İnsan ve Fare İskelet Kası Liflerinde Mitokondriyal Solunumun Yüksek Çözünürlüklü Respirometri ile Ölçülmesi

Tüm fare prosedürleri Washington Üniversitesi Kurumsal Hayvan Bakımı ve Kullanımı Komitesi tarafından onaylandı. Herhangi bir cinsiyet, yaş ve ağırlıktaki fareler bu deneyler için kullanılabilir ve ele alınmaya çalışılan deneysel sorunun doğasına bağlı olacaktır. Burada kullanılan fareler yetişkin (12-16 haftalık), erkek vahşi tip C57BL / 6 farelerdir. Tüm insan prosedürleri Washington Üniversitesi Kurumsal İnceleme Kurulu tarafından onaylandı. Veri kullanımına izin verilen çalışma denekleri ve bu protokolde yer alan temsili insan denek verileri yayınlanmış bir çalışmadanalınmıştır 14. Buradaki veriler diyabetik olmayan menopoz sonrası (55-75 yaş) kadınlardan alınmıştır. Tahlil için gerekli reaktiflerin hazırlanmasına ilişkin detaylar Tablo 1’de sunulmuştur. Tahlilde kullanılan spesifik reaktifler, aletler ve makineler hakkındaki bilgiler Malzeme Tablosunda listelenmiştir. Protokolün şematik bir genel bakışı Şekil 1’de sunulmuştur. Şekil 1: Geçirgenleştirilmiş iskelet kası örneklerinde yüksek çözünürlüklü respirometri şeması.Bu yazıda ayrıntılı olarak açıklanan yöntem 6 bölüme ayrılmıştır: 1) solunum tamponlarının ve reaktiflerinin hazırlanması, 2) test gününde alet ve reaktif hazırlanması, 3) kas örneklerinin hazırlanması ve geçirgenliği, 4) numune ve alet hazırlama, 5) solunum testinin çalıştırılması ve 6) veri analizi. Şununla oluşturuldu BioRender.com Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın. 1. Tahlil hazırlama ve cihaz kalibrasyonu Tahlil gününde, her bir solunum bileşiğinin (blebbistatin, palmitoil-karnitin, glutamat, malat, ADP, süksinat, sitokrom C, FCCP) gerekli sayıda alikotunu çıkarın ve buz üzerinde çözdürün. BIOPS ve MiR05 şişelerini buz üzerinde çözdürün. Sabunin ve piruvat çözeltilerini Tablo 1’de belirtildiği gibi hazırlayın. Tablo 05’deki gibi MiR1’in çalışan bir çözümünü hazırlayın. Alet başına (2 oda) 5 mL MiR05 çalışma çözeltisi hazırlayın. Gerektiği gibi ölçeklendirin. Yüksek çözünürlüklü respirometri sistemini ve vakum sistemini açın. Tıpaları çıkarın,% 70 etanol depolama çözeltisini vakumla çıkarın ve hazneyi ultra saf moleküler derece H2O ile doldurun. H2O’yu vakumla çıkarın ve yeniden doldurun. Toplam 3 yıkama için tekrarlayın. Son yıkamadan sonra, her odaya 2 mL MiR05 (kreatin veya blebbistatin olmadan) ekleyin. Respirometri yazılımını açın. Yazılım başlatıldıktan sonra, cihaz ayarları için bir açılır kutu açılacaktır. Hazne karıştırma hızını 750 rpm’ye, sıcaklığı 37 °C’ye ve veri kayıt aralığını 2 s’ye ayarlayın. Oksijen sensörleri için kazancı 1’e ve polarizasyon voltajını 800 mV’a ayarlayın. Cihazla iletişim kurmak için Oxygraph’a Bağlan’a tıklayın. İletişim kurulduktan sonra, deney dosyasını adlandırmak ve kaydetmek için bir iletişim kutusu açılacaktır. Dosyayı geçerli tarih ve kalibrasyon ile kaydedin. Dosyayı