JoVE Journal > Biology
Summary
Abstract
Introduction
Protocol
Results
Discussion
Disclosures
Acknowledgements
Materials
References
Nederlands

Automatically Generated
Please note that all translations are automatically generated. Click here for the English version.
Biology

Meting van mitochondriale ademhaling in skeletspiervezels van mens en muis door middel van respirometrie met hoge resolutie

Published: October 04, 2024
doi:
10.3791/66834
,
1John T. Milliken Department of Medicine, Division of Nutritional Sciences and Obesity Medicine,Washington University School of Medicine, 2Nutrition and Obesity Research Center, Cellular and Molecular Biology Core,Washington University School of Medicine, 3Nutrition and Obesity Research Center, Animal Model Research Core,Washington University School of Medicine

Summary

Hier beschrijven we een uitgebreide methode voor het meten van mitochondriale oxidatieve fosforylering in verse gepermeabiliseerde skeletspiervezels van menselijke of muizenspieren. Deze methode maakt de real-time kwantificering van de mitochondriale ademhaling en de beoordeling van brandstofvoorkeur en metabole flexibiliteit mogelijk, met behoud van bestaande mitochondriale netwerken en membraanintegriteit.

Abstract

De mitochondriale functie, een hoeksteen van de cellulaire energieproductie, is van cruciaal belang voor het handhaven van de metabole homeostase. De disfunctie in de skeletspieren is gekoppeld aan veel voorkomende stofwisselingsstoornissen (bijv. diabetes en obesitas), spierdystrofieën en sarcopenie. Hoewel er veel technieken zijn om de mitochondriale inhoud en morfologie te evalueren, is de kenmerkende methode om de mitochondriale functie te beoordelen de meting van mitochondriale oxidatieve fosforylering (OXPHOS) door middel van respirometrie. Kwantificering van mitochondriale OXPHOS geeft inzicht in de efficiëntie van mitochondriale oxidatieve energieproductie en cellulaire bio-energetica. Een respirometer met hoge resolutie biedt zeer gevoelige, robuuste metingen van mitochondriale OXPHOS in gepermeabiliseerde spiervezels door real-time veranderingen in het mitochondriale zuurstofverbruik te meten. Het gebruik van gepermeabiliseerde spiervezels, in tegenstelling tot geïsoleerde mitochondriën, behoudt mitochondriale netwerken, behoudt de integriteit van het mitochondriale membraan en maakt uiteindelijk meer fysiologisch relevante metingen mogelijk. Dit systeem maakt het ook mogelijk om brandstofvoorkeur en metabolische flexibiliteit te meten – dynamische aspecten van het spierenergiemetabolisme. Hier bieden we een uitgebreide gids voor mitochondriale OXPHOS-metingen in skeletspiervezels van mensen en muizen met behulp van een respirometer met hoge resolutie. Skeletspiergroepen zijn samengesteld uit verschillende vezelsoorten die variëren in hun mitochondriale brandstofvoorkeur en bio-energetica. Met behulp van een respirometer met hoge resolutie beschrijven we methoden voor het evalueren van zowel aërobe glycolytische als vetzuursubstraten om brandstofvoorkeur en metabole flexibiliteit op een vezeltype-afhankelijke manier te beoordelen. Het protocol is veelzijdig en toepasbaar op zowel menselijke als knaagdierspiervezels. Het doel is om de reproduceerbaarheid en nauwkeurigheid van mitochondriale functiebeoordelingen te verbeteren, wat ons begrip van een organel die belangrijk is voor de gezondheid van de spieren zal verbeteren.

Introduction

Mitochondriën zijn de hoeksteen van de cellulaire energieproductie, waardoor ze onmisbaar zijn voor het handhaven van een optimale cellulaire en organismale homeostase. Deze organellen met dubbele membranen zijn in de eerste plaats verantwoordelijk voor oxidatieve fosforylering. Dit proces zet voedingsstoffen, zoals suikers en vetzuren, efficiënt om in adenosinetrifosfaat (ATP), de cellulaire valuta voor energie. Naast hun rol in het energiemetabolisme zijn mitochondriën ook belangrijke regulatoren van verschillende cellulaire processen, waaronder apoptose, calciumhomeostase en reactieve zuurstofsoorten (ROS)1,2. Vanwege hun cruciale rol bij het handhaven van cellulaire en organismale homeostase, hebben verstoringen van de mitochondriale functie vaak nadelige effecten op de gezondheid van weefsels en organismen. In skeletspieren wordt mitochondriale disfunctie geassocieerd met tal van ziektetoestanden, waaronder stofwisselingsstoornissen (bijv. obesitas, diabetes en hart- en vaatziekten), sarcopenie en spierdystrofie 3,4,5,6,7,8.

Mitochondriale disfunctie kan zich voornamelijk manifesteren als veranderde mitochondriale inhoud, aantal en morfologie, evenals een verstoord metabolisme. Het bereiken van een alomvattend begrip van mitochondriale disfunctie vereist dus een integratieve en holistische benadering. Initiële karakteriseringsstudies omvatten het onderzoeken van expressieniveaus van respiratoire keteneiwitcomplexen als een uitlezing van mitochondriale inhoud, het kwantificeren van mitochondriaal DNA en markers van biogenese als een maat voor mitochondriale biogenese, en geavanceerde beeldvorming met elektronenmicroscopie om mitochondriale morfologie te beoordelen 9,10. Aanvullende beoordelingen van de mitochondriale functie omvatten het evalueren van cellulaire ROS- en ATP-productie en mitochondriaal membraanpotentieel9.

Omdat mitochondriën essentieel zijn voor de productie van cellulaire energie en homeostase, is het meten van mitochondriale oxidatieve fosforylering (OXPHOS) een kenmerk voor het beoordelen van de mitochondriale fosforylering. Respirometrie met hoge resolutie van gepermeabiliseerde spiervezels maakt het mogelijk om real-time veranderingen in het mitochondriale zuurstofverbruik te meten als een uitlezing voor de dynamische veranderingen in de activiteit van de mitochondriale OXPHOS-ademhalingsketen 9,11,12. De toepassing van selectieve chemische modulatoren en remmers maakt het mogelijk om de activiteit van verschillende ademhalingscomplexen direct en achtereenvolgens te meten. Hoewel geïsoleerde mitochondriën kunnen worden gebruikt in respirometrie, behoudt het gebruik van verse, gepermeabiliseerde spiervezels endogene mitochondriale netwerken en membraanintegriteit – waardoor meer fysiologisch relevante metingen mogelijk zijn. Bovendien, omdat verschillende soorten spiervezels verschillende substraatvoorkeuren en ademhalingssnelheden hebben, stelt dit systeem het mogelijk om veranderingen in brandstofvoorkeur en metabolische flexibiliteit te meten op basis van vezeltype13.

