Summary

Sympathectomie lombaire chirurgicale chez la souris

Published: July 05, 2024
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Summary

Ce manuscrit présente un protocole pour l’ablation chirurgicale des neurones sympathiques lombaires postganglionnaires d’une souris. Cette procédure facilitera une multitude d’études visant à étudier le rôle de l’innervation sympathique dans les cibles du tissu distal.

Abstract

Les lésions des nerfs périphériques sont fréquentes, et la récupération fonctionnelle complète après une blessure n’est obtenue que chez 10% des patients. Le système nerveux sympathique joue de nombreux rôles essentiels dans le maintien de l’homéostasie corporelle, mais il a rarement été étudié dans le contexte des lésions nerveuses périphériques. L’étendue des fonctions neuronales sympathiques postganglionnaires chez les cibles distales de la périphérie n’est actuellement pas claire. Pour mieux explorer le rôle de l’innervation sympathique des cibles périphériques, un modèle chirurgical « knock-out » propose une approche alternative. Bien que cela puisse être réalisé chimiquement, la destruction chimique des neurones sympathiques postganglionnaires peut être non spécifique et dépendante de la dose. L’utilisation d’une sympathectomie lombaire chirurgicale chez la souris, que l’on pensait autrefois « pratiquement impraticable » chez les petits animaux, permet de cibler spécifiquement les neurones sympathiques postganglionnaires qui innervent les membres postérieurs. Ce manuscrit décrit comment enlever chirurgicalement les ganglions sympathiques lombaires L2-L5 d’une souris dans le cadre d’une chirurgie de survie, ce qui diminue de manière fiable la réponse sudoripare-transpiration de la patte arrière et le nombre d’axones sympathiques dans le nerf sciatique.

Introduction

Les lésions des nerfs périphériques (PNI) peuvent entraîner des déficits moteurs, sensoriels et sympathiques dans les cibles du tissu distalqui se rétablissent rarement complètement 1. La recherche PNI s’est souvent concentrée sur la régénération motrice et sensorielle ; Cependant, près d’un quart du nerf sciatique du rat est constitué d’axones sympathiques2 non myélinisés. Le rôle de l’innervation sympathique dans les tissus périphériques n’est cependant pas entièrement compris3. Le système nerveux sympathique joue un rôle majeur dans le maintien de l’homéostasie corporelle, participant à la régulation immunitaire, à la thermorégulation, au tonus vasculaire, à la biogenèse mitochondriale, etc. 4,5,6,7,8,9,10,11 . Lorsque l’innervation sympathique à la jonction neuromusculaire est perdue, une faiblesse musculaire persistante et une instabilité synaptique sont observées malgré le maintien de l’innervation des motoneurones12. Il a été démontré que cette régulation sympathique de la transmission synaptique à la jonction neuromusculaire diminue avec l’âge13,14, ce qui contribue à la sarcopénie, définie comme la réduction de la masse musculaire, de la force et de la puissance en fonction de l’âge15. Une meilleure compréhension du rôle de l’innervation sympathique des tissus périphériques est nécessaire pour le développement de thérapies qui optimiseront les résultats fonctionnels pour les patients atteints de PNI et d’autres formes de dysfonction sympathique.

La sympathectomie est un outil expérimental puissant qui permettra d’étudier le rôle de l’innervation sympathique dans les tissus cibles distaux. Plus précisément, l’ablation des ganglions sympathiques de niveau L2-L5 supprime la majorité de l’innervation sympathique des membres inférieurs, ce qui est particulièrement utile pour les chercheurs intéressés par le nerf sciatique.

