استئصال الودي القطني الجراحي في الفئران
Summary
تقدم هذه المخطوطة بروتوكولا لإزالة الخلايا العصبية القطنية الودية بعد العقدة جراحيا من الفأر. سيسهل هذا الإجراء العديد من الدراسات التي تهدف إلى التحقيق في دور التعصيب الودي في أهداف الأنسجة البعيدة.
Abstract
إصابات الأعصاب الطرفية شائعة ، ويتم تحقيق الشفاء الوظيفي الكامل بعد الإصابة في 10 ٪ فقط من المرضى. يلعب الجهاز العصبي السمبثاوي العديد من الأدوار المهمة في الحفاظ على الاتزان الداخلي الجسدي، ولكن نادرا ما تمت دراسته في سياق إصابة العصب الطرفي. مدى الوظائف العصبية الودية بعد العقدة في الأهداف البعيدة في المحيط غير واضح حاليا. لاستكشاف دور التعصيب الودي للأهداف المحيطية بشكل أفضل ، يوفر نموذج “الضربة القاضية” الجراحي نهجا بديلا. على الرغم من أنه يمكن تحقيق ذلك كيميائيا ، إلا أن التدمير الكيميائي للخلايا العصبية الودية بعد العقد يمكن أن يكون غير محدد ويعتمد على الجرعة. يسمح استخدام استئصال الودي القطني الجراحي في الفئران ، الذي كان يعتقد أنه “غير عملي عمليا” في الصغيرة ، باستهداف محدد للخلايا العصبية الودية بعد العقدة التي تعصب الأطراف الخلفية. تصف هذه المخطوطة كيفية إزالة العقد القطنية الودية L2-L5 جراحيا من الفأر كجراحة للبقاء على قيد الحياة ، مما يقلل بشكل موثوق من استجابة عرق المخلب الخلفي وعدد المحاور العصبية الودية في العصب الوركي.
Introduction
يمكن أن تؤدي إصابات الأعصاب المحيطية (PNIs) إلى عجز حركي وحسي وودي في أهداف الأنسجة البعيدة التي نادرا ما تتعافى وظيفيا بالكامل1. غالبا ما ركزت أبحاث PNI على التجديد الحركي والحسي. ومع ذلك ، فإن ما يقرب من ربع العصب الوركي للفئران يتكون من محاور عصبية متعاطفة غير ميالينية2. ومع ذلك ، فإن دور التعصيب الودي في الأنسجة المحيطية غير مفهوم تماما3. يلعب الجهاز العصبي السمبثاوي دورا رئيسيا في الحفاظ على التوازن الجسدي ، والمشاركة في التنظيم المناعي ، والتنظيم الحراري ، ونغمة الأوعية الدموية ، والتكوين الحيوي للميتوكوندريا ، والمزيد4،5،6،7،8،9،10،11. عندما يتم فقدان التعصيب الودي عند التقاطع العصبي العضلي ، يلاحظ ضعف العضلات المستمر وعدم الاستقرار المشبكي على الرغم من الحفاظ على التعصيب الحركي12. وقد تبين أن هذا التنظيم الودي للانتقال المشبكي عند التقاطع العصبي العضلي ينخفض مع تقدم العمر 13,14 ، مما يساهم في ساركوبينيا ، والذي يعرف بأنه انخفاض يعتمد على العمر في كتلة العضلات والقوةوالقوة 15. من الضروري فهم أفضل لدور التعصيب الودي للأنسجة المحيطية لتطوير العلاجات التي من شأنها تحسين النتائج الوظيفية للمرضى الذين يعانون من PNIs وأشكال أخرى من الخلل الوظيفي الودي.
استئصال الودي هو أداة تجريبية قوية تسمح بالتحقيق في دور التعصيب الودي في الأنسجة المستهدفة البعيدة. على وجه التحديد ، إزالة العقد الودية على مستوى L2-L5 يزيل غالبية التعصيب الودي للأطراف السفلية ، وهو أمر مفيد بشكل خاص للمحققين المهتمين بالعصب الوركي.
