Summary

Хирургическая поясничная симпатэктомия у мышей

Published: July 05, 2024
doi:

Summary

В данной рукописи представлен протокол хирургического удаления постганглионарных поясничных симпатических нейронов у мыши. Эта процедура будет способствовать проведению множества исследований, направленных на изучение роли симпатической иннервации в дистальных тканевых мишенях.

Abstract

Повреждения периферических нервов встречаются часто, а полное функциональное восстановление после травмы достигается только у 10% пациентов. Симпатическая нервная система играет много важных ролей в поддержании гомеостаза организма, но она редко изучается в контексте повреждения периферических нервов. Степень постганглионарных симпатических нейронных функций в дистальных мишенях на периферии в настоящее время неясна. Чтобы лучше изучить роль симпатической иннервации периферических мишеней, хирургическая модель «нокаута» предлагает альтернативный подход. Хотя это может быть достигнуто химическим путем, химическая деструкция постганглионарных симпатических нейронов может быть неспецифической и дозозависимой. Использование хирургической поясничной симпатэктомии у мышей, которое когда-то считалось «практически непрактичным» у мелких животных, позволяет целенаправленно воздействовать на постганглионарные симпатические нейроны, которые иннервируют задние конечности. В данной рукописи описывается, как хирургическое удаление поясничных симпатических ганглиев L2-L5 у мыши в качестве операции по выживанию, которая надежно снижает потовую реакцию задней лапы и количество симпатических аксонов в седалищном нерве.

Introduction

Повреждения периферических нервов (ПНИ) могут приводить к двигательному, сенсорному и симпатическому дефициту в дистальных тканевых мишенях, которые редко полностью функционально восстанавливаются1. Исследования PNI часто сосредоточены на моторной и сенсорной регенерации; Тем не менее, почти четверть седалищного нерва крысы состоит из немиелинизированных симпатическихаксонов2. Роль симпатической иннервации в периферических тканях, тем не менее, до конца не изучена3. Симпатическая нервная система играет важную роль в поддержании гомеостаза организма, участвуя в иммунной регуляции, терморегуляции, тонусе сосудов, митохондриальном биогенезе и т.д. 4,5,6,7,8,9,10,11. При утрате симпатической иннервации в нервно-мышечном соединении наблюдается стойкая мышечная слабость и синаптическая нестабильность, несмотря на поддержание иннервации мотонейрона12. Было показано, что эта симпатическая регуляция синаптической передачи в нервно-мышечном соединении снижается с возрастом13,14, что способствует саркопении, определяемой как возрастное снижение мышечной массы, силы и мощности15. Лучшее понимание роли симпатической иннервации периферических тканей необходимо для разработки методов лечения, которые оптимизируют функциональные результаты у пациентов с ПНИ и другими формами симпатической дисфункции.

Симпатэктомия является мощным экспериментальным инструментом, который позволит исследовать роль симпатической иннервации в дистальных тканях-мишенях. В частности, удаление симпатических ганглиев уровня L2-L5 удаляет большую часть симпатической иннервации нижних конечностей, что особенно полезно для исследователей, интересующихся седалищным нервом.

В этом протоколе подробно описывается удаление постганглионарных симпатических нейронов уровня L2-L5 у мыши в качестве операции по выживанию. Эта процедура требует от грызунов микрохирургических навыков и знакомства с анатомией мыши, и при эффективном выполнении не вызывает каких-либо видимых фенотипических различий. Хирургическая поясничная симпатэктомия использовалась в исследованиях на грызунах, в большей степени на крысах, чем на мышах 16,17,18,19,20,21; Однако подробного протокола, описывающего этот протокол, в настоящее время не существует. Предыдущие исследования с использованием поясничной симпатэктомии в первую очередь были сосредоточены на роли симпатической иннервации в болевой реакции, которая, как правило, ослабляется симпатэктомией в различных моделях повреждения нервов. В меньшем количестве исследований этот метод использовался на мышах22, вероятно, из-за меньшего размера анатомических ориентиров, поскольку использование хирургической симпатэктомии считалось «практически непрактичным» у мелких животных23,24. Локализованная симпатэктомия в форме микросимпатэктомии также использовалась в моделях грызунов, также в основном в контексте болевого поведения 25,26,27. Микросимпатэктомия, в отличие от тотальной поясничной симпатэктомии, использует дорсальный доступ, посредством которого сегмент серой ветви к определенному спинномозговому нерву отсоединяется и удаляется, что позволяет проводить очень целенаправленную симпатэктомию, которая позволит избежать более широких побочных эффектов.

