כריתת סימפתטומיה מותנית כירורגית בעכברים
Summary
כתב יד זה מציג פרוטוקול להסרה כירורגית של תאי עצב סימפתטיים מותניים פוסט-גנגליונים מעכבר. הליך זה יאפשר מספר רב של מחקרים שמטרתם לחקור את התפקיד של עצבוב סימפתטי במטרות רקמות דיסטליות.
Abstract
פגיעות עצביות היקפיות הן נפוצות, והתאוששות תפקודית מלאה לאחר פציעה מושגת רק ב-10% מהמטופלים. מערכת העצבים הסימפתטית ממלאת תפקידים קריטיים רבים בשמירה על הומאוסטזיס גופני, אך רק לעתים רחוקות היא נחקרה בהקשר של פגיעה עצבית היקפית. היקף התפקודים העצביים הסימפתטיים הפוסט-גנגליונים במטרות דיסטליות בפריפריה אינו ברור כרגע. כדי לחקור טוב יותר את התפקיד של עצבוב סימפתטי של מטרות היקפיות, מודל “נוק-אאוט” כירורגי מספק גישה חלופית. למרות שניתן להשיג זאת מבחינה כימית, הרס כימי של נוירונים סימפתטיים פוסט-גנגליונים יכול להיות לא ספציפי ותלוי מינון. השימוש בכריתת סימפתטומיה מותנית כירורגית בעכברים, שבעבר נחשבה ל”כמעט בלתי מעשית” בבעלי חיים קטנים, מאפשר מיקוד ספציפי של נוירונים סימפתטיים פוסט-גנגליונים המעצבבים את הגפיים האחוריות. כתב יד זה מתאר כיצד להסיר בניתוח את הגרעינים הסימפתטיים המותניים L2-L5 מעכבר כניתוח הישרדות, אשר מפחית באופן אמין את תגובת הזיעה של הכף האחורית ואת מספר האקסונים הסימפתטיים בעצב הסיאטי.
Introduction
פגיעות עצביות היקפיות (PNIs) יכולות להוביל לליקויים מוטוריים, תחושתיים וסימפתטיים במטרות רקמה דיסטלית שרק לעתים רחוקות מתאוששים באופן מלא1. מחקרי PNI התמקדו לעתים קרובות בהתחדשות המוטורית והחושית; עם זאת, כמעט רבע מהעצב הסיאטי של החולדה מורכב מאקסונים סימפתטיים לא מיאלינטים2. התפקיד של עצבוב סימפתטי ברקמות ההיקפיות, עם זאת, אינו מובן במלואו3. מערכת העצבים הסימפתטית ממלאת תפקיד מרכזי בשמירה על הומאוסטזיס גופני, משתתפת בוויסות חיסוני, ויסות תרמי, טונוס כלי דם, ביוגנזה מיטוכונדריאלית ועוד 4,5,6,7,8,9,10,11 . כאשר עצבוב סימפתטי בצומת הנוירומוסקולרי הולך לאיבוד, חולשת שרירים מתמשכת וחוסר יציבות סינפטית נצפים למרות שמירה על עצבוב מוטונורון12. ויסות סימפתטי זה של העברה סינפטית בצומת העצבית-שרירית הוכח כיורד עם הזדקנות13,14, מה שתורם לסרקופניה, המוגדרת כירידה תלוית גיל במסת שריר, כוח וכוח15. הבנה טובה יותר של תפקיד העצבוב הסימפתטי של רקמות היקפיות נחוצה לפיתוח טיפולים שימטבו את התוצאות התפקודיות עבור חולים עם PNIs וצורות אחרות של תפקוד לקוי סימפתטי.
כריתת סימפתטיה היא כלי ניסיוני רב עוצמה שיאפשר לחקור את תפקיד העצבוב הסימפתטי ברקמות המטרה הדיסטליות. באופן ספציפי, הסרת הגרעינים הסימפתטיים ברמת L2-L5 מסירה את רוב העצבוב הסימפתטי לגפיים התחתונות, דבר שימושי במיוחד עבור חוקרים המעוניינים בעצב הסיאטי.