Hier beschrijven we een uitgebreid protocol voor mitochondriale OXPHOS-metingen met behulp van skeletspiervezels van mensen of muizen in een respirometersysteem met hoge resolutie. Inbegrepen zijn methoden om mitochondriale zuurstofademhaling in oxidatieve of glycolytische vezels te kwantificeren met behulp van pyruvaat of palmitoyl-carnitine als substraat. Dit protocol maakt het gebruik van andere brandstofsubstraten mogelijk om specifieke metabolische vragen aan te pakken met betrekking tot defecten in het gebruik van het substraat en de voorkeur van de splijtstof.

Protocol

Alle muizenprocedures werden goedgekeurd door het Institutional Animal Care and Use Committee van de Washington University. Muizen van elk geslacht, leeftijd en gewicht kunnen voor deze experimenten worden gebruikt en zijn afhankelijk van de aard van de experimentele vraag die men probeert te beantwoorden. De muizen die hier worden gebruikt zijn volwassen (12-16 weken oud), mannelijke wildtype C57BL/6 muizen. Alle menselijke procedures werden goedgekeurd door de Institutional Review Board van de Washington University. Proefpersonen hebben ingestemd met het gebruik van gegevens en representatieve gegevens van menselijke proefpersonen die in dit protocol zijn opgenomen, zijn afkomstig uit een gepubliceerde studie14. De gegevens hier zijn afkomstig van niet-diabetische postmenopauzale (55-75 jaar oud) vrouwen. Gegevens over de bereiding van de reagentia die nodig zijn voor de bepaling zijn opgenomen in tabel 1. Informatie over de specifieke reagentia, gereedschappen en machines die in de test worden gebruikt, staat vermeld in de Tabel met materialen. Een schematisch overzicht van het protocol is weergegeven in figuur 1. Figuur 1: Schema voor respirometrie met hoge resolutie op gepermeabiliseerde skeletspiermonsters. De methode die in dit manuscript wordt beschreven, is onderverdeeld in 6 secties: 1) voorbereiding van ademhalingsbuffers en reagentia, 2) voorbereiding van instrument en reagens op de dag van de analyse, 3) voorbereiding en permeabilisatie van spiermonsters, 4) voorbereiding van monster en instrument, 5) uitvoering van de ademhalingstest en 6) data-analyse. Gemaakt met BioRender.com Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken. 1. Analysevoorbereiding en kalibratie van het instrument Verwijder op de dag van de test het benodigde aantal aliquots van elke ademhalingsverbinding (blebbistatine, palmitoylcarnitine, glutamaat, malaat, ADP, succinaat, cytochroom C, FCCP) en ontdooi op ijs. Ontdooi flesjes BIOPS en MiR05 op ijs. Bereid saponine- en pyruvaatoplossingen zoals aangegeven in tabel 1. Bereid een werkende oplossing van MiR05 voor zoals in Tabel 1. Bereid 5 ml werkoplossing van MiR05 per instrument (2 kamers). Schaal op als dat nodig is. Schakel het respirometriesysteem met hoge resolutie en het vacuümsysteem in. Verwijder de stoppen, verwijder de 70% ethanol opslagoplossing door vacuüm en vul de kamer opnieuw met ultrapure moleculaire graad H2O. Verwijder H2O door vacuüm en vul opnieuw. Herhaal dit voor een totaal van 3 wasbeurten. Voeg na de laatste wasbeurt 2 ml MiR05 (zonder creatine of blebbistatine) toe aan elke kamer. Open de respirometriesoftware. Nadat de software is gestart, wordt een pop-upvenster geopend voor instrumentinstellingen. Stel de roersnelheid van de kamer in op 750 tpm, de temperatuur op 37 °C en het gegevensregistratie-interval op 2 s. Stel de versterking in op 1 en de polarisatiespanning op 800 mV voor de zuurstofsensoren. Klik op Verbinden met Oxygraph om communicatie met het instrument tot stand te brengen. Nadat de communicatie tot stand is gebracht, wordt een dialoogvenster geopend om het experimentele bestand een naam te geven en op te slaan. Sla het bestand op met de huidige datum en kalibratie. Nadat het bestand is opgeslagen, verschijnt er een pop-upvenster voor experimentele details. Er is geen informatie nodig voor de kalibratie en de doos kan worden gesloten. Registreer de zuurstofconcentratie gedurende ten minste 30 minuten om de kamers te laten opwarmen en om signalen voor luchtkalibratie op te nemen. Dit kan worden gedaan tijdens het voorbereiden van spiervezels, zoals beschreven in stap 2 hieronder. Markeer aan het einde van de kalibratieperiode een kalibratiegebied over het gebied waar de zuurstofconcentratie (blauwe lijn) stabiel is. Houd hiervoor de Shift-toets en de linkermuisknop ingedrukt en sleep over een gebied op de tijdlijn. Open het kalibratievenster door naar de Oxygraph > O2-kalibratie te gaan. Selecteer voor Luchtkalibratie de markering die in stap 1.8 is gegenereerd. Klik op Kalibreren en kopiëren naar klembord. Herhaal stap 1.6-1.8 voor de resterende kamer. Voer dagelijks luchtkalibratie uit. Stop de opname van de luchtkalibratie en sla het bestand op door de verbinding met het instrument te verbreken. Nadat de monsters klaar zijn, gaat u verder met stap 3 om de test uit te voeren. 