Поскольку мышиные модели имеют решающее значение для многих исследований, требующих генетических манипуляций, эта процедура будет иметь универсальное применение и за пределами широты повреждений периферических нервов. Используя трансабдоминальный доступ, поясничные симпатические ганглии могут быть надежно визуализированы и удалены от мыши без видимых побочных эффектов. Несмотря на то, что существуют протоколы химического разрушения постганглионарных симпатических нейронов, такие как использование 6-гидроксидопамина (6-OHDA)23,24, эта хирургическая процедура позволяет анатомически специфично нацеливаться на постганглионарные поясничные симпатические ганглии. Использование хирургической симпатэктомии также позволяет избежать неспецифических и дозозависимых проблем, связанных с фармакологическими методами28,29.

Использование химических симпатэктомий путем введения 6-OHDA было описано в 1967 году как простой способ достижения избирательного разрушения адренергических нервных окончаний, поскольку хирургическая симпатэктомия у мелких животных не была предпочтительной. 6-OHDA представляет собой катехоламинергический нейротоксин, который эндогенно образуется у пациентов с болезнью Паркинсона, а его токсичность обусловлена его способностью образовывать свободные радикалы и ингибировать цепь переноса электронов в митохондриях30,31. Благодаря механизмам транспортировки норадреналина Uptake-1, 6-OHDA способен накапливаться в норадренергических нейронах, таких как постганглионарные симпатические нейроны28. В конце концов, нейрон разрушается 6-OHDA; Тем не менее, терминали в периферической нервной системе регенерируют с восстановлением функциональной активности даже тогда, когда уровень аминов все еще снижен. Различные пороговые дозы также присутствуют для разных органов в ответ на 6-OHDA, и было показано, что более высокие дозы 6-OHDA проявляют более неспецифические эффекты, распространяя его нейротоксические последствия на нейроны, не содержащие катехоламин, и даже на ненейрональные клетки. Помимо норадренергических нейронов, дофаминергические нейроны также поражаются 6-OHDA29, что делает химическую симпатэктомию в конечном итоге менее специфичной для постганглионарных симпатических нейронов, чем хирургическая симпатэктомия.

Таким образом, хирургическая поясничная симпатэктомия позволяет целенаправленно абляционировать симпатическую иннервацию нижних конечностей, что может быть сочетано с различными экспериментальными методами и генетическими манипуляциями на мышах для изучения того, как симпатическая нервная система способствует различным травмам и болезненным состояниям.

Protocol

Все эксперименты были одобрены Комитетом по институциональному уходу за животными и их использованию (IACUC) Университета Эмори (в соответствии с протоколом IACUC No PROTO201700371). В этом исследовании были использованы четыре взрослые самки мышей дикого типа C57BL/6J в возрасте 14 недель и весом от 16 д…

Representative Results

Этот протокол описывает хирургическое удаление постганглионарных поясничных симпатических нейронов у мыши. Две мыши получили поясничную симпатэктомию, а две мыши служили контрольной группой. Для достижения успешной хирургической поясничной симпатэктомии должна быть достигнута аде…