פרוטוקול זה מפרט את הסרת תאי העצב הסימפתטיים הפוסט-גנגליונים ברמת L2-L5 מעכבר כניתוח הישרדות. הליך זה דורש מיומנויות מיקרוכירורגיות של מכרסמים והיכרות עם אנטומיה של עכבר, וכאשר הוא מבוצע ביעילות, אינו גורם להבדלים פנוטיפיים נראים לעין. כריתת סימפתטומיה מותנית כירורגית שימשה במחקר מכרסמים, יותר בחולדות מאשר בעכברים 16,17,18,19,20,21; עם זאת, פרוטוקול מפורט המתאר את הפרוטוקול אינו קיים כיום. מחקרים קודמים שהשתמשו בסימפטקטומיה המותנית התמקדו בעיקר בתפקיד של עצבוב סימפתטי בתגובת הכאב, אשר בדרך כלל מוחלשת על ידי סימפטקטומיה במודלים שונים של פגיעה עצבית. פחות מחקרים השתמשו בטכניקה זו בעכברים22, ככל הנראה בשל גודלם הקטן יותר של ציוני דרך אנטומיים, שכן השימוש בסימפטקטומיה כירורגית נחשב “כמעט לא מעשי” בבעלי חיים קטנים23,24. סימפטקטומיות מקומיות בצורה של microsympathectomies שימשו גם במודלים של מכרסמים, גם בעיקר בהקשר של התנהגויות כאב 25,26,27. המיקרוסימפטקטומיה, בניגוד לכריתת הסימפטקטומיה המותנית הכוללת, משתמשת בגישה גבית שבאמצעותה מנתק ומוסר קטע מהרמוס האפור לעצב עמוד שדרה ספציפי, מה שמאפשר כריתת סימפתקטומיה ממוקדת מאוד שתמנע תופעות לוואי רחבות יותר.
מכיוון שמודלים של עכברים הם קריטיים עבור מחקרים רבים הדורשים מניפולציה גנטית, להליך זה יהיו יישומים מגוונים מעבר לרוחב של פגיעות עצביות היקפיות גם כן. באמצעות גישה טרנס-בטנית, ניתן להמחיש באופן אמין את הגרעינים הסימפתטיים המותניים ולכרות אותם מהעכבר ללא תופעות לוואי נראות לעין. למרות שקיימים פרוטוקולים להשמדה כימית של נוירונים סימפתטיים פוסט-גנגליונים, כגון שימוש ב-6-הידרוקסידופמין (6-OHDA)23,24, הליך כירורגי זה מאפשר מיקוד אנטומי ספציפי של הגרעינים הסימפתטיים המותניים הפוסט-גנגליונים. השימוש בסימפטקטומיה כירורגית גם מונע את החששות הלא ספציפיים ותלויי המינון הקשורים לשיטות פרמקולוגיות28,29.
השימוש בסימפטקטומיות כימיות באמצעות מתן 6-OHDA תואר בשנת 1967 כדרך פשוטה להשיג הרס סלקטיבי של קצות עצבים אדרנרגיים, שכן ניתוחים בבעלי חיים קטנים לא היו מועדפים23,24. 6-OHDA הוא רעלן עצבי קטכולמינרגי שנוצר אנדוגנית בחולי פרקינסון, ורעילותו נגזרת מיכולתו ליצור רדיקלים חופשיים ולעכב את שרשרת הובלת האלקטרונים במיטוכונדריה30,31. באמצעות מנגנוני הובלה של ספיגת נוראדרנלין-1, 6-OHDA מסוגל להצטבר בתוך נוירונים נוראדרנרגיים, כגון נוירונים סימפתטיים פוסט-גנגליונים28. בסופו של דבר, תא העצב נהרס על ידי 6-OHDA; עם זאת, טרמינלים במערכת העצבים ההיקפית אכן מתחדשים, עם שיקום הפעילות התפקודית גם כאשר רמות האמין עדיין מופחתות. ספי מינון שונים קיימים גם עבור איברים שונים בתגובה ל-6-OHDA, ומינונים גבוהים יותר של 6-OHDA הוכחו כבעלי השפעות לא ספציפיות יותר, המרחיבים את השלכותיו הנוירוטוקסיות לנוירונים שאינם מכילים קטכולאמין ואפילו לתאים שאינם נוירונים. מלבד נוירונים נוראדרנרגיים, נוירונים דופמינרגיים מושפעים גם מ-6-OHDA29, מה שהופך את הסימפטקטומיה הכימית בסופו של דבר לפחות ספציפית לנוירונים סימפתטיים פוסט-גנגליונים מאשר הסימפטקטומיה הכירורגית.