2. Oogsten en permeabilisatie van skeletspiervezels Isolatie van muizenweefselVul voor elk te analyseren monster een putje van een kweekschaal met 12 putjes met 1 ml BIOPS. Leg het bord op ijs om af te koelen. Na het euthanaseren van de muis door inademing van kooldioxide gevolgd door cervicale dislocatie, oogst je de skeletspier van belang en zorg je ervoor dat je al het bindweefsel en vet verwijdert (Figuur 2A). Plaats de spier in een van de putjes met BIOPS. Leg ze op ijs tot de vezel zich voorbereidt.OPMERKING: Elke skeletspier kan worden onderzocht met behulp van dit protocol – het onderzochte spiertype is afhankelijk van de experimentele vraag die men probeert te beantwoorden. In het geval van skeletspieren met gemengde vezelsoorten, zoals de gastrocnemius, is het mogelijk om het weefsel te scheiden in witte en rode secties om overwegend snelle spiertrekkingen (witte secties) en overwegend langzame spiertrekkingen (rode secties) vezels te meten (Figuur 2B). Isolatie van menselijk weefselVerzamel weefsel volgens klinisch protocol14. Spoel het weefsel snel af met koude, steriele PBS en plaats het in een conische buis met 2 ml BIOPS-oplossing. Houd weefsel op ijs tot de vezelvoorbereiding. Vezel voorbereidingPermeabilisatie vindt plaats in een weefselkweekplaat met 6 putjes. Voeg 2 ml BIOPS-oplossing toe aan een set putjes en 2 ml MiR05 aan een andere set putjes. Voor elk monster dat wordt getest, is één set putjes nodig. Pak een dienblad met ijs in en zet een glazen petrischaaltje ondersteboven op het ijs. Zorg ervoor dat je de spier altijd op het ijs houdt. Breng de geoogste spiermonsters over naar het gekoelde petrischaalplatform met behulp van een pincet. Gebruik twee pincetten met fijne punt en een ontleedmicroscoop met een lichtbron om het weefsel voorzichtig schoon te maken door eventuele pezen, fascia en vetweefsel te verwijderen die aan de spier zijn bevestigd. Nadat al het externe niet-spierweefsel is verwijderd, trekt u de spiervezels voorzichtig uit elkaar met de pincet met fijne punt totdat het kleine bundels doorschijnende vezels zijn met een lengte van 0,75 – 1,0 mm (Figuur 2C-D). Nadat u de vezels hebt gescheiden, gebruikt u de pincet om de vezelbundels over te brengen naar een putje op de plaat met 6 putjes met BIOPS-oplossing op ijs. Voeg 20 μL van 5 mg/ml saponineoplossing toe aan elk BIOPS-putje en broed de plaat op ijs terwijl je zachtjes schommelt in een koude kamer gedurende 20 minuten. Breng na de saponinebehandeling de spiervezels over naar het putje met MiR05 om te spoelen vóór de test. Incubeer op ijs terwijl je zachtjes schommelt in een koude kamer gedurende 15 minuten. Nadat de vezelincubatie in MiR05 is voltooid, verzamelt u de vezels met een scherpe tang en dept u de spiervezels voorzichtig droog op een taakdoekje. Tarreer een plastic microcentrifugebuisje van 1,5 ml op een fijne balans en doe 2-3 mg vezels in het buisje. Noteer het uiteindelijke vezelgewicht aan de zijkant van elke buis. Plaats de buis op ijs. Herhaal dit met andere monsters. Ga direct door naar stap 3. Figuur 2: Scheiding van skeletspiervezels van muizen. (A) Grove morfologie van de gastrocnemius van muizen na de oogst. (B) Dissectie van gastrocnemius in rode (links) en witte (rechts) segmenten. (C) Mechanisch gescheiden spiervezels. (D) Een 10x beeld van succesvol gescheiden spiervezels. De schaalbalk is 1 mm. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken. 3. Voorbereiding van spiermonsters in de ademhalingsmeter Zuig de MiR05 die wordt gebruikt voor instrumentkalibratie uit zoals beschreven in stap 1 hierboven en voeg 2.1 ml werkende MiR05-oplossing toe aan elke kamer. Start een nieuw bestand voor het experiment met dezelfde instrumentinstellingen als beschreven in stap 1.5. boven. Stel de bestandsnaam in en sla de instellingen op. Na het instellen van de bestandsnaam, zal het volgende schermdialoogvenster voor specifieke experimentele details zijn. Voer de monsterinformatie en het gewicht van elk monster in dat aan elke kamer is toegevoegd. Sluit het dialoogvenster. Eenmaal in het nieuwe experimentele bestand, stelt u de kalibratie in door het O2-kalibratievenster te openen. Klik op Kopiëren uit bestand en selecteer het bestand dat is opgeslagen uit stap 1.9. boven. Klik op de knop Kalibreren en kopiëren naar klembord . Herhaal het proces voor de resterende kamer. Breng met een fijne tang de spiervezelbundels voorzichtig over in de ademhalingsoplossing voor de juiste kamer. Herhaal dit voor de resterende kamer. Plaats de stoppers op de kamer en sluit de kamer voorzichtig half af door de stoppers ongeveer halverwege naar de bodem te duwen. Zodra de o-ringen op de stoppers in de kamerwand grijpen en er weerstand is, gebruikt u een draaiende beweging terwijl u naar beneden duwt om te sluiten. Wanneer de kamer half gesloten is, is er een kleine luchtbel waar te nemen aan de bovenkant van de kamer.OPMERKING: Gepermeabiliseerde vezels zijn onderhevig aan zuurstofdiffusiebeperkingen onder normale ademhalingsomstandigheden. Om deze beperking te omzeilen, wordt de test uitgevoerd onder verhoogde zuurstofconcentraties11. Vul een plastic spuit van 10 ml met zuivere zuurstof uit een zuurstoftank. Plaats de lange, stompe naald die bij het instrument is geleverd op de spuit. Plaats de naald in de eerste kamer en breng langzaam ongeveer 1 ml zuurstof in de kamer. Bewaak de zuurstofconcentratie in de kamer in de respirometriesoftware. Wanneer de zuurstofconcentratie van de kamer 350-400 nmol/ml bereikt, draait u de stop voorzichtig terwijl u deze naar beneden duwt om de kamer volledig te sluiten. Kijk in de kamer en zorg ervoor dat er geen luchtbellen achterblijven. Als er een luchtbel aanwezig is, open dan voorzichtig en snel de kamer opnieuw, voeg 100 μL extra werkende MiR05-oplossing toe en sluit de kamer snel weer. Herhaal dit met de overige kamers. De zuurstofconcentraties moeten tijdens de test boven de 250 nmol/ml worden gehouden. Voeg indien nodig extra zuurstof toe door de kamer gedeeltelijk te openen, meer zuurstof uit de spuit in de luchtbel toe te voegen en de kamer voorzichtig weer te sluiten. Normaliseer de gegevens van de zuurstofflux naar de weefselmassa die voor het experiment is gebruikt. Als u de grafieken wilt aanpassen, wijzigt u de lay-out om O2 Flux weer te geven (pmol O2 / (s x mg)). Selecteer in het lay-outmenu de lay-out 06 – Specifieke flux per eenheidsvoorbeeld. De gegevens worden nu genormaliseerd gepresenteerd op basis van de hoeveelheid weefsel in elke kamer. 