Ce protocole détaille l’ablation des neurones sympathiques postganglionnaires de niveau L2-L5 d’une souris dans le cadre d’une chirurgie de survie. Cette procédure nécessite des compétences microchirurgicales chez les rongeurs et une familiarité avec l’anatomie de la souris, et lorsqu’elle est effectuée efficacement, elle ne provoque aucune différence phénotypique visible. Une sympathectomie lombaire chirurgicale a été utilisée dans la recherche sur les rongeurs, plus chez les rats que chez les souris 16,17,18,19,20,21 ; Cependant, il n’existe pas actuellement de protocole détaillé décrivant le protocole. Des études antérieures utilisant la sympathectomie lombaire se sont principalement concentrées sur le rôle de l’innervation sympathique dans la réponse à la douleur, qui est généralement atténuée par la sympathectomie dans divers modèles de lésions nerveuses. Moins d’études ont utilisé cette technique chez la souris22, probablement en raison de la taille plus petite des repères anatomiques, car l’utilisation de la sympathectomie chirurgicale était considérée comme « pratiquement impraticable » chez les petits animaux23,24. Des sympathectomies localisées sous forme de microsympathectomies ont également été utilisées dans des modèles de rongeurs, également principalement dans le contexte des comportements douloureux 25,26,27. La microsympathectomie, contrairement à la sympathectomie lombaire totale, utilise une approche dorsale par laquelle un segment de la branche grise d’un nerf spinal spécifique est déconnecté et retiré, ce qui permet une sympathectomie très ciblée qui évitera des effets secondaires plus larges.

Étant donné que les modèles murins sont essentiels pour de nombreuses études nécessitant une manipulation génétique, cette procédure aura des applications polyvalentes au-delà de l’étendue des lésions nerveuses périphériques. En utilisant une approche transabdominale, les ganglions sympathiques lombaires peuvent être visualisés de manière fiable et réséqués de la souris sans effets indésirables apparents. Bien qu’il existe des protocoles pour la destruction chimique des neurones sympathiques postganglionnaires, tels que l’utilisation de la 6-hydroxydopamine (6-OHDA)23,24, cette intervention chirurgicale permet de cibler anatomiquement spécifiquement les ganglions sympathiques lombaires postganglionnaires. L’utilisation d’une sympathectomie chirurgicale permet également d’éviter les problèmes non spécifiques et dose-dépendants liés aux méthodes pharmacologiques28,29.

L’utilisation de sympathectomies chimiques par l’administration de 6-OHDA a été décrite en 1967 comme un moyen simple d’obtenir une destruction sélective des terminaisons nerveuses adrénergiques, car les sympathectomies chirurgicales chez les petits animaux n’étaient pas favorisées23,24. La 6-OHDA est une neurotoxine catécholaminergique qui se forme de manière endogène chez les patients atteints de la maladie de Parkinson, et sa toxicité provient de sa capacité à former des radicaux libres et à inhiber la chaîne de transport d’électrons dans les mitochondries30,31. Grâce aux mécanismes de transport de l’absorption de la noradrénaline 1, la 6-OHDA est capable de s’accumuler dans les neurones noradrénergiques, tels que les neurones sympathiques postganglionnaires28. Finalement, le neurone est détruit par le 6-OHDA ; Cependant, les terminaisons du système nerveux périphérique se régénèrent, avec la restauration de l’activité fonctionnelle même lorsque les niveaux d’amines sont encore réduits. Des seuils de dosage différents sont également présents pour différents organes en réponse au 6-OHDA, et il a été démontré que des doses plus élevées de 6-OHDA présentent des effets plus non spécifiques, étendant ses conséquences neurotoxiques aux neurones non contenant des catécholamines et même aux cellules non neuronales. Outre les neurones noradrénergiques, les neurones dopaminergiques sont également affectés par la 6-OHDA29, ce qui rend la sympathectomie chimique finalement moins spécifique aux neurones sympathiques postganglionnaires que la sympathectomie chirurgicale.

Par conséquent, une sympathectomie lombaire chirurgicale permet l’ablation ciblée de l’innervation sympathique des membres inférieurs, qui peut être combinée avec une variété de techniques expérimentales et de manipulations génétiques chez la souris pour étudier comment le système nerveux sympathique contribue à diverses lésions et états pathologiques.