Discussion

Поясничные симпатические ганглии – это очень мелкие структуры, расположенные позади многих критически важных органов брюшной полости и крупных сосудов. Поэтому данная процедура требует значительной точности и аккуратности. Большая часть трудностей заключается в интраоперационной ?…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Эта работа была поддержана Национальным институтом неврологических расстройств и инсульта NIH под номером K01NS124912 и частично грантом на развитие от финансируемого NIH Специализированного центра передового опыта исследований в области половых различий U54AG062334 и Программой подготовки ученых-медиков Медицинской школы Университета Эмори. Благодарим Дэвида Кима, постбакалавра, за рассечение седалищных нервов и ХаоМин СиМа, специалиста по исследованиям, за 3D-печать крепления для телефона для нашего стереомикроскопа, которое позволило снять видео.

Materials

5-0 absorable suture CP Medical 421A
5-0 nylon suture Med-Vet International MV-661
70% ethanol Sigma-Aldrich E7023-4L
Anesthesia Induction Chamber Kent Scientific VetFlo VetFlo-0530XS
Anesthesia Vaporizer Kent Scientific VetFlo 13-005-202
Betadine HealthyPets BET16OZ
C57BL/6J mice Jackson Laboratory #000664
Chicken anti-neurofilament-heavy Abcam ab72996
Cryostat Leica CM1850
Data Analysis Software Prism
Eye lubricant Refresh Refresh P.M.
Fine-tipped tweezers World Precision Instruments 500233
Fluorescent microscope Nikon Ti-E
Goat anti-chicken 488 Invitrogen A32931
Goat anti-rabbit 647 Invitrogen A21245
Heating pad Braintree Scientific 39DP
Image Analysis Software Fiji
Imaging Software Nikon NIS-Elements
Isoflurane Med-Vet International RXISO-250
Meloxicam Med-Vet International RXMELOXIDYL32
Needle driver Roboz Surgical Store RS-7894
Normal Goat Serum Abcam ab7481
Phox2bCre:tdTomato mutant mice Jackson Laboratory  #016223, #007914
Pilocarpine hydrochloride Sigma-Aldrich P6503
Rabbit anti-tyrosine hydroxylase Abcam ab112
Small straight scissors  Fine Science Tools 14084-09
Sterile cotton swabs 2×2 Dynarex 3252
Sterile cotton tipped applicators Dynarex 4301
Sterile drape Med-Vet International DR4042
Sterile saline solution Med-Vet International 1070988-BX
ThCre:mTmG mutant mice Mutant Mouse Resource and Research Centers strain #017262-UCD Jackson Laboratory, strain #007576
ThCre:tdTomato mutant mice European Mouse Mutant Archive strain #00254 Jackson Laboratory, strain #007914