4. Respirometrie met hoge resolutie Wanneer de zuurstofconcentratie (blauwe lijn) en de O2-flux (rode lijn) zijn gestabiliseerd na zuurstoftoevoeging, begint u met het ademhalingsprotocol. Zuurstof kan als stabiel worden beschouwd wanneer de blauwe lijn vlak is of langzaam afneemt. O2 flux moet ook vlak zijn en binnen 5 pmol O2 / s x mg. Voeg alle reagentia toe met behulp van glazen spuiten. Het is belangrijk om niet dezelfde spuit te gebruiken voor substraten, remmers en ontkoppelingen. Zorg voor een aparte spuit voor elk. Na het toevoegen van elke verbinding, registreert u de zuurstofflux gedurende 1-2 minuten nadat de ademhalingsfrequentie is gestabiliseerd voordat u het volgende reagens toevoegt. Meting van de ademhalingVoeg met een glazen spuit van 10 μl 2,5 μl 0,8 M malaat toe aan elke kamer. Druk op F4 om de tijdlijn te markeren en label de markering met M. Neem een stabiele O2-flux op gedurende 1-2 minuten. Voeg voedingsstofspecifieke reagentia toe zoals hieronder beschreven.Aërobe glycolytiek: Voeg met een glazen spuit van 10 μl 10 μl 2 M glutamaat en 5 μL 2 M pyruvaat toe aan elke kamer. Druk op F4 om de tijdlijn te markeren en label de markering met G P. Neem een stabiele O2 flux op gedurende 1-2 minuten. Vetzuur: Voeg met een glazen spuit van 10 μl 10 μl 2 M glutamaat en 10 μL 10 ml palmitoyl-carnitine toe aan elke kamer. Druk op F4 om de tijdlijn te markeren en label de markering met G PC. Registreer een stabiele O2-flux gedurende 1-2 minuten. Voeg met een glazen spuit van 25 μl 20 μl ADP van 0,5 M (met MgCl2) toe aan elke kamer. Druk op F4 om de tijdlijn te markeren en label de markering met ADP. Registreer een stabiele O2-flux gedurende 1-2 minuten. Voeg met een glazen spuit van 25 μl 20 μl 1 M-succinaat toe aan elke kamer. Druk op F4 om de tijdlijn te markeren en label de markering met S. Neem een stabiele O2-flux op gedurende 1-2 minuten. Voeg met een glazen spuit van 10 μl 5 μl 4 mM cytochroom C toe aan elke kamer. Druk op F4 om de tijdlijn te markeren en label de markering met Cyt C. Neem een stabiele O2-2 flux op gedurende 1-2 minuten. Titreer in drie bolussen van 1 μl van 1 mM FCCP met behulp van een glazen spuit van 10 μl. Er is over het algemeen een mengeffect bij het toevoegen van FCCP dat resulteert in een korte afname van deO2-fluxniveaus . Wacht tot de O2-flux is toegenomen en gestabiliseerd voordat u doorgaat naar de volgende stap. Druk na elke toevoeging op F4 om de tijdlijn te markeren en markeer de markering met FCCP. Registreer een stabiele O2-flux gedurende 1 minuut na elke toevoeging. Wanneer de ademhalingstest is voltooid, verwijdert u de stoppers voorzichtig door ze naar boven te draaien en te trekken. Spoel de kamers 3x met ultrapure H2O uit een spuitfles, gevolgd door 3x met 70% ethanol uit een spuitfles. Na de laatste ethanolspoeling vult u de kamers met 70% ethanol voor opslag. Plaats de stoppers in de kamers totdat u weerstand voelt. Sluit de stoppers niet helemaal. Plaats doppen over de stoppers, sla het testbestand op en koppel het instrument los van de respirometriesoftware. Schakel het instrument uit. 5. Gegevensanalyse Open het analysebestand in de respirometriesoftware. Extraheer gegevens uit stabiele zuurstoffluxregio’s die zijn verkregen na injectie van ademhalingsverbindingen. Om interessante gebieden te markeren, houdt u de Shift-toets ingedrukt, klikt u met de linkermuisknop en sleept u het vak over het stabiele O 2-fluxsnelheidsgebied voor de hieronder beschreven analysefasen. Analyse stadia 14,15,16,17,18,19,20Markeer de tijdlijn na de toevoeging van malaat/glutamaat/pyruvaat (aeroob glycolytisch protocol) of malaat/glutamaat/palmitoyl-carnitine (vetzuurprotocol). Deze snelheid vertegenwoordigt de ademhalingsfrequentie van Complex I State 2 (LEAK(n)). Markeer de tijdlijn na de toevoeging van ADP. Deze snelheid vertegenwoordigt de ademhalingsfrequentie van Complex I State 3 (CI OXPHOS). Markeer de tijdlijn na toevoeging van succinaat. Deze snelheid vertegenwoordigt de ademhalingsfrequentie van Complex I+II State 3 (CI+II OXPHOS). Markeer de tijdlijn na het toevoegen van Cytochroom C. Deze snelheid vertegenwoordigt de ademhalingsfrequentie van Complex I + II + Cytochrome State 3 (CI + II + Cyt C OXPHOS). Markeer de tijdlijn voor de FCCP-titratie met de hoogsteO2-fluxsnelheid . Deze snelheid vertegenwoordigt de maximale ademhalingsfrequentie (MAX ETS). Haal de gegevenswaarden op voor de gemarkeerde gebieden op de tijdlijn door Markeren > Statistieken te selecteren. Kopieer de O2 Flux rate (pmol O2/(s x mg)) voor de gemarkeerde kamer naar een spreadsheet. Herhaal de markering en gegevensextractie voor de extra kamers. Bereken de respiratoire controleratio (RCR) door Complex I+II Toestand 3 (na toevoeging van succinaat) te delen door Complex I Toestand 2 (vóór ADP-toevoeging).