kaydettikten sonra, deneysel ayrıntılar için bir açılır iletişim kutusu görünecektir. Kalibrasyon çalışması için herhangi bir bilgiye gerek yoktur ve kutu kapatılabilir. Odaların ısınmasına izin vermek ve hava kalibrasyonu sinyallerini kaydetmek için oksijen konsantrasyonunu en az 30 dakika boyunca kaydedin. Bu, aşağıdaki 2. adımda ayrıntılı olarak açıklandığı gibi kas lifleri hazırlanırken yapılabilir. Kalibrasyon periyodunun sonunda, oksijen konsantrasyonunun (mavi çizgi) sabit olduğu bölge boyunca bir kalibrasyon bölgesi işaretleyin. Bunu yapmak için, Shift tuşunu ve Sol Fare düğmesini basılı tutun ve zaman çizelgesinde bir bölge boyunca sürükleyin. Oxygraph > O2 Kalibrasyonu’na giderek kalibrasyon penceresini açın. Hava Kalibrasyonu için, adım 1.8’de oluşturulan işareti seçin. Kalibre Et ve Panoya Kopyala’yı tıklayın. Kalan oda için 1.6-1.8 adımlarını tekrarlayın. Günlük hava kalibrasyonu yapın. Hava kalibrasyonu kaydını durdurun ve filecihazla bağlantıyı keserek. Numuneler hazır olduktan sonra, testi gerçekleştirmek için 3. adıma geçin. 2. İskelet kası liflerinin toplanması ve geçirgenliği Fare dokusu izolasyonuAnaliz edilecek her numune için, 12 oyuklu bir kültür kabının bir kuyusunu 1 mL BIOPS ile doldurun. Soğuması için tabağı buzun üzerine koyun. Fareyi karbondioksit inhalasyonu ve ardından servikal çıkık ile ötenazi yaptıktan sonra, tüm bağ dokusunu ve yağı çıkardığınızdan emin olarak ilgilenilen iskelet kasını hasat edin (Şekil 2A). Kası, BIOPS içeren kuyucuklardan birine yerleştirin. Lif hazırlanana kadar buzun üzerine koyun.NOT: Herhangi bir iskelet kası bu protokol kullanılarak incelenebilir – incelenen kas tipi, ele alınmaya çalışılan deneysel soruya bağlı olacaktır. Gastroknemius gibi karışık lif tiplerine sahip iskelet kasları söz konusu olduğunda, ağırlıklı olarak hızlı seğirme (beyaz bölümler) ve ağırlıklı olarak yavaş seğirme (kırmızı bölümler) liflerini ölçmek için dokuyu beyaz ve kırmızı bölümlere ayırmak mümkündür (Şekil 2B). İnsan doku izolasyonuKlinik protokole uygun olarak doku toplayın14. Dokuyu soğuk, steril PBS ile hızlı bir şekilde durulayın ve 2 mL BIOPS solüsyonu içeren konik bir tüpe yerleştirin. Lif hazırlanana kadar dokuyu buz üzerinde tutun. Elyaf hazırlamaPermeabilizasyon, 6 oyuklu bir doku kültürü plakasında gerçekleşecektir. Bir kuyucuk setine 2 mL BIOPS çözeltisi ve başka bir kuyucuk setine 2 mL MiR05 ekleyin. Tahlil edilen her numune için bir set kuyu gerekli olacaktır. Buzlu bir tepsi hazırlayın ve buzun üzerine baş aşağı bir cam Petri kabı yerleştirin. Kası her zaman buz üzerinde tuttuğunuzdan emin olun. Toplanan kas örneklerini forseps kullanarak soğutulmuş Petri kabı platformuna aktarın. İki ince uçlu forseps ve ışık kaynaklı bir diseksiyon mikroskobu kullanarak, kasa bağlı tendonları, fasyaları ve yağ dokusunu çıkararak dokuyu nazikçe temizleyin. Tüm yabancı kas dışı dokular çıkarıldıktan sonra, kas liflerini, uzunlukları 