يوضح هذا البروتوكول بالتفصيل إزالة الخلايا العصبية الودية بعد العقدة على مستوى L2-L5 من الفأر كجراحة للبقاء على قيد الحياة. يتطلب هذا الإجراء مهارات جراحية مجهرية للقوارض والإلمام بتشريح الفأر ، وعندما يتم إجراؤه بفعالية ، لا يسبب أي اختلافات ظاهرية مرئية. تم استخدام استئصال الودي القطني الجراحي في أبحاث القوارض ، أكثر من الفئرانفي الفئران 16،17،18،19،20،21. ومع ذلك ، لا يوجد حاليا بروتوكول مفصل يصف البروتوكول. ركزت الدراسات السابقة التي تستخدم استئصال الودي القطني بشكل أساسي على دور التعصيب الودي في استجابة الألم ، والتي يتم تخفيفها بشكل عام عن طريق استئصال الودي في نماذج إصابة الأعصاب المختلفة. استخدمت دراسات أقل هذه التقنية في الفئران22 ، ويرجع ذلك على الأرجح إلى صغر حجم المعالم التشريحية ، حيث كان يعتقد أن استخدام استئصال الودي الجراحي “غير عملي تقريبا” في الصغيرة23,24. كما تم استخدام استئصال الودي الموضعي في شكل استئصال الودي الدقيق في نماذج القوارض ، وأيضا في الغالب في سياق سلوكيات الألم25،26،27. يستخدم استئصال الودي الدقيق ، على عكس استئصال الودي القطني الكلي ، نهجا ظهريا يتم من خلاله فصل جزء من الراموس الرمادي إلى عصب نخاعي معين وإزالته ، مما يسمح باستئصال الودي المستهدف للغاية الذي سيتجنب الآثار الجانبية المنتشرة على نطاق أوسع.
نظرا لأن نماذج الفئران ضرورية للعديد من الدراسات التي تتطلب التلاعب الجيني ، فإن هذا الإجراء سيكون له تطبيقات متعددة الاستخدامات تتجاوز نطاق إصابات الأعصاب الطرفية أيضا. باستخدام نهج عبر البطن ، يمكن تصور العقد القطنية المتعاطفة بشكل موثوق واستئصالها من الماوس دون أي آثار ضارة واضحة. على الرغم من توفر بروتوكولات للتدمير الكيميائي للخلايا العصبية الودية بعد العقدة ، مثل استخدام 6-هيدروكسي دوبامين (6-OHDA) 23،24 ، فإن هذا الإجراء الجراحي يسمح باستهداف محدد تشريحيا للعقد القطنية المتعاطفة بعد العقدة. يتجنب استخدام استئصال الودي الجراحي أيضا المخاوف غير المحددة والمعتمدة على الجرعة المتعلقة بالطرق الدوائية28,29.
تم وصف استخدام استئصال الودي الكيميائي عن طريق إدارة 6-OHDA في عام 1967 كطريقة بسيطة لتحقيق تدمير انتقائي للنهايات العصبية الأدرينالية لأن عمليات استئصال الودي الجراحي في الصغيرة لم تكن مفضلة23,24. 6-OHDA هو سم عصبي كاتيكولاميني يتكون داخليا في مرضى باركنسون ، وتستمد سميته من قدرته على تكوين الجذور الحرة وتثبيط سلسلة نقل الإلكترون في الميتوكوندريا30,31. من خلال آليات نقل امتصاص النورإبينفرين -1 ، فإن 6-OHDA قادر على التراكم داخل الخلايا العصبية النورادرينالية ، مثل الخلايا العصبية الودية بعدالعقدة 28. في النهاية ، يتم تدمير الخلايا العصبية بواسطة 6-OHDA ؛ ومع ذلك ، فإن المحطات الطرفية في الجهاز العصبي المحيطي تتجدد ، مع استعادة النشاط الوظيفي حتى عندما لا تزال مستويات الأمين منخفضة. توجد أيضا عتبات جرعات مختلفة للأعضاء المختلفة استجابة ل 6-OHDA ، وقد ثبت أن الجرعات العالية من 6-OHDA تظهر تأثيرات غير محددة أكثر ، مما يوسع عواقبها السمية العصبية إلى الخلايا العصبية غير المحتوية على الكاتيكولامين وحتى الخلايا غير العصبية. بصرف النظر عن الخلايا العصبية النورادرينالية ، تتأثر الخلايا العصبية الدوبامينية ب 6-OHDA أيضا29 ، مما يجعل استئصال الودي الكيميائي في النهاية أقل تحديدا للخلايا العصبية الودية بعد العقد من استئصال الودي الجراحي.