לכן, כריתת סימפתטומיה מותנית כירורגית מאפשרת אבלציה ממוקדת של העצבוב הסימפתטי לגפיים התחתונות, אותה ניתן לשלב עם מגוון טכניקות ניסיוניות ומניפולציות גנטיות בעכבר כדי לחקור כיצד מערכת העצבים הסימפתטית תורמת למצבי פציעה ומחלה שונים.
Protocol
Representative Results
Discussion
הגרעינים הסימפתטיים המותניים הם מבנים קטנים מאוד הממוקמים מאחורי איברי בטן קריטיים רבים וכלי דם גדולים. לכן, הליך זה דורש דיוק ודיוק משמעותיים. חלק גדול מהקושי טמון בזיהוי הגרעינים הסימפתטיים תוך ניתוחית. מוצע כי הלומד יוכל תחילה לזהות את הגרעינים בגופת עכבר לפני שינסה הליך זה בעכבר חי. ל?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
עבודה זו נתמכה על ידי המכון הלאומי להפרעות נוירולוגיות ושבץ מוחי של NIH תחת פרס מספר K01NS124912 ובחלקה על ידי מענק התפתחותי ממרכז אמורי המתמחה למצוינות במחקר בהבדלים בין המינים U54AG062334 במימון NIH ותוכנית הכשרת המדענים הרפואיים של בית הספר לרפואה של אוניברסיטת אמורי. תודה לדיוויד קים, לאחר הבגרות, על חיתוך עצבים סיאטיים ול- HaoMin SiMa, מומחה מחקר, על הדפסת תלת מימד תושבת טלפון למיקרוסקופ הסטריאו שלנו שאפשרה את צילום הסרטון.
Materials
| 5-0 absorable suture | CP Medical | 421A | |
| 5-0 nylon suture | Med-Vet International | MV-661 | |
| 70% ethanol | Sigma-Aldrich | E7023-4L | |
| Anesthesia Induction Chamber | Kent Scientific VetFlo | VetFlo-0530XS | |
| Anesthesia Vaporizer | Kent Scientific VetFlo | 13-005-202 | |
| Betadine | HealthyPets | BET16OZ | |
| C57BL/6J mice | Jackson Laboratory | #000664 | |
| Chicken anti-neurofilament-heavy | Abcam | ab72996 | |
| Cryostat | Leica | CM1850 | |
| Data Analysis Software | Prism | ||
| Eye lubricant | Refresh | Refresh P.M. | |
| Fine-tipped tweezers | World Precision Instruments | 500233 | |
| Fluorescent microscope | Nikon | Ti-E | |
| Goat anti-chicken 488 | Invitrogen | A32931 | |
| Goat anti-rabbit 647 | Invitrogen | A21245 | |
| Heating pad | Braintree Scientific | 39DP | |
| Image Analysis Software | Fiji | ||
| Imaging Software | Nikon | NIS-Elements | |
| Isoflurane | Med-Vet International | RXISO-250 | |
| Meloxicam | Med-Vet International | RXMELOXIDYL32 | |
| Needle driver | Roboz Surgical Store | RS-7894 | |
| Normal Goat Serum | Abcam | ab7481 | |
| Phox2bCre:tdTomato mutant mice | Jackson Laboratory | #016223, #007914 | |
| Pilocarpine hydrochloride | Sigma-Aldrich | P6503 | |
| Rabbit anti-tyrosine hydroxylase | Abcam | ab112 | |
| Small straight scissors | Fine Science Tools | 14084-09 | |
| Sterile cotton swabs 2×2 | Dynarex | 3252 | |
| Sterile cotton tipped applicators | Dynarex | 4301 | |
| Sterile drape | Med-Vet International | DR4042 | |
| Sterile saline solution | Med-Vet International | 1070988-BX | |
| ThCre:mTmG mutant mice | Mutant Mouse Resource and Research Centers | strain #017262-UCD | Jackson Laboratory, strain #007576 |
| ThCre:tdTomato mutant mice | European Mouse Mutant Archive | strain #00254 | Jackson Laboratory, strain #007914 |
References
- Scholz, T., et al. Peripheral nerve injuries: An international survey of current treatments and future perspectives. J Reconstr Microsurg. 25 (06), 339-344 (2009).