References

  1. Scholz, T., et al. Peripheral nerve injuries: An international survey of current treatments and future perspectives. J Reconstr Microsurg. 25 (06), 339-344 (2009).
  2. Schmalbruch, H. Fiber composition of the rat sciatic nerve. Anat Rec. 215 (1), 71-81 (1986).
  3. Tian, T., Moore, A. M., Ghareeb, P. A., Boulis, N. M., Ward, P. J. A perspective on electrical stimulation and sympathetic regeneration in peripheral nerve injuries. Neurotrauma Rep. 5 (1), 172-180 (2024).
  4. Gagnon, D., Crandall, C. G. Sweating as a heat loss thermoeffector. Hand Clin Neurol. 156, 211-232 (2018).
  5. Grassi, G. Role of the sympathetic nervous system in human hypertension. J Hypertens. 16 (12), 1979-1987 (1998).
  6. Dibona, G. F. Sympathetic nervous system and the kidney in hypertension. Curr Opin Nephrol Hypertens. 11 (2), 197-200 (2002).
  7. Elenkov, I. J., Wilder, R. L., Chrousos, G. P., Vizi, E. S. The sympathetic nerve-An integrative interface between two supersystems: The brain and the immune system. Pharmacol Rev. 52 (4), 595-638 (2000).
  8. Besedovsky, H. O., Del Rey, A., Sorkin, E., Da Prada, M., Keller, H. Immunoregulation mediated by the sympathetic nervous system. Cell Immunol. 48 (2), 346-355 (1979).
  9. Straka, T., et al. Postnatal development and distribution of sympathetic innervation in mouse skeletal muscle. Int J Mol Sci. 19 (7), 1935 (2018).
  10. Geng, T., et al. Pgc-1α plays a functional role in exercise-induced mitochondrial biogenesis and angiogenesis but not fiber-type transformation in mouse skeletal muscle. Am J Physiol Cell Physiol. 298 (3), C572-C579 (2010).
  11. Lin, J., Handschin, C., Spiegelman, B. M. Metabolic control through the pgc-1 family of transcription coactivators. Cell Metab. 1 (6), 361-370 (2005).
  12. Khan, M. M., et al. Sympathetic innervation controls homeostasis of neuromuscular junctions in health and disease. Proc Natl Acad Sci. 113 (3), 746-750 (2016).
  13. Delbono, O., Rodrigues, A. C. Z., Bonilla, H. J., Messi, M. L. The emerging role of the sympathetic nervous system in skeletal muscle motor innervation and sarcopenia. Ageing Res Rev. 67, 101305 (2021).
  14. Rodrigues, A. C. Z., et al. Heart and neural crest derivative 2-induced preservation of sympathetic neurons attenuates sarcopenia with aging. J Cachexia Sarcopenia Muscle. 12 (1), 91-108 (2021).
  15. Rosenberg, I. H. Summary comments. Am J Clin Nutr. 50 (5), 1231-1233 (1989).
  16. Murata, Y., Olmarker, K., Takahashi, I., Takahashi, K., Rydevik, B. Effects of lumbar sympathectomy on pain behavioral changes caused by nucleus pulposus-induced spinal nerve damage in rats. Eur Spine J. 15, 634-640 (2006).
  17. Xie, J., Park, S. K., Chung, K., Chung, J. M. The effect of lumbar sympathectomy in the spinal nerve ligation model of neuropathic pain. J Pain. 2 (5), 270-278 (2001).
  18. Lee, D. H., Katner, J., Iyengar, S., Lodge, D. The effect of lumbar sympathectomy on increased tactile sensitivity in spinal nerve ligated rats. Neurosci Lett. 298 (2), 99-102 (2001).
  19. Ringkamp, M., et al. Lumbar sympathectomy failed to reverse mechanical allodynia-and hyperalgesia-like behavior in rats with l5 spinal nerve injury. Pain. 79 (2-3), 143-153 (1999).
  20. Zhao, C., et al. Lumbar sympathectomy attenuates cold allodynia but not mechanical allodynia and hyperalgesia in rats with spared nerve injury. J Pain. 8 (12), 931-937 (2007).
  21. Zheng, Z. -. F., et al. Recovery of sympathetic nerve function after lumbar sympathectomy is slower in the hind limbs than in the torso. Neural Regen Res. 12 (7), 1177 (2017).
  22. Holmberg, K., Shi, T. -. J. S., Albers, K. M., Davis, B. M., Hökfelt, T. Effect of peripheral nerve lesion and lumbar sympathectomy on peptide regulation in dorsal root ganglia in the ngf-overexpressing mouse. Exp Neurol. 167 (2), 290-303 (2001).