Representative Results

Figuur 3 en Figuur 4 tonen zuurstofgrafieken van respectievelijk aërobe glycolytische en vetzuurrespirometrieprotocollen voor goed bereide rode en witte gastrocnemius-spiervezels van muizen. Ook worden representatieve gekwantificeerde resultaten ter referentie getoond. Figuur 5 toont een zuurstofplot van aërobe glycolytische respirometrie in menselijke spierbiopsiemonsters die op de juiste manier zijn voorbereid. Er worden ook representatieve gekwantificeerde resultaten getoond. Merk op dat voor Figuur 3, Figuur 4 en Figuur 5 toevoeging van Cytochroom C na ADP-additie geen invloed heeft op de zuurstofflux, wat aangeeft dat het buitenste mitochondriale membraan van het monster intact is. Figuur 6 toont een zuurstofgrafiek van aërobe glycolytische respirometrie waarbij de toevoeging van cytochroom C na ADP resulteert in een piek (40% toename) in de zuurstofflux, wat aangeeft dat het buitenste mitochondriale membraan is beschadigd en dat het monster dus niet voor respirometrie mag worden gebruikt – mogelijke redenen voor dit resultaat kunnen onjuiste behandeling of bevriezing/ontdooiing van het weefsel zijn, verleng de permeabilisatie van het weefsel en gebruik geen vers geïsoleerd weefsel. Figuur 3: Zuurstofverbruik bij muizen. De resultaten tonen het zuurstofverbruik in (A) rode en (B) witte gastrocnemius met behulp van het pyruvaatprotocol. Toestand 2 flux na toevoeging van malaat, glutamaat en pyruvaat (blauwe tint, CI LEAK). Significante stimulatie van deO2-consumptie wordt waargenomen na toediening van ADP (groene tint, CI OXPHOS), waarbij de ademhaling verder wordt gestimuleerd na toevoeging van succinaat (paarse tint, CI+II OXPHOS). Cytochroom C veroorzaakte geen significante toename (<15%), wat aangeeft dat het buitenste mitochondriale membraan intact is (oranje tint, CI+II+Cyt C OXPHOS). Mitochondriën worden ontkoppeld na toevoeging van FCCP (gele tint, MAX ETS). De blauwe lijn geeft de zuurstofconcentratie in een gesloten kamer weer. De rode lijn geeft de snelheid van het zuurstofverbruik (O2 flux) weer. Verbindingen toegevoegd: Malaat (m), Glutamaat (g), Pyruvaat (p), Adenosinedifosfaat (ADP), Cytochroom C (cyt c), Carbonylcyanide-p-trifluormethoxyfenylhydrazon (FCCP). (C) Het staafdiagram geeft representatieve resultaten weer (n=8). De gegevens worden weergegeven als ± SEM. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken. Figuur 4: Zuurstofverbruik bij muizen. De resultaten tonen het zuurstofverbruik in (A) rode en (B) witte gastrocnemius met behulp van het palmitoyl-carnitine-protocol. Toestand 2 flux na toevoeging van malaat, glutamaat en palmitoylcarnitine (blauwe tint, CI LEAK). Significante stimulatie van deO2-consumptie wordt waargenomen na toediening van ADP (groene tint, CI OXPHOS), waarbij de ademhaling verder wordt gestimuleerd na toevoeging van succinaat (paarse tint, CI+II OXPHOS). Cytochroom C veroorzaakte geen significante toename (<15%), wat aangeeft dat het buitenste mitochondriale membraan intact is (oranje tint, CI+II+Cyt C OXPHOS). Mitochondriën worden ontkoppeld na toevoeging van FCCP (gele tint, MAX ETS). De blauwe lijn geeft de zuurstofconcentratie in een gesloten kamer weer. De rode lijn geeft de snelheid van het zuurstofverbruik (O2 flux) weer. Verbindingen toegevoegd: Malaat (m), Glutamaat (g), Palmitoylcarnitine (pc), Adenosinedifosfaat (ADP), Cytochroom C (cyt c), Carbonylcyanide-p-trifluormethoxyfenylhydrazon (FCCP). (C) Het staafdiagram geeft representatieve resultaten weer (n=7). De gegevens worden weergegeven als ± SEM. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken. Figuur 5: Representatieve resultaten voor zuurstofverbruik in humane vastus lateralis met behulp van het pyruvaatprotocol. (A) Toestand 2 flux na toevoeging van malaat, glutamaat en pyruvaat (blauwe tint, CI LEAK). Significante stimulatie van deO2-consumptie wordt waargenomen na toediening van ADP (groene tint, CI OXPHOS), waarbij de ademhaling verder wordt gestimuleerd na toevoeging van succinaat (paarse tint, CI+II OXPHOS). Cytochroom C veroorzaakte geen significante toename (<15%), wat aangeeft dat het buitenste mitochondriale membraan intact is (oranje tint, CI+II+Cyt C OXPHOS). Mitochondriën worden ontkoppeld na toevoeging van FCCP (gele tint, MAX ETS). De blauwe lijn geeft de zuurstofconcentratie in een gesloten kamer weer. De rode lijn geeft de snelheid van het zuurstofverbruik (O2 flux) weer. Verbindingen toegevoegd: Malaat (m), Glutamaat (g), Pyruvaat (p), Adenosinedifosfaat (ADP), Cytochroom C (cyt c), Carbonylcyanide-p-trifluormethoxyfenylhydrazon (FCCP). (B) Het staafdiagram geeft representatieve resultaten weer die zijn verkregen uit vastus lateralis-biopsieën (n = 24). De gegevens worden weergegeven als ± SEM. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken. Figuur 6: Representatief resultaat dat een aangetaste integriteit van het buitenste mitochondriale membraan aantoont in rode gastrocnemius van muizen. Toestand 2 flux na toevoeging van malaat, glutamaat en pyruvaat (blauwe tint, CI LEAK). Significante stimulatie van deO2-consumptie wordt waargenomen na toediening van ADP (groene tint, CI OXPHOS), waarbij de ademhaling verder wordt gestimuleerd na toevoeging van succinaat (paarse tint, CI+II OXPHOS). Cytochroom C veroorzaakte een significante toename van hetO2-verbruik (>15%), wat wijst op schade aan het buitenste mitochondriale membraan. De blauwe lijn geeft de zuurstofconcentratie in een gesloten kamer weer. De rode lijn geeft de snelheid van het zuurstofverbruik (O2 flux) weer. Verbindingen toegevoegd: Malaat (m), Glutamaat (g), Pyruvaat (p), Adenosinedifosfaat (ADP), Cytochroom C (cyt c), Carbonylcyanide-p-trifluormethoxyfenylhydrazon (FCCP). Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken. Tabel 1: Reagensbereiding van ademhalingsverbindingen en ademhalingsoplossingen. Er worden gegevens verstrekt voor de bereiding van de reagentia die nodig zijn voor de analyse, met inbegrip van de uiteindelijke voorraadconcentraties en de wijze waarop deze moeten worden bereid en opgeslagen. Klik hier om deze tabel te downloaden.

Discussion

Dit protocol biedt een uitgebreid en eenvoudig sjabloonprotocol voor het beoordelen van de mitochondriale functie in gepermeabiliseerde skeletspiervezels voor zowel menselijke als muismonsters. Er zijn verschillende voordelen aan het gebruik van permeabiliseerde vezels in plaats van geïsoleerde mitochondriën. Een belangrijk voordeel is dat het gebruik van gepermeabiliseerde vezels kleine (2-5 mg) hoeveelheden weefsel vereist, waardoor deze methode geschikt is voor zowel menselijke spierbiopsiemonsters als muizenspieren. Een ander voordeel ten opzichte van geïsoleerde mitochondriën is dat de cellulaire architectuur intact blijft, waardoor het behoud van structurele en functionele interacties tussen mitochondriën en cellulaire componenten wordt gewaarborgd 12,21,22,23.

Het gebruik van pyruvaat, malaat en glutamaat in ons aerobe glycolytische protocol biedt een uitgebreide, breedspectrumevaluatie van de NADH-toevoer naar Complex I 24,25,26,27,28. Hoewel deze alomvattende benadering een beoordeling biedt van de activiteit van Complex I onder holistische en fysiologisch relevante metabole omstandigheden, kan het gebruik van pyruvaatmalaat of glutamaatmalaat een geschiktere experimentele benadering zijn. Het gebruik van glutamaat-malaat kan bijvoorbeeld verschillen in mitochondriale functie die verband houden met aminozuurkatabolismeaan het licht brengen. We moedigen onderzoekers aan om zorgvuldig na te denken over de juiste aanpak voor hun specifieke onderzoeksmodel.