- Schmalbruch, H. Fiber composition of the rat sciatic nerve. Anat Rec. 215 (1), 71-81 (1986).
- Tian, T., Moore, A. M., Ghareeb, P. A., Boulis, N. M., Ward, P. J. A perspective on electrical stimulation and sympathetic regeneration in peripheral nerve injuries. Neurotrauma Rep. 5 (1), 172-180 (2024).
- Gagnon, D., Crandall, C. G. Sweating as a heat loss thermoeffector. Hand Clin Neurol. 156, 211-232 (2018).
- Grassi, G. Role of the sympathetic nervous system in human hypertension. J Hypertens. 16 (12), 1979-1987 (1998).
- Dibona, G. F. Sympathetic nervous system and the kidney in hypertension. Curr Opin Nephrol Hypertens. 11 (2), 197-200 (2002).
- Elenkov, I. J., Wilder, R. L., Chrousos, G. P., Vizi, E. S. The sympathetic nerve-An integrative interface between two supersystems: The brain and the immune system. Pharmacol Rev. 52 (4), 595-638 (2000).
- Besedovsky, H. O., Del Rey, A., Sorkin, E., Da Prada, M., Keller, H. Immunoregulation mediated by the sympathetic nervous system. Cell Immunol. 48 (2), 346-355 (1979).
- Straka, T., et al. Postnatal development and distribution of sympathetic innervation in mouse skeletal muscle. Int J Mol Sci. 19 (7), 1935 (2018).
- Geng, T., et al. Pgc-1α plays a functional role in exercise-induced mitochondrial biogenesis and angiogenesis but not fiber-type transformation in mouse skeletal muscle. Am J Physiol Cell Physiol. 298 (3), C572-C579 (2010).
- Lin, J., Handschin, C., Spiegelman, B. M. Metabolic control through the pgc-1 family of transcription coactivators. Cell Metab. 1 (6), 361-370 (2005).
- Khan, M. M., et al. Sympathetic innervation controls homeostasis of neuromuscular junctions in health and disease. Proc Natl Acad Sci. 113 (3), 746-750 (2016).
- Delbono, O., Rodrigues, A. C. Z., Bonilla, H. J., Messi, M. L. The emerging role of the sympathetic nervous system in skeletal muscle motor innervation and sarcopenia. Ageing Res Rev. 67, 101305 (2021).
- Rodrigues, A. C. Z., et al. Heart and neural crest derivative 2-induced preservation of sympathetic neurons attenuates sarcopenia with aging. J Cachexia Sarcopenia Muscle. 12 (1), 91-108 (2021).
- Rosenberg, I. H. Summary comments. Am J Clin Nutr. 50 (5), 1231-1233 (1989).
- Murata, Y., Olmarker, K., Takahashi, I., Takahashi, K., Rydevik, B. Effects of lumbar sympathectomy on pain behavioral changes caused by nucleus pulposus-induced spinal nerve damage in rats. Eur Spine J. 15, 634-640 (2006).
- Xie, J., Park, S. K., Chung, K., Chung, J. M. The effect of lumbar sympathectomy in the spinal nerve ligation model of neuropathic pain. J Pain. 2 (5), 270-278 (2001).
- Lee, D. H., Katner, J., Iyengar, S., Lodge, D. The effect of lumbar sympathectomy on increased tactile sensitivity in spinal nerve ligated rats. Neurosci Lett. 298 (2), 99-102 (2001).
- Ringkamp, M., et al. Lumbar sympathectomy failed to reverse mechanical allodynia-and hyperalgesia-like behavior in rats with l5 spinal nerve injury. Pain. 79 (2-3), 143-153 (1999).
- Zhao, C., et al. Lumbar sympathectomy attenuates cold allodynia but not mechanical allodynia and hyperalgesia in rats with spared nerve injury. J Pain. 8 (12), 931-937 (2007).
- Zheng, Z. -. F., et al. Recovery of sympathetic nerve function after lumbar sympathectomy is slower in the hind limbs than in the torso. Neural Regen Res. 12 (7), 1177 (2017).