0.75 – 1.0 mm arasında değişen küçük yarı saydam lif demetleri olana kadar ince uçlu forseps ile nazikçe ayırın (Şekil 2C-D). Lifleri ayırdıktan sonra, lif demetlerini buz üzerinde BIOPS çözeltisi içeren 6 oyuklu plaka üzerindeki bir kuyuya aktarmak için forsepsleri kullanın. Her bir BIOPS kuyucuğuna 20 μL 5 mg / mL saponin çözeltisi ekleyin ve 20 dakika boyunca soğuk bir odada hafifçe sallanırken plakayı buz üzerinde inkübe edin. Saponin tedavisinden sonra, testten önce durulamak için kas liflerini MiR05 içeren kuyucuğa aktarın. 15 dakika boyunca soğuk bir odada hafifçe sallanırken buz üzerinde kuluçkaya yatırın. MiR05’teki lif inkübasyonu tamamlandıktan sonra, lifleri keskin forsepslerle toplayın ve kas liflerini bir görev mendili üzerinde nazikçe kurulayın. 1.5 mL’lik bir plastik mikrosantrifüj tüpünü ince bir teraziye darayın ve tüpe 2-3 mg lif yerleştirin. Her tüpün yan tarafındaki son lif ağırlığını kaydedin. Tüpü buzun üzerine yerleştirin. Diğer örneklerle tekrarlayın. Hemen 3. adıma geçin. Şekil 2: Fare iskelet kası liflerinin ayrılması. (A) Hasattan sonra fare gastroknemiusunun brüt morfolojisi. (B) Gastroknemius’un kırmızı (sol) ve beyaz (sağ) segmentlere diseksiyonu. (C) Mekanik olarak ayrılmış kas lifleri. (D) Başarıyla ayrılmış kas liflerinin 10x görüntüsü. Ölçek çubuğu 1 mm’dir. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın. 3. Respirometrede kas örneklerinin hazırlanması Yukarıdaki 05. adımda ayrıntılı olarak açıklandığı gibi cihaz kalibrasyonu için kullanılan MiR1’i vakumlayın ve her odaya 2.1 mL çalışan MiR05 çözeltisi ekleyin. Adım 1.5’te ayrıntılı olarak açıklandığı gibi aynı cihaz ayarlarını kullanarak deney için yeni bir dosya başlatın. üstünde. Dosya adını ve kaydetme ayarlarını yapın. Dosya adını ayarladıktan sonra, bir sonraki ekran iletişim kutusu belirli deneysel ayrıntılar için olacaktır. Numune bilgilerini ve her hazneye eklenen her numunenin ağırlığını girin. İletişim kutusunu kapatın. Yeni deney dosyasına girdikten sonra, O2 Kalibrasyon penceresini açarak kalibrasyonu ayarlayın. Dosyadan kopyala’ya tıklayın ve adım 1.9’da kaydedilen dosyayı seçin. üstünde. Tıkla Kalibre Et ve Panoya Kopyala düğmesine basın. Kalan oda için işlemi tekrarlayın. İnce forseps kullanarak, kas lifi demetlerini uygun oda için solunum çözeltisine dikkatlice aktarın. Kalan oda için tekrarlayın. Tıpaları haznenin üzerine yerleştirin ve tıpaları dibe doğru yarıya kadar iterek hazneyi dikkatlice yarı kapatın. Tıpalardaki o-ringler hazne duvarına geçtiğinde ve direnç oluştuğunda, kapatmak için aşağı iterken bir döndürme hareketi kullanın. Hazne yarıya kadar kapatıldığında, haznenin üst kısmında küçük bir hava kabarcığı görülebilir.NOT: Geçirgen lifler, normal solunum koşulları altında oksijen difüzyon sınırlamalarına tabidir. Bu sınırlamayı aşmak için, test yüksek oksijen konsantrasyonları11 altında gerçekleştirilir. 