Hoewel dit protocol zich richt op het gebruik van substraten om mitochondriale activiteit te beoordelen, kan het gebruik van specifieke remmers nodig zijn om experimentele doelen te bereiken. Rotenon kan bijvoorbeeld worden gebruikt om Complex I 12,21,30 te remmen, oligomycine dat wordt gebruikt om Complex V (ATP-synthase)12,21 te remmen en antimycine A om Complex III12,21 te blokkeren voor beoordeling van niet-mitochondriale ademhaling. Het bovenstaande protocol kan eenvoudig worden aangepast om het gebruik van specifieke remmers op te nemen. Van belang is dat een voorbehoud met betrekking tot het gebruik van remmers is dat deze verbindingen plakkerig zijn en uitgebreid moeten worden gereinigd om uit de instrumentenkamer te verwijderen. We vinden het gebruik van een oplossing van 10% BSA gedurende 60 minuten voldoende voor het verwijderen van resterende remmers.

LEAK-ademhaling verwijst naar het zuurstofverbruik dat onafhankelijk is van de ATP-synthese. Deze snelheid vertegenwoordigt de stroom van protonen terug in de mitochondriale matrix vanuit het binnenste mitochondriale membraan. Er zijn drie geaccepteerde methoden om het zuurstofverbruik te beoordelen, onafhankelijk van ATP-synthese (LEAK). De eerste, LEAK(n), meet het zuurstofverbruik in aanwezigheid van substraten, maar zonder toevoeging van adenylaten (ADP of ATP)31,32,33. Deze LEAK-toestand vertegenwoordigt de intrinsieke lekheid van het mitochondriale membraan. De tweede methode, LEAK(t), wordt gemeten in aanwezigheid van ATP34 en de derde, LEAK(o), wordt gemeten in aanwezigheid van de ATP-synthaseremmer oligomycine 35,36,37. Dit protocol gebruikt LEAK(n) voor deze beoordeling, maar afhankelijk van experimentele doelen en modellen kunnen andere methoden voor het meten van de LEAK-zuurstofflux geschikt zijn.

Voor deze test wordt MiR05 aangevuld met zowel creatine (3 mg/ml) als blebbistatine (10 μM). Mitochondriaal ADP-transport wordt vergemakkelijkt door creatinekinase (CK) en creatine wordt toegevoegd aan de ademhalingsoplossing om de CK-activiteit te verzadigen38,39. Spiervezels kunnen spontaan samentrekken en zijn ook gevoelig voor door ADP geïnduceerde contractie. Om de mitochondriale ademhalingsactiviteit te beoordelen zonder de invloed van samentrekking, is blebbistatine toegevoegd om de contractiele activiteit van vezels te remmen38. Bovendien suggereren studies op menselijke spieren dat de ademhalingscapaciteit kan worden beïnvloed door de biopsiemethode (microbiopsie versus Bergstrom-naald) en dat dit verschil te wijten kan zijn aan verschillen in de verkregen vezellengte40,41. Kortere vezels kunnen tijdens de bereiding vatbaarder zijn voor beschadiging en het gebruik van blebbistatine helpt de functie te behouden. Er kunnen bepaalde aandoeningen zijn waarbij vezelontspanning niet past bij onderzoeksdoelstellingen, en in dat geval kan blebbistatine worden uitgesloten van de MiR05-oplossing.

Permeabilisatie van de skeletspiervezels met saponine genereert poriën in het plasmamembraan, waardoor substraten en remmers vrij de cel kunnen binnendringen. Saponine heeft een hoge affiniteit voor cholesterol, dat rijk en overvloedig is in cellulaire plasmamembranen, terwijl mitochondriale membranen cholesterolarm zijn42,43. Verwacht wordt dat de saponinebehandeling die in dit protocol wordt gebruikt voor vezelbereiding, de integriteit van het mitochondriale membraan zal behouden. Schade aan mitochondriën kan ook optreden als gevolg van schuifkrachten die het gevolg zijn van de mechanische scheiding van het weefsel in vezels. We stellen voor dat de scheiding van weefsel in vezelbundels snel en met minimale handelingen wordt uitgevoerd. Om mogelijke mitochondriale schade te beoordelen, hebben we titratie van cytochroom C opgenomen in het ademhalingsprotocol. Cytochroom C kan niet door een intact buitenste mitochondriaal membraan12 gaan, daarom geeft elke toename van de O2-flux na toevoeging van cytochroom C aan dat er schade aan het buitenste mitochondriale membraan is opgetreden tijdens het monstervoorbereidingsproces. In een van onze recente onderzoeken ontdekten we dat deO2-flux met 8%15 toenam na toevoeging van cytochroom C, wat bevestigt dat het gebruik van saponine dat in dit protocol wordt voorgesteld, geen mitochondriale schade veroorzaakt. We stellen voor dat elk monster dat een toename van meer dan 15% inO2-flux vertoont nadat cytochroom C is toegevoegd, moet worden uitgesloten van analyse44. Deze stap is strikt opgenomen als een kwaliteitscontrolemaatregel en niet als een beoordeling van de activiteit van Complex IV.

Hoewel respirometrie met hoge resolutie uitblinkt in het leveren van zeer gevoelige en betrouwbare metingen van het zuurstofverbruik, is een opmerkelijke beperking van de instrumentatie dat slechts twee monsters tegelijkertijd per instrument kunnen worden gemeten. Dit vereist een zorgvuldige afweging bij het ontwerpen van studies met cohorten met meerdere steekproeven. Hoewel de verleiding groot kan zijn om gedurende de dag metingen uit te voeren op verschillende monstersets, raden we onderzoekers ten zeerste aan om de invloed van het circadiane ritme op het metabolisme in overweging te nemen. Onderzoek naar skeletspieren van zowel mensen als knaagdieren heeft aangetoond dat de biologische klok invloed heeft op de mitochondriale functie45,46. Daarom raden we aan om metingen over meerdere dagen op hetzelfde tijdstip van de dag uit te voeren om rekening te houden met deze circadiane fluctuaties.

Om reproduceerbare en robuuste respirometriemetingen te garanderen, moet de ademhalingsmeter ten slotte regelmatig worden gereinigd, onderhouden en gekalibreerd. Luchtkalibratie, zoals beschreven in het protocol, moet dagelijks worden uitgevoerd. We raden gebruikers aan om ook een volledige maandelijkse kalibratie (zowel lucht als nul) van de polarografische zuurstofsensoren uit te voeren. Gebruikers dienen de documentatie en website van de fabrikant te raadplegen voor meer informatie over deze kalibratiemethode en voor instructies over routinematig onderhoud van instrumenten.

