando los tendones, la fascia y el tejido adiposo que estén adheridos al músculo. Después de que se haya eliminado todo el tejido no muscular extraño, separe suavemente las fibras musculares con las pinzas de punta fina hasta que sean pequeños haces de fibras translúcidas que van desde 0,75 a 1,0 mm de longitud (Figura 2C-D). Después de separar las fibras, use las pinzas para transferir los haces de fibras a un pocillo en la placa de 6 pocillos que contiene la solución de BIOPS en hielo. Añada 20 μl de solución de saponina de 5 mg/ml a cada pocillo de BIOPS e incube la placa en hielo mientras se mece suavemente en una cámara fría durante 20 minutos. Después del tratamiento con saponinas, transfiera las fibras musculares al pocillo que contiene MiR05 para enjuagar antes del ensayo. Incuba en hielo mientras se mece suavemente en una habitación fría durante 15 min. Una vez completada la incubación de las fibras en MiR05, recoja las fibras con pinzas afiladas y seque suavemente las fibras musculares con una toallita de trabajo. Tara un tubo de microcentrífuga de plástico de 1,5 mL en una balanza fina y coloca 2-3 mg de fibras en el tubo. Registre el peso final de la fibra en el costado de cada tubo. Coloque el tubo sobre hielo. Repita con otras muestras. Proceda inmediatamente al paso 3. Figura 2: Separación de las fibras del músculo esquelético del ratón. (A) Morfología macroscópica del gastrocnemio de ratón después de la cosecha. (B) Disección del gastrocnemio en segmentos rojos (izquierda) y blancos (derecha). (C) Fibras musculares separadas mecánicamente. (D) Una imagen de 10x de fibras musculares separadas con éxito. La barra de escala es de 1 mm. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura. 3. Preparación de muestras musculares en el respirómetro Aspire el MiR05 utilizado para la calibración del instrumento como se detalla en el paso 1 anterior y agregue 2,1 ml de solución de MiR05 de trabajo a cada cámara. Inicie un nuevo archivo para el experimento utilizando la misma configuración del instrumento que se detalla en el paso 1.5. encima. Establezca el nombre del archivo y la configuración de guardado. Después de configurar el nombre del archivo, el siguiente cuadro de diálogo de la pantalla será para detalles experimentales específicos. Introduzca la información de la muestra y el peso de cada muestra añadida a cada cámara. Cierre el cuadro de diálogo. Una vez en el nuevo archivo experimental, configure la calibración abriendo la ventana Calibración de O2. Haga clic en Copiar de archivo y seleccione el archivo guardado del paso 1.9. encima. Haga clic en el botón Calibrar y copiar en el portapapeles . Repita el proceso para la cámara restante. Con pinzas finas, transfiera con cuidado los haces de fibras musculares a la solución respiratoria para la cámara adecuada. Repita para la cámara restante. Coloque los tapones en la cámara y semicierre con cuidado la cámara empujando los tapones hasta la mitad del fondo. Una vez que las juntas tóricas de los tapones se enganchen con la pared de la cámara y haya resistencia, use un movimiento de torsión mientras empuja hacia abajo para cerrar. Cuando la cámara está medio cerrada, se puede observar una pequeña burbuja de aire en la parte superior de la cámara.NOTA: Las fibras permeabilizadas están sujetas a limitaciones de difusión de oxígeno en condiciones respiratorias regulares. Para eludir esta limitación, el ensayo se realiza bajo concentraciones elevadas de oxígeno11. Llene una jeringa de plástico de 10 ml con oxígeno puro de un tanque de oxígeno. Coloque la aguja larga y roma suministrada con el instrumento en la jeringa. Coloque la aguja en la primera cámara y administre lentamente aproximadamente 1 mL de oxígeno en la cámara. Controle la concentración de oxígeno de la cámara en el software de respirometría. Cuando la concentración de oxígeno de la cámara alcance los 350-400 nmol/mL, gire suavemente el tapón mientras empuja hacia abajo para cerrar completamente la cámara. Mire dentro de la cámara y asegúrese de que no queden burbujas de aire. Si hay una burbuja de aire, vuelva a abrir la cámara con cuidado y rapidez, agregue 100 μL de solución de trabajo adicional de MiR05 y vuelva a cerrar rápidamente la cámara. Repita con las cámaras restantes. Las concentraciones de oxígeno deben mantenerse por encima de 250 nmol/mL durante el ensayo. Agregue oxígeno adicional según sea necesario abriendo parcialmente la cámara, agregando más oxígeno de la jeringa a la burbuja de aire y cerrando cuidadosamente la cámara nuevamente. Normalice los datos de flujo de oxígeno a la masa de tejido utilizada para el experimento. Para ajustar los gráficos, cambie el diseño para reflejar el flujo de O2 (pmol O2 / (s x mg)). En el menú de diseño, seleccione el diseño 06 – Flujo específico por unidad de muestra. Los datos ahora se presentarán normalizados a la cantidad de tejido en cada cámara. 