لذلك ، يتيح استئصال الودي القطني الجراحي الاستئصال المستهدف للتعصيب الودي للأطراف السفلية ، والذي يمكن دمجه مع مجموعة متنوعة من التقنيات التجريبية والتلاعب الجيني في الفأر لدراسة كيفية مساهمة الجهاز العصبي الودي في حالات الإصابة والمرض المختلفة.
Protocol
Representative Results
Discussion
العقد القطنية الودية هي هياكل صغيرة جدا تقع خلف العديد من أعضاء البطن الحرجة والأوعية الكبيرة. لذلك ، يتطلب هذا الإجراء دقة ودقة كبيرة. يكمن جزء كبير من الصعوبة في تحديد العقد المتعاطفة أثناء الجراحة. يقترح أن يكون المتعلم قادرا أولا على التعرف على العقد في جثة فأر قبل محاولة هذا الإجراء ف?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
تم دعم هذا العمل من قبل المعهد الوطني للاضطرابات العصبية والسكتة الدماغية التابع للمعاهد الوطنية للصحة بموجب الجائزة رقم K01NS124912 وجزئيا من خلال منحة تنموية من مركز إيموري المتخصص للتميز البحثي في الاختلافات بين الجنسين الممول من المعاهد الوطنية للصحة U54AG062334 وبرنامج تدريب العلماء الطبيين في كلية الطب بجامعة إيموري. شكرا لديفيد كيم ، ما بعد البكالوريا ، لتقسيم الأعصاب الوركية وإلى HaoMin SiMa ، أخصائي الأبحاث ، لطباعة 3D حامل هاتف لمجهرنا الاستريو الذي سمح بتصوير الفيديو.
Materials
| 5-0 absorable suture | CP Medical | 421A | |
| 5-0 nylon suture | Med-Vet International | MV-661 | |
| 70% ethanol | Sigma-Aldrich | E7023-4L | |
| Anesthesia Induction Chamber | Kent Scientific VetFlo | VetFlo-0530XS | |
| Anesthesia Vaporizer | Kent Scientific VetFlo | 13-005-202 | |
| Betadine | HealthyPets | BET16OZ | |
| C57BL/6J mice | Jackson Laboratory | #000664 | |
| Chicken anti-neurofilament-heavy | Abcam | ab72996 | |
| Cryostat | Leica | CM1850 | |
| Data Analysis Software | Prism | ||
| Eye lubricant | Refresh | Refresh P.M. | |
| Fine-tipped tweezers | World Precision Instruments | 500233 | |
| Fluorescent microscope | Nikon | Ti-E | |
| Goat anti-chicken 488 | Invitrogen | A32931 | |
| Goat anti-rabbit 647 | Invitrogen | A21245 | |
| Heating pad | Braintree Scientific | 39DP | |
| Image Analysis Software | Fiji | ||
| Imaging Software | Nikon | NIS-Elements | |
| Isoflurane | Med-Vet International | RXISO-250 | |
| Meloxicam | Med-Vet International | RXMELOXIDYL32 | |
| Needle driver | Roboz Surgical Store | RS-7894 | |
| Normal Goat Serum | Abcam | ab7481 | |
| Phox2bCre:tdTomato mutant mice | Jackson Laboratory | #016223, #007914 | |
| Pilocarpine hydrochloride | Sigma-Aldrich | P6503 | |
| Rabbit anti-tyrosine hydroxylase | Abcam | ab112 | |
| Small straight scissors | Fine Science Tools | 14084-09 | |
| Sterile cotton swabs 2×2 | Dynarex | 3252 | |
| Sterile cotton tipped applicators | Dynarex | 4301 | |
| Sterile drape | Med-Vet International | DR4042 | |
| Sterile saline solution | Med-Vet International | 1070988-BX | |
| ThCre:mTmG mutant mice | Mutant Mouse Resource and Research Centers | strain #017262-UCD | Jackson Laboratory, strain #007576 |
| ThCre:tdTomato mutant mice | European Mouse Mutant Archive | strain #00254 | Jackson Laboratory, strain #007914 |
References
- Scholz, T., et al. Peripheral nerve injuries: An international survey of current treatments and future perspectives. J Reconstr Microsurg. 25 (06), 339-344 (2009).
