Ce manuscrit présente un protocole pour l’ablation chirurgicale des neurones sympathiques lombaires postganglionnaires d’une souris. Cette procédure facilitera une multitude d’études visant à étudier le rôle de l’innervation sympathique dans les cibles du tissu distal.
Les lésions des nerfs périphériques sont fréquentes, et la récupération fonctionnelle complète après une blessure n’est obtenue que chez 10% des patients. Le système nerveux sympathique joue de nombreux rôles essentiels dans le maintien de l’homéostasie corporelle, mais il a rarement été étudié dans le contexte des lésions nerveuses périphériques. L’étendue des fonctions neuronales sympathiques postganglionnaires chez les cibles distales de la périphérie n’est actuellement pas claire. Pour mieux explorer le rôle de l’innervation sympathique des cibles périphériques, un modèle chirurgical « knock-out » propose une approche alternative. Bien que cela puisse être réalisé chimiquement, la destruction chimique des neurones sympathiques postganglionnaires peut être non spécifique et dépendante de la dose. L’utilisation d’une sympathectomie lombaire chirurgicale chez la souris, que l’on pensait autrefois « pratiquement impraticable » chez les petits animaux, permet de cibler spécifiquement les neurones sympathiques postganglionnaires qui innervent les membres postérieurs. Ce manuscrit décrit comment enlever chirurgicalement les ganglions sympathiques lombaires L2-L5 d’une souris dans le cadre d’une chirurgie de survie, ce qui diminue de manière fiable la réponse sudoripare-transpiration de la patte arrière et le nombre d’axones sympathiques dans le nerf sciatique.
Les lésions des nerfs périphériques (PNI) peuvent entraîner des déficits moteurs, sensoriels et sympathiques dans les cibles du tissu distalqui se rétablissent rarement complètement 1. La recherche PNI s’est souvent concentrée sur la régénération motrice et sensorielle ; Cependant, près d’un quart du nerf sciatique du rat est constitué d’axones sympathiques2 non myélinisés. Le rôle de l’innervation sympathique dans les tissus périphériques n’est cependant pas entièrement compris3. Le système nerveux sympathique joue un rôle majeur dans le maintien de l’homéostasie corporelle, participant à la régulation immunitaire, à la thermorégulation, au tonus vasculaire, à la biogenèse mitochondriale, etc. 4,5,6,7,8,9,10,11 . Lorsque l’innervation sympathique à la jonction neuromusculaire est perdue, une faiblesse musculaire persistante et une instabilité synaptique sont observées malgré le maintien de l’innervation des motoneurones12. Il a été démontré que cette régulation sympathique de la transmission synaptique à la jonction neuromusculaire diminue avec l’âge13,14, ce qui contribue à la sarcopénie, définie comme la réduction de la masse musculaire, de la force et de la puissance en fonction de l’âge15. Une meilleure compréhension du rôle de l’innervation sympathique des tissus périphériques est nécessaire pour le développement de thérapies qui optimiseront les résultats fonctionnels pour les patients atteints de PNI et d’autres formes de dysfonction sympathique.
La sympathectomie est un outil expérimental puissant qui permettra d’étudier le rôle de l’innervation sympathique dans les tissus cibles distaux. Plus précisément, l’ablation des ganglions sympathiques de niveau L2-L5 supprime la majorité de l’innervation sympathique des membres inférieurs, ce qui est particulièrement utile pour les chercheurs intéressés par le nerf sciatique.
Ce protocole détaille l’ablation des neurones sympathiques postganglionnaires de niveau L2-L5 d’une souris dans le cadre d’une chirurgie de survie. Cette procédure nécessite des compétences microchirurgicales chez les rongeurs et une familiarité avec l’anatomie de la souris, et lorsqu’elle est effectuée efficacement, elle ne provoque aucune différence phénotypique visible. Une sympathectomie lombaire chirurgicale a été utilisée dans la recherche sur les rongeurs, plus chez les rats que chez les souris 16,17,18,19,20,21 ; Cependant, il n’existe pas actuellement de protocole détaillé décrivant le protocole. Des études antérieures utilisant la sympathectomie lombaire se sont principalement concentrées sur le rôle de l’innervation sympathique dans la réponse à la douleur, qui est généralement atténuée par la sympathectomie dans divers modèles de lésions nerveuses. Moins d’études ont utilisé cette technique chez la souris22, probablement en raison de la taille plus petite des repères anatomiques, car l’utilisation de la sympathectomie chirurgicale était considérée comme « pratiquement impraticable » chez les petits animaux23,24. Des sympathectomies localisées sous forme de microsympathectomies ont également été utilisées dans des modèles de rongeurs, également principalement dans le contexte des comportements douloureux 25,26,27. La microsympathectomie, contrairement à la sympathectomie lombaire totale, utilise une approche dorsale par laquelle un segment de la branche grise d’un nerf spinal spécifique est déconnecté et retiré, ce qui permet une sympathectomie très ciblée qui évitera des effets secondaires plus larges.
Étant donné que les modèles murins sont essentiels pour de nombreuses études nécessitant une manipulation génétique, cette procédure aura des applications polyvalentes au-delà de l’étendue des lésions nerveuses périphériques. En utilisant une approche transabdominale, les ganglions sympathiques lombaires peuvent être visualisés de manière fiable et réséqués de la souris sans effets indésirables apparents. Bien qu’il existe des protocoles pour la destruction chimique des neurones sympathiques postganglionnaires, tels que l’utilisation de la 6-hydroxydopamine (6-OHDA)23,24, cette intervention chirurgicale permet de cibler anatomiquement spécifiquement les ganglions sympathiques lombaires postganglionnaires. L’utilisation d’une sympathectomie chirurgicale permet également d’éviter les problèmes non spécifiques et dose-dépendants liés aux méthodes pharmacologiques28,29.