- Holmberg, K., Shi, T. -. J. S., Albers, K. M., Davis, B. M., Hökfelt, T. Effect of peripheral nerve lesion and lumbar sympathectomy on peptide regulation in dorsal root ganglia in the ngf-overexpressing mouse. Exp Neurol. 167 (2), 290-303 (2001).
- Thoenen, H., Tranzer, J. Chemical sympathectomy by selective destruction of adrenergic nerve endings with 6-hydroxydopamine. Naunyn Schmiedebergs Arch. Exp. Pathol. Pharmakol. 261, 271-288 (1968).
- Thoenen, H., Tranzer, J. P., Häusler, G. Chemical sympathectomy with 6-hydroxydopamine. New Aspects of Storage and Release Mechanisms of Catecholamines. , 130-143 (1970).
- Xie, W., et al. Localized sympathectomy reduces mechanical hypersensitivity by restoring normal immune homeostasis in rat models of inflammatory pain. J Neuroscience. 36 (33), 8712-8725 (2016).
- Zhu, X., Xie, W., Zhang, J., Strong, J. A., Zhang, J. -. M. Sympathectomy decreases pain behaviors and nerve regeneration by downregulating monocyte chemokine ccl2 in dorsal root ganglia in the rat tibial nerve crush model. Pain. 163 (1), e106-e120 (2022).
- Tonello, R., et al. Local sympathectomy promotes anti-inflammatory responses and relief of paclitaxel-induced mechanical and cold allodynia in mice. Anesthesiology. 132 (6), 1540-1553 (2020).
- Kostrzewa, R. M., Jacobowitz, D. M. Pharmacological actions of 6-hydroxydopamine. Pharmacol Rev. 26 (3), 199-288 (1974).
- Michel, P., Hefti, F. Toxicity of 6-hydroxydopamine and dopamine for dopaminergic neurons in culture. J Neuroscience Res. 26 (4), 428-435 (1990).
- Andrew, R., et al. The determination of hydroxydopamines and other trace amines in the urine of parkinsonian patients and normal controls. Neurochemical Res. 18, 1175-1177 (1993).
- Glinka, Y., Gassen, M., Youdim, M. Mechanism of 6-hydroxydopamine neurotoxicity. J Neural Transm Suppl. 5, 55-66 (1997).
- Treuting, P. M., Dintzis, S. M., Montine, K. S. . Comparative anatomy and histology: A mouse, rat, and human atlas. , (2017).
- Hweidi, S. A., Lee, S., Wolf, P. Effect of sympathectomy on microvascular anastomosis in the rat. Microsurgery. 6 (2), 9-96 (1985).
- Navarro, X., Kennedy, W. R. Sweat gland reinnervation by sudomotor regeneration after different types of lesions and graft repairs. Exp Neurol. 104 (3), 229-234 (1989).
- Gaudet, A. D., Popovich, P. G., Ramer, M. S. Wallerian degeneration: Gaining perspective on inflammatory events after peripheral nerve injury. J Neuroinflammation. 8 (1), 1-13 (2011).
- Babetto, E., et al. Targeting nmnat1 to axons and synapses transforms its neuroprotective potency in vivo. J Neuroscience. 30 (40), 13291-13304 (2010).
- Brumovsky, P. R. Dorsal root ganglion neurons and tyrosine hydroxylase-an intriguing association with implications for sensation and pain. Pain. 157 (2), 314 (2016).
- Tian, T., Harris, A., Owyoung, J., Sima, H., Ward, P. J. Conditioning electrical stimulation fails to enhance sympathetic axon regeneration. bioRxiv. , (2023).
- Tian, T., Ward, P. J. The ThCre: Mtmg mouse has sparse expression in the sympathetic nervous system. bioRxiv. , (2023).
- Ohman-Gault, L., Huang, T., Krimm, R. The transcription factor Phox2b distinguishes between oral and non-oral sensory neurons in the geniculate ganglion. J Comparative Neurol. 525 (18), 3935-3950 (2017).
- Pattyn, A., Morin, X., Cremer, H., Goridis, C., Brunet, J. -. F. The homeobox gene phox2b is essential for the development of autonomic neural crest derivatives. Nature. 399 (6734), 366-370 (1999).
- François, M., et al. Sympathetic innervation of the interscapular brown adipose tissue in mouse. Ann N Y Acad Sci. 1454 (1), 3-13 (2019).
.