Protocol

Toutes les expériences ont été approuvées par l’Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC) de l’Université Emory (sous le numéro de protocole IACUC PROTO201700371). Quatre souris femelles adultes de type sauvage C57BL/6J, âgées de 14 semaines et pesant entre 16 et 21 g, ont été utilisées dans cette étude. Les détails des réactifs et de l’équipement utilisés ici sont répertoriés dans la table des matériaux. 1. Préparation préopératoire…

Representative Results

Ce protocole décrit l’ablation chirurgicale des neurones sympathiques lombaires postganglionnaires d’une souris. Deux souris ont reçu des sympathectomies lombaires et deux souris ont servi de témoins. Pour réussir une sympathectomie lombaire chirurgicale, une visualisation adéquate d’au moins les ganglions sympathiques lombaires bilatéraux L2 et L3 doit être obtenue, comme le montre la figure 1. L’ablation des ganglions L4 et L5 permettrait d’obtenir une dénervation sympath…

Discussion

Les ganglions sympathiques lombaires sont de très petites structures situées derrière de nombreux organes abdominaux critiques et de gros vaisseaux. Par conséquent, cette procédure nécessite une précision et une exactitude considérables. Une grande partie de la difficulté réside dans l’identification des ganglions sympathiques en peropératoire. Il est suggéré que l’apprenant soit d’abord capable d’identifier les ganglions dans un cadavre de souris avant de tenter cette procédure chez une souris viva…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Ce travail a été soutenu par le National Institute of Neurological Disorders and Stroke des NIH sous le numéro de bourse K01NS124912 et en partie par une subvention de développement du Centre spécialisé de recherche d’excellence en différences sexuelles d’U54AG062334 Emory financé par les NIH et du programme de formation des scientifiques médicaux de la faculté de médecine de l’Université Emory. Merci à David Kim, post-bac, pour la section des nerfs sciatiques et à HaoMin SiMa, spécialiste de la recherche, pour l’impression 3D d’un support de téléphone pour notre stéréomicroscope qui a permis de filmer la vidéo.

Materials

5-0 absorable suture CP Medical 421A
5-0 nylon suture Med-Vet International MV-661
70% ethanol Sigma-Aldrich E7023-4L
Anesthesia Induction Chamber Kent Scientific VetFlo VetFlo-0530XS
Anesthesia Vaporizer Kent Scientific VetFlo 13-005-202
Betadine HealthyPets BET16OZ
C57BL/6J mice Jackson Laboratory #000664
Chicken anti-neurofilament-heavy Abcam ab72996
Cryostat Leica CM1850
Data Analysis Software Prism
Eye lubricant Refresh Refresh P.M.
Fine-tipped tweezers World Precision Instruments 500233
Fluorescent microscope Nikon Ti-E
Goat anti-chicken 488 Invitrogen A32931
Goat anti-rabbit 647 Invitrogen A21245
Heating pad Braintree Scientific 39DP
Image Analysis Software Fiji
Imaging Software Nikon NIS-Elements
Isoflurane Med-Vet International RXISO-250
Meloxicam Med-Vet International RXMELOXIDYL32
Needle driver Roboz Surgical Store RS-7894
Normal Goat Serum Abcam ab7481
Phox2bCre:tdTomato mutant mice Jackson Laboratory  #016223, #007914
Pilocarpine hydrochloride Sigma-Aldrich P6503
Rabbit anti-tyrosine hydroxylase Abcam ab112
Small straight scissors  Fine Science Tools 14084-09
Sterile cotton swabs 2×2 Dynarex 3252
Sterile cotton tipped applicators Dynarex 4301
Sterile drape Med-Vet International DR4042
Sterile saline solution Med-Vet International 1070988-BX
ThCre:mTmG mutant mice Mutant Mouse Resource and Research Centers strain #017262-UCD Jackson Laboratory, strain #007576
ThCre:tdTomato mutant mice European Mouse Mutant Archive strain #00254 Jackson Laboratory, strain #007914

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Tian, T., Ward, P. J. Surgical Lumbar Sympathectomy in Mice. J. Vis. Exp. (209), e66821, doi:10.3791/66821 (2024).

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