  23. Thoenen, H., Tranzer, J. Chemical sympathectomy by selective destruction of adrenergic nerve endings with 6-hydroxydopamine. Naunyn Schmiedebergs Arch. Exp. Pathol. Pharmakol. 261, 271-288 (1968).
  24. Thoenen, H., Tranzer, J. P., Häusler, G. Chemical sympathectomy with 6-hydroxydopamine. New Aspects of Storage and Release Mechanisms of Catecholamines. , 130-143 (1970).
  25. Xie, W., et al. Localized sympathectomy reduces mechanical hypersensitivity by restoring normal immune homeostasis in rat models of inflammatory pain. J Neuroscience. 36 (33), 8712-8725 (2016).
  26. Zhu, X., Xie, W., Zhang, J., Strong, J. A., Zhang, J. -. M. Sympathectomy decreases pain behaviors and nerve regeneration by downregulating monocyte chemokine ccl2 in dorsal root ganglia in the rat tibial nerve crush model. Pain. 163 (1), e106-e120 (2022).
  27. Tonello, R., et al. Local sympathectomy promotes anti-inflammatory responses and relief of paclitaxel-induced mechanical and cold allodynia in mice. Anesthesiology. 132 (6), 1540-1553 (2020).
  28. Kostrzewa, R. M., Jacobowitz, D. M. Pharmacological actions of 6-hydroxydopamine. Pharmacol Rev. 26 (3), 199-288 (1974).
  29. Michel, P., Hefti, F. Toxicity of 6-hydroxydopamine and dopamine for dopaminergic neurons in culture. J Neuroscience Res. 26 (4), 428-435 (1990).
  30. Andrew, R., et al. The determination of hydroxydopamines and other trace amines in the urine of parkinsonian patients and normal controls. Neurochemical Res. 18, 1175-1177 (1993).
  31. Glinka, Y., Gassen, M., Youdim, M. Mechanism of 6-hydroxydopamine neurotoxicity. J Neural Transm Suppl. 5, 55-66 (1997).
  32. Treuting, P. M., Dintzis, S. M., Montine, K. S. . Comparative anatomy and histology: A mouse, rat, and human atlas. , (2017).
  33. Hweidi, S. A., Lee, S., Wolf, P. Effect of sympathectomy on microvascular anastomosis in the rat. Microsurgery. 6 (2), 9-96 (1985).
  34. Navarro, X., Kennedy, W. R. Sweat gland reinnervation by sudomotor regeneration after different types of lesions and graft repairs. Exp Neurol. 104 (3), 229-234 (1989).
  35. Gaudet, A. D., Popovich, P. G., Ramer, M. S. Wallerian degeneration: Gaining perspective on inflammatory events after peripheral nerve injury. J Neuroinflammation. 8 (1), 1-13 (2011).
  36. Babetto, E., et al. Targeting nmnat1 to axons and synapses transforms its neuroprotective potency in vivo. J Neuroscience. 30 (40), 13291-13304 (2010).
  37. Brumovsky, P. R. Dorsal root ganglion neurons and tyrosine hydroxylase-an intriguing association with implications for sensation and pain. Pain. 157 (2), 314 (2016).
  38. Tian, T., Harris, A., Owyoung, J., Sima, H., Ward, P. J. Conditioning electrical stimulation fails to enhance sympathetic axon regeneration. bioRxiv. , (2023).
  39. Tian, T., Ward, P. J. The ThCre: Mtmg mouse has sparse expression in the sympathetic nervous system. bioRxiv. , (2023).
  40. Ohman-Gault, L., Huang, T., Krimm, R. The transcription factor Phox2b distinguishes between oral and non-oral sensory neurons in the geniculate ganglion. J Comparative Neurol. 525 (18), 3935-3950 (2017).
  41. Pattyn, A., Morin, X., Cremer, H., Goridis, C., Brunet, J. -. F. The homeobox gene phox2b is essential for the development of autonomic neural crest derivatives. Nature. 399 (6734), 366-370 (1999).
  42. François, M., et al. Sympathetic innervation of the interscapular brown adipose tissue in mouse. Ann N Y Acad Sci. 1454 (1), 3-13 (2019).
This article has been published
Video Coming Soon
Keep me updated:

.

Cite This Article
Tian, T., Ward, P. J. Surgical Lumbar Sympathectomy in Mice. J. Vis. Exp. (209), e66821, doi:10.3791/66821 (2024).

View Video