Respirometrie met hoge resolutie blijft de gouden standaard voor het meten van mitochondriale ademhaling. De methode die in dit protocol wordt beschreven, maakt een robuuste beoordeling van de mitochondriale capaciteit in zowel knaagdieren als menselijke skeletspieren mogelijk. Dit protocol is toegepast op onderzoeken ter evaluatie van de mitochondriale functie geassocieerd met genetische muismodellen15,16, in de context van chronische nierziekte19, na toediening van voedingssupplementen14,20 en lichaamsbeweging17,18.

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Onderzoek dat in deze publicatie wordt gerapporteerd, werd ondersteund door het Nutrition Obesity Research Center, NIH-subsidie P30 DK056341 en NIH-subsidie K01 HL145326.

Materials

10 µL Hamilton Syringe (glass syringe) ThermoFisher 14-813-125 For respiration assay titration
25 µL Hamilton Syringe (glass syringe) ThermoFisher 14-813-133 For respiration assay titration
ADP Merck 117105 Respirometry Assay
Black Glass Dissection Dish Scintica DD-90-S-BLK For sample preparation
Blebbistatin Sigma B0560 Working MiR05 Solution
BSA, fatty acid free Sigma A6003 MiR05 Solution
Calcium Carbonate Sigma C4830 BIOPS Solution
Creatine Sigma 27900 Working MiR05 Solution
Cytochrome C Sigma C7752 Respirometry Assay
DatLab Oroboros Instruments N/A Respirometry Software
Dithiothreitol (DTT)  Sigma D0632 BIOPS Solution
D-Sucrose Sigma 84097 MiR05 Solution
EGTA Sigma E4378 BIOPS & MiR05 Solution
FCCP Sigma C2920 Respirometry Assay
Glutamate Sigma G1626 Respirometry Assay
HEPES Sigma H7523 MiR05 Solution
Imidazole  Sigma 56750 BIOPS Solution
KH2PO4  Sigma P5379 MiR05 Solution
Lactobionic acid Sigma 153516 MiR05 Solution
Malate Sigma M1000 Respirometry Assay
MES hydrate  Sigma M8250 BIOPS Solution
MgCl2 – 6 H2O  Sigma M2670 BIOPS & MiR05 Solution
Oroboros Oxygraph-2K (O2K) System Oroboros Instruments 10203-03 High resolution respirometer
Palmitoyl-Carnitine Sigma P4509 Respirometry Assay
Potassium Hydroxide Sigma P1767 BIOPS Solution
Precision Tweezers Fisher 17-467-168 For sample preparation
Saponin Sigma S2149 For Fiber Permeabilization
Sodium ATP Sigma A2383 BIOPS Solution
Sodium Phosphocreatine Sigma P7936 BIOPS Solution
Sodium Pyruvate Sigma P2256 Respirometry Assay
Succinate Sigma S2378 Respirometry Assay
Taurine  Sigma T0625 BIOPS & MiR05 Solution
DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Rizzuto, R., De Stefani, D., Raffaello, A., Mammucari, C. Mitochondria as sensors and regulators of calcium signalling. Nat Rev Mol Cell Biol. 13 (9), 566-578 (2012).
  2. Ruegsegger, G. N., Creo, A. L., Cortes, T. M., Dasari, S., Nair, K. S. Altered mitochondrial function in insulin-deficient and insulin-resistant states. J Clin Invest. 128 (9), 3671-3681 (2018).
  3. Simoneau, J. A., Kelley, D. E. Altered glycolytic and oxidative capacities of skeletal muscle contribute to insulin resistance in NIDDM. J Appl Physiol. 83 (1), 166-171 (1997).
  4. Ryan, T. E., et al. Extensive skeletal muscle cell mitochondriopathy distinguishes critical limb ischemia patients from claudicants. JCI Insight. 3 (21), 123235 (2018).
  5. Sullivan, M. J., Green, H. J., Cobb, F. R. Skeletal muscle biochemistry and histology in ambulatory patients with long-term heart failure. Circulation. 81 (2), 518-527 (1990).
  6. Giebelstein, J., et al. The proteomic signature of insulin-resistant human skeletal muscle reveals increased glycolytic and decreased mitochondrial enzymes. Diabetologia. 55 (4), 1114-1127 (2012).
  7. Tezze, C., et al. Age-associated loss of OPA1 in muscle impacts muscle mass, metabolic homeostasis, systemic inflammation, and epithelial senescence. Cell Metab. 25 (6), 1374-1389 (2017).
  8. Hughes, M. C., et al. Early myopathy in Duchenne muscular dystrophy is associated with elevated mitochondrial H(2) O(2) emission during impaired oxidative phosphorylation. J Cachexia Sarcopenia Muscle. 10 (2), 643-661 (2019).
  9. Yin, Y., Shen, H. Common methods in mitochondrial research (Review). Int J Mol Med. 50 (4), 5182 (2022).
  10. Vue, Z., et al. 3D reconstruction of murine mitochondria reveals changes in structure during aging linked to the MICOS complex. Aging Cell. 22 (12), e14009 (2023).
  11. Doerrier, C., et al. High-resolution fluoRespirometry and OXPHOS protocols for human cells, permeabilized fibers from small biopsies of muscle, and isolated mitochondria. Methods Mol Biol. 1782, 31-70 (2018).
  12. Pesta, D., Gnaiger, E. High-resolution respirometry: OXPHOS protocols for human cells and permeabilized fibers from small biopsies of human muscle. Methods Mol Biol. 810, 25-58 (2012).
  13. Picard, M., Hepple, R. T., Burelle, Y. Mitochondrial functional specialization in glycolytic and oxidative muscle fibers: tailoring the organelle for optimal function. Am J Physiol Cell Physiol. 302 (4), C629-C641 (2012).
  14. Yoshino, M., et al. Nicotinamide mononucleotide increases muscle insulin sensitivity in prediabetic women. Science. 372 (6547), 1224-1229 (2021).
  15. Mousa, M. G., et al. Site-1 protease inhibits mitochondrial respiration by controlling the TGF-beta target gene Mss51. Cell Rep. 42 (4), 112336 (2023).
  16. Moon, S. H., et al. Genetic deletion of skeletal muscle iPLA(2)gamma results in mitochondrial dysfunction, muscle atrophy and alterations in whole-body energy metabolism. iScience. 26 (6), 106895 (2023).
  17. Bittel, A. J., et al. A single bout of premeal resistance exercise improves postprandial glucose metabolism in obese men with prediabetes. Med Sci Sports Exerc. 53 (4), 694-703 (2021).
  18. Bittel, A. J., et al. A single bout of resistance exercise improves postprandial lipid metabolism in overweight/obese men with prediabetes. Diabetologia. 63 (3), 611-623 (2020).