L’utilisation de sympathectomies chimiques par l’administration de 6-OHDA a été décrite en 1967 comme un moyen simple d’obtenir une destruction sélective des terminaisons nerveuses adrénergiques, car les sympathectomies chirurgicales chez les petits animaux n’étaient pas favorisées23,24. La 6-OHDA est une neurotoxine catécholaminergique qui se forme de manière endogène chez les patients atteints de la maladie de Parkinson, et sa toxicité provient de sa capacité à former des radicaux libres et à inhiber la chaîne de transport d’électrons dans les mitochondries30,31. Grâce aux mécanismes de transport de l’absorption de la noradrénaline 1, la 6-OHDA est capable de s’accumuler dans les neurones noradrénergiques, tels que les neurones sympathiques postganglionnaires28. Finalement, le neurone est détruit par le 6-OHDA ; Cependant, les terminaisons du système nerveux périphérique se régénèrent, avec la restauration de l’activité fonctionnelle même lorsque les niveaux d’amines sont encore réduits. Des seuils de dosage différents sont également présents pour différents organes en réponse au 6-OHDA, et il a été démontré que des doses plus élevées de 6-OHDA présentent des effets plus non spécifiques, étendant ses conséquences neurotoxiques aux neurones non contenant des catécholamines et même aux cellules non neuronales. Outre les neurones noradrénergiques, les neurones dopaminergiques sont également affectés par la 6-OHDA29, ce qui rend la sympathectomie chimique finalement moins spécifique aux neurones sympathiques postganglionnaires que la sympathectomie chirurgicale.
Par conséquent, une sympathectomie lombaire chirurgicale permet l’ablation ciblée de l’innervation sympathique des membres inférieurs, qui peut être combinée avec une variété de techniques expérimentales et de manipulations génétiques chez la souris pour étudier comment le système nerveux sympathique contribue à diverses lésions et états pathologiques.
Les ganglions sympathiques lombaires sont de très petites structures situées derrière de nombreux organes abdominaux critiques et de gros vaisseaux. Par conséquent, cette procédure nécessite une précision et une exactitude considérables. Une grande partie de la difficulté réside dans l’identification des ganglions sympathiques en peropératoire. Il est suggéré que l’apprenant soit d’abord capable d’identifier les ganglions dans un cadavre de souris avant de tenter cette procédure chez une souris viva…
The authors have nothing to disclose.
Ce travail a été soutenu par le National Institute of Neurological Disorders and Stroke des NIH sous le numéro de bourse K01NS124912 et en partie par une subvention de développement du Centre spécialisé de recherche d’excellence en différences sexuelles d’U54AG062334 Emory financé par les NIH et du programme de formation des scientifiques médicaux de la faculté de médecine de l’Université Emory. Merci à David Kim, post-bac, pour la section des nerfs sciatiques et à HaoMin SiMa, spécialiste de la recherche, pour l’impression 3D d’un support de téléphone pour notre stéréomicroscope qui a permis de filmer la vidéo.
5-0 absorable suture | CP Medical | 421A | |
5-0 nylon suture | Med-Vet International | MV-661 | |
70% ethanol | Sigma-Aldrich | E7023-4L | |
Anesthesia Induction Chamber | Kent Scientific VetFlo | VetFlo-0530XS | |
Anesthesia Vaporizer | Kent Scientific VetFlo | 13-005-202 | |
Betadine | HealthyPets | BET16OZ | |
C57BL/6J mice | Jackson Laboratory | #000664 | |
Chicken anti-neurofilament-heavy | Abcam | ab72996 | |
Cryostat | Leica | CM1850 | |
Data Analysis Software | Prism | ||
Eye lubricant | Refresh | Refresh P.M. | |
Fine-tipped tweezers | World Precision Instruments | 500233 | |
Fluorescent microscope | Nikon | Ti-E | |
Goat anti-chicken 488 | Invitrogen | A32931 | |
Goat anti-rabbit 647 | Invitrogen | A21245 | |
Heating pad | Braintree Scientific | 39DP | |
Image Analysis Software | Fiji | ||
Imaging Software | Nikon | NIS-Elements | |
Isoflurane | Med-Vet International | RXISO-250 | |
Meloxicam | Med-Vet International | RXMELOXIDYL32 | |
Needle driver | Roboz Surgical Store | RS-7894 | |
Normal Goat Serum | Abcam | ab7481 | |
Phox2bCre:tdTomato mutant mice | Jackson Laboratory | #016223, #007914 | |
Pilocarpine hydrochloride | Sigma-Aldrich | P6503 | |
Rabbit anti-tyrosine hydroxylase | Abcam | ab112 | |
Small straight scissors | Fine Science Tools | 14084-09 | |
Sterile cotton swabs 2×2 | Dynarex | 3252 | |
Sterile cotton tipped applicators | Dynarex | 4301 | |
Sterile drape | Med-Vet International | DR4042 | |
Sterile saline solution | Med-Vet International | 1070988-BX | |
ThCre:mTmG mutant mice | Mutant Mouse Resource and Research Centers | strain #017262-UCD | Jackson Laboratory, strain #007576 |
ThCre:tdTomato mutant mice | European Mouse Mutant Archive | strain #00254 | Jackson Laboratory, strain #007914 |
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