10 mL’lik bir plastik şırıngayı bir oksijen tankından saf oksijenle doldurun. Aletle birlikte verilen uzun, keskin olmayan iğneyi şırınganın üzerine yerleştirin. İğneyi ilk hazneye yerleştirin ve hazneye yavaşça yaklaşık 1 mL oksijen verin. Respirometri yazılımında oda oksijen konsantrasyonunu izleyin. Hazne oksijen konsantrasyonu 350-400 nmol/mL’ye ulaştığında, hazneyi tamamen kapatmak için aşağı iterken durdurucuyu hafifçe çevirin. Hazneye bakın ve hava kabarcığı kalmadığından emin olun. Bir hava kabarcığı varsa, hazneyi dikkatlice ve hızlı bir şekilde yeniden açın, 100 μL ek çalışma MiR05 solüsyonu ekleyin ve hazneyi hızlı bir şekilde tekrar kapatın. Kalan odacıklarla tekrarlayın. Test sırasında oksijen konsantrasyonları 250 nmol / mL’nin üzerinde tutulmalıdır. Hazneyi kısmen açarak, şırıngadan hava kabarcığına daha fazla oksijen ekleyerek ve hazneyi tekrar dikkatlice kapatarak gerektiği kadar ilave oksijen ekleyin. Oksijen akışı verilerini deney için kullanılan doku kütlesine göre normalleştirin. Grafikleri ayarlamak için düzeni O2 Akısını (pmol O2 / (s x mg)) yansıtacak şekilde değiştirin. Düzen menüsünden, 06 – Birim Örneği Başına Özgül Akı düzenini seçin. Veriler şimdi her odadaki doku miktarına göre normalleştirilmiş olarak sunulacaktır. 4. Yüksek çözünürlüklü respirometri Oksijen (mavi çizgi) konsantrasyonu veO2 akısı (kırmızı çizgi) oksijen ilavesini takiben stabilize olduğunda, solunum protokolüne başlayın. Mavi çizgi düz olduğunda veya yavaş yavaş azaldığında oksijen stabil olarak kabul edilebilir. O2 akısı da düz olmalı ve 5 pmol O2 / s x mg içinde olmalıdır. Cam şırıngalar kullanarak tüm reaktifleri ekleyin. Alt tabakalar, inhibitörler ve birleştiriciler için aynı şırıngayı kullanmamak önemlidir. Her biri için ayrı bir şırınga bulundurun. Her bir bileşiği ekledikten sonra, bir sonraki reaktifi eklemeden önce solunum hızı stabilize olduktan sonra 1-2 dakika boyunca oksijen akışını kaydedin. Solunum ölçümü10 μL’lik bir cam şırınga kullanarak, her odaya 2,5 μL 0,8 M malat ekleyin. Zaman çizelgesini işaretlemek için F4 tuşuna basın ve işareti M ile etiketleyin. 1-2 dakika boyunca sabit O2 akısını kaydedin. Aşağıda açıklandığı gibi besine özgü reaktifler ekleyin.Aerobik Glikolitik: 10 μL’lik bir cam şırınga kullanarak, her odaya 10 μL 2 M glutamat ve 5 μL 2 M piruvat ekleyin. Zaman çizelgesini işaretlemek için F4 tuşuna basın ve işareti G P ile etiketleyin. 1-2 dakika boyunca sabit O2 akısını kaydedin. Yağ asidi: 10 μL’lik bir cam şırınga kullanarak, her odaya 10 μL 2 M glutamat ve 10 μL 10 mM palmitoil-karnitin ekleyin. Zaman çizelgesini işaretlemek için F4 tuşuna basın ve işareti G PC ile etiketleyin. 1-2 dakika boyunca sabit O2 akısını kaydedin. 25 μL’lik bir cam şırınga kullanarak, her odaya 20 μL 0.5 M (MgCl2 ile) ADP ekleyin. Zaman çizelgesini işaretlemek için F4 tuşuna basın ve işareti ADP ile etiketleyin. 1-2 dakika boyunca sabit O2 akısını kaydedin. 