  19. Bittel, D. C., Bittel, A. J., Varadhachary, A. S., Pietka, T., Sinacore, D. R. Deficits in the skeletal muscle transcriptome and mitochondrial coupling in progressive diabetes-induced CKD relate to functional decline. Diabetes. 70 (5), 1130-1144 (2021).
  20. Mills, K. F., et al. Long-term administration of nicotinamide mononucleotide mitigates age-associated physiological decline in mice. Cell Metab. 24 (6), 795-806 (2016).
  21. Djafarzadeh, S., Jakob, S. M. High-resolution respirometry to assess mitochondrial function in permeabilized and intact cells. J Vis Exp. (120), e54985 (2017).
  22. Lemieux, H., Semsroth, S., Antretter, H., Hofer, D., Gnaiger, E. Mitochondrial respiratory control and early defects of oxidative phosphorylation in the failing human heart. Int J Biochem Cell Biol. 43 (12), 1729-1738 (2011).
  23. Gnaiger, E. Capacity of oxidative phosphorylation in human skeletal muscle: new perspectives of mitochondrial physiology. Int J Biochem Cell Biol. 41 (10), 1837-1845 (2009).
  24. Appelman, B., et al. Muscle abnormalities worsen after post-exertional malaise in long COVID. Nat Commun. 15 (1), 17 (2024).
  25. O’Rourke, A. R., et al. Impaired muscle relaxation and mitochondrial fission associated with genetic ablation of cytoplasmic actin isoforms. FEBS J. 285 (3), 481-500 (2018).
  26. Inigo, M. R., et al. Estrogen receptor-alpha in female skeletal muscle is not required for regulation of muscle insulin sensitivity and mitochondrial regulation. Mol Metab. 34, 1-15 (2020).
  27. Musci, R. V., et al. Phytochemical compound PB125 attenuates skeletal muscle mitochondrial dysfunction and impaired proteostasis in a model of musculoskeletal decline. J Physiol. 601 (11), 2189-2216 (2023).
  28. Englund, D. A., et al. p21 induces a senescence program and skeletal muscle dysfunction. Mol Metab. 67, 101652 (2023).
  29. Zhang, K., et al. Mitochondrial supercomplex assembly regulates metabolic features and glutamine dependency in mammalian cells. Theranostics. 13 (10), 3165-3187 (2023).
  30. Davis, M. S., Barrett, M. R. High-resolution fluoro-respirometry of equine skeletal muscle. J Vis Exp. (192), e65075 (2023).
  31. Schytz, C. T., et al. Skeletal muscle mitochondria demonstrate similar respiration per cristae surface area independent of training status and sex in healthy humans. J Physiol. 602 (1), 129-151 (2024).
  32. Hingst, J. R., et al. Inducible deletion of skeletal muscle AMPKalpha reveals that AMPK is required for nucleotide balance but dispensable for muscle glucose uptake and fat oxidation during exercise. Mol Metab. 40, 101028 (2020).
  33. Krumschnabel, G., Eigentler, A., Fasching, M., Gnaiger, E. Use of safranin for the assessment of mitochondrial membrane potential by high-resolution respirometry and fluorometry. Methods Enzymol. 542, 163-181 (2014).
  34. Gnaiger, E., Mendez, G., Hand, S. C. High phosphorylation efficiency and depression of uncoupled respiration in mitochondria under hypoxia. Proc Natl Acad Sci U S A. 97 (20), 11080-11085 (2000).
  35. Basse, A. L., et al. Nampt controls skeletal muscle development by maintaining Ca(2+) homeostasis and mitochondrial integrity. Mol Metab. 53, 101271 (2021).
  36. Flensted-Jensen, M., et al. Combined changes in temperature and pH mimicking exercise result in decreased efficiency in muscle mitochondria. J Appl Physiol. 136 (1985), 79-88 (2024).
  37. Porter, C., et al. Mitochondrial respiratory capacity and coupling control decline with age in human skeletal muscle. Am J Physiol Endocrinol Metab. 309 (3), E224-E232 (2015).
  38. Perry, C. G., et al. Inhibiting myosin-ATPase reveals a dynamic range of mitochondrial respiratory control in skeletal muscle. Biochem J. 437 (2), 215-222 (2011).
  39. Veksler, V. I., et al. Muscle creatine kinase-deficient mice. II. Cardiac and skeletal muscles exhibit tissue-specific adaptation of the mitochondrial function. J Biol Chem. 270 (34), 19921-19929 (1995).
  40. Isner-Horobeti, M. E., et al. Microbiopsies versus Bergstrom needle for skeletal muscle sampling: impact on maximal mitochondrial respiration rate. Eur J Appl Physiol. 114 (5), 885-889 (2014).
  41. Hughes, M. C., et al. Mitochondrial bioenergetics and fiber type assessments in microbiopsy vs. Bergstrom percutaneous sampling of human skeletal muscle. Front Physiol. 18 (6), 360 (2015).
  42. Kuznetsov, A. V., et al. Analysis of mitochondrial function in situ in permeabilized muscle fibers, tissues and cells. Nat Protoc. 3 (6), 965-976 (2008).
  43. Elustondo, P., Martin, L. A., Karten, B. Mitochondrial cholesterol import. Biochim Biophys Acta Mol Cell Biol Lipids. 1862 (1), 90-101 (2017).
  44. Ramos, P. M., Li, C., Elzo, M. A., Wohlgemuth, S. E., Scheffler, T. L. Mitochondrial oxygen consumption in early postmortem permeabilized skeletal muscle fibers is influenced by cattle breed. J Anim Sci. 98 (3), 044 (2020).
  45. van Moorsel, D., et al. Demonstration of a day-night rhythm in human skeletal muscle oxidative capacity. Mol Metab. 5 (8), 635-645 (2016).
  46. de Goede, P., et al. Time-restricted feeding during the inactive phase abolishes the daily rhythm in mitochondrial respiration in rat skeletal muscle. FASEB J. 36 (2), e22133 (2022).

Tags

Biologymetabolismskeletal muscle fibersmitochondriaoxygen consumptionmousehumanmethodologyrespirometry
This article has been published
Video Coming Soon
Keep me updated:

.

PDF
DOI
DOWNLOAD MATERIALS LIST
Cite This Article
Pietka, T. A., Brookheart, R. T. Measurement of Mitochondrial Respiration in Human and Mouse Skeletal Muscle Fibers by High-Resolution Respirometry. J. Vis. Exp. (212), e66834, doi:10.3791/66834 (2024).
Download Citation
Reprints and Permissions

View Video

✖

To prove you're not a robot, please enter the text in the image below

CAPTCHA Image
Play CAPTCHA Audio
Refresh Image