4. Respirometría de alta resolución Cuando la concentración de oxígeno (línea azul) y el flujo deO2 (línea roja) se hayan estabilizado después de la adición de oxígeno, comience el protocolo de respiración. El oxígeno se puede considerar estable cuando la línea azul es plana o disminuye lentamente. El flujo de O2 también debe ser plano y dentro de 5 pmol Ø2 / s x mg. Agregue todos los reactivos usando jeringas de vidrio. Es importante no utilizar la misma jeringa para los sustratos, los inhibidores y los desacoplantes. Tenga una jeringa separada para cada uno. Después de agregar cada compuesto, registre el flujo de oxígeno durante 1-2 minutos después de que la tasa de respiración se estabilice antes de agregar el siguiente reactivo. Medición de la respiraciónCon una jeringa de vidrio de 10 μL, agregue 2,5 μL de malato de 0,8 M a cada cámara. Presione F4 para marcar la línea de tiempo y etiquetar la marca con M. Registre el flujo estable de O2 durante 1-2 min. Agregue reactivos específicos de nutrientes como se describe a continuación.Glucolítico aeróbico: Usando una jeringa de vidrio de 10 μL, agregue 10 μL de glutamato 2 M y 5 μL de piruvato 2 M a cada cámara. Presione F4 para marcar la línea de tiempo y etiquetar la marca con G P. Registre el flujo estable de O2 durante 1-2 minutos. Ácido graso: Con una jeringa de vidrio de 10 μL, añadir 10 μL de glutamato 2 M y 10 μL de palmitoil-carnitina 10 mM a cada cámara. Presione F4 para marcar la línea de tiempo y etiquetar la marca con G PC. Registre un flujo estable de O2 durante 1-2 min. Con una jeringa de vidrio de 25 μL, agregue 20 μL de 0,5 M (con MgCl2) de ADP a cada cámara. Presione F4 para marcar la línea de tiempo y etiquetar la marca con ADP. Registre un flujo estable de O2 durante 1-2 min. Con una jeringa de vidrio de 25 μL, agregue 20 μL de succinato 1 M a cada cámara. Presione F4 para marcar la línea de tiempo y etiquétela con S. Registre el flujo estable de O2 durante 1-2 minutos. Con una jeringa de vidrio de 10 μL, agregue 5 μL de citocromo C de 4 mM a cada cámara. Presione F4 para marcar la línea de tiempo y etiquetar la marca con Cyt C. Registre el flujo estable de O2 durante 1-2 minutos. Valoración en tres bolos de 1 μL de FCCP de 1 mM utilizando una jeringa de vidrio de 10 μL. Por lo general, hay un efecto de mezcla al agregar FCCP que resulta en una breve disminución en los niveles de flujo deO2 . Espere a que el flujo de O2 aumente y se estabilice antes de continuar con el siguiente paso. Presione F4 después de cada adición para marcar la línea de tiempo y la marca de etiqueta con FCCP. Registre el flujo estable de O2 durante 1 minuto después de cada adición. Una vez finalizado el ensayo de respiración, retire suavemente los tapones girándolos y tirando hacia arriba. Enjuague las cámaras 3 veces con H2O ultrapuro de una botella rociadora, seguido de 3 veces con etanol al 70% de una botella rociadora. Después del enjuague final con etanol, llene las cámaras con etanol al 70% para su almacenamiento. Coloque los tapones en las cámaras hasta que sienta resistencia. No cierre los tapones por completo. Coloque tapas sobre los tapones, guarde el archivo de ensayo y desconecte el instrumento del software de respirometría. Apague el instrumento. 5. Análisis de datos Abra el archivo de análisis en el software de respirometría. Extraiga datos de regiones estables de flujo de oxígeno obtenidas después de la inyección de compuestos respiratorios. Para marcar las regiones de interés, mantenga pulsada la tecla Mayús , haga clic con el botón izquierdo del ratón y arrastre el cuadro por la región de tasa de flujo de O2 estable para las etapas del ensayo que se detallan a continuación. Etapas de ensayo 14,15,16,17,18,19,20Marque la línea de tiempo después de la adición de malato/glutamato/piruvato (protocolo glucolítico aeróbico) o malato/glutamato/palmitoil-carnitina (protocolo de ácidos grasos). Esta tasa representa la tasa de respiración del Complejo I Estado 2 (LEAK(n)). Marque la línea de tiempo después de la adición de ADP. Esta tasa representa la tasa de respiración del estado 3 del complejo I (CI OXPHOS). Marque la línea de tiempo después de la adición de succinato. Esta tasa representa la tasa de respiración del Complejo I + II Estado 3 (CI + II OXPHOS). Marque la línea de tiempo después de agregar el citocromo C. Esta tasa representa la tasa de respiración del Complejo I + II + Estado 3 del Citocromo (CI + II + Cyt C OXPHOS). Marque el cronograma para la valoración de FCCP con la tasa de flujo de O2 más alta. Esta tasa representa la Frecuencia Respiratoria Máxima (MAX ETS). Recupere los valores de datos de las regiones marcadas en la escala de tiempo seleccionando Marcar > estadísticas. Copie la tasa de flujo de O2 (pmol O2/(s x mg)) de la cámara marcada en una hoja de cálculo. Repetición del marcado y extracción de datos para las cámaras adicionales. Calcule la relación de control respiratorio (RCR) dividiendo el estado 3 del complejo I + II (después de la adición de succinato) por el estado 2 del complejo I (antes de la adición de ADP).