25 μL’lik bir cam şırınga kullanarak, her odaya 20 μL 1 M süksinat ekleyin. Zaman çizelgesini işaretlemek için F4 tuşuna basın ve işareti S ile etiketleyin. 1-2 dakika boyunca sabit O2 akısını kaydedin. 10 μL’lik bir cam şırınga kullanarak, her odaya 5 μL 4 mM Sitokrom C ekleyin. Zaman çizelgesini işaretlemek için F4 tuşuna basın ve işareti Cyt C ile etiketleyin. 2-1 dakika boyunca sabit O2 akısı kaydedin. 10 μL’lik bir cam şırınga kullanarak 1 mM FCCP’lik üç adet 1 μL bolus halinde titre edin. FCCP eklenirken genellikleO2 akı seviyelerinde kısa bir azalmaya neden olan bir karıştırma etkisi vardır. Bir sonraki adıma geçmeden önce O2 akısının artmasını ve stabilize olmasını bekleyin. Zaman çizelgesini işaretlemek ve FCCP ile işaretlemek için her eklemeden sonra F4 tuşuna basın. Her eklemeden sonra 1 dakika boyunca kararlı O2 akısını kaydedin. Solunum testi tamamlandığında, yukarı doğru çevirerek ve çekerek tıpaları nazikçe çıkarın. Hazneleri 3 kez bir fışkırtma şişesinden ultra saf H2O ile, ardından bir fışkırtma şişesinden% 3 etanol ile 70 kez durulayın. Son etanol durulamasından sonra, saklama için hazneleri etanol ile doldurun. Direnç hissedene kadar tıpaları odalara yerleştirin. Tıpaları tamamen kapatmayın. Kapakları tıpaların üzerine yerleştirin, tahlil dosyasını kaydedin ve cihazı Respirometri yazılımından ayırın. Enstrümanı kapatın. 5. Veri analizi Analiz dosyasını respirometri yazılımında açın. Solunum bileşiklerinin enjeksiyonundan sonra elde edilen stabil oksijen akışı bölgelerinden veri çıkarın. İlgilenilen bölgeleri işaretlemek için Shift tuşunu basılı tutun, Sol fare düğmesine tıklayın ve aşağıda ayrıntıları verilen tahlil aşamaları için kutuyu sabit O2 akı hızı bölgesi boyunca sürükleyin. Tahlil aşamaları 14,15,16,17,18,19,20Malat/glutamat/piruvat (aerobik glikolitik protokol) veya malat/glutamat/palmitoil-karnitin (yağ asidi protokolü) eklendikten sonra zaman çizelgesini işaretleyin. Bu oran, Kompleks I Durum 2 solunum (LEAK(n)) oranını temsil eder. ADP’nin eklenmesinden sonra zaman çizelgesini işaretleyin. Bu oran, Kompleks I Durum 3 solunum (CI OXPHOS) hızını temsil eder. Süksinat eklendikten sonra zaman çizelgesini işaretleyin. Bu oran, Kompleks I+II Durum 3 solunum (CI+II OXPHOS) hızını temsil eder. Sitokrom C’yi ekledikten sonra zaman çizelgesini işaretleyin. Bu oran Kompleks I+II+Sitokrom Durum 3 solunum (CI+II+Cyt C, OXPHOS) hızını temsil eder. FCCP titrasyonu için zaman çizelgesini en yüksek O2 akı hızıyla işaretleyin. Bu oran Maksimum Solunum Hızını (MAX ETS) temsil eder. İstatistik İşaretle’yi seçerek zaman çizelgesinde işaretli bölgeler için veri değerlerini alın > İşaretli oda için O2 Akı oranını (pmol O2/(s x mg)) bir elektronik tabloya kopyalayın. Ek bölmeler için işaretleme ve veri çıkarma işlemlerini tekrarlayın. Kompleks I+II Durum 3’ü (süksinat ilavesini takiben) Kompleks I Durum 2’ye (ADP ilavesinden önce) bölerek solunum kontrol oranını (RCR) hesaplayın.