- Schmalbruch, H. Fiber composition of the rat sciatic nerve. Anat Rec. 215 (1), 71-81 (1986).
- Tian, T., Moore, A. M., Ghareeb, P. A., Boulis, N. M., Ward, P. J. A perspective on electrical stimulation and sympathetic regeneration in peripheral nerve injuries. Neurotrauma Rep. 5 (1), 172-180 (2024).
- Gagnon, D., Crandall, C. G. Sweating as a heat loss thermoeffector. Hand Clin Neurol. 156, 211-232 (2018).
- Grassi, G. Role of the sympathetic nervous system in human hypertension. J Hypertens. 16 (12), 1979-1987 (1998).
- Dibona, G. F. Sympathetic nervous system and the kidney in hypertension. Curr Opin Nephrol Hypertens. 11 (2), 197-200 (2002).
- Elenkov, I. J., Wilder, R. L., Chrousos, G. P., Vizi, E. S. The sympathetic nerve-An integrative interface between two supersystems: The brain and the immune system. Pharmacol Rev. 52 (4), 595-638 (2000).
- Besedovsky, H. O., Del Rey, A., Sorkin, E., Da Prada, M., Keller, H. Immunoregulation mediated by the sympathetic nervous system. Cell Immunol. 48 (2), 346-355 (1979).
- Straka, T., et al. Postnatal development and distribution of sympathetic innervation in mouse skeletal muscle. Int J Mol Sci. 19 (7), 1935 (2018).
- Geng, T., et al. Pgc-1α plays a functional role in exercise-induced mitochondrial biogenesis and angiogenesis but not fiber-type transformation in mouse skeletal muscle. Am J Physiol Cell Physiol. 298 (3), C572-C579 (2010).
- Lin, J., Handschin, C., Spiegelman, B. M. Metabolic control through the pgc-1 family of transcription coactivators. Cell Metab. 1 (6), 361-370 (2005).
- Khan, M. M., et al. Sympathetic innervation controls homeostasis of neuromuscular junctions in health and disease. Proc Natl Acad Sci. 113 (3), 746-750 (2016).
- Delbono, O., Rodrigues, A. C. Z., Bonilla, H. J., Messi, M. L. The emerging role of the sympathetic nervous system in skeletal muscle motor innervation and sarcopenia. Ageing Res Rev. 67, 101305 (2021).
- Rodrigues, A. C. Z., et al. Heart and neural crest derivative 2-induced preservation of sympathetic neurons attenuates sarcopenia with aging. J Cachexia Sarcopenia Muscle. 12 (1), 91-108 (2021).
- Rosenberg, I. H. Summary comments. Am J Clin Nutr. 50 (5), 1231-1233 (1989).
- Murata, Y., Olmarker, K., Takahashi, I., Takahashi, K., Rydevik, B. Effects of lumbar sympathectomy on pain behavioral changes caused by nucleus pulposus-induced spinal nerve damage in rats. Eur Spine J. 15, 634-640 (2006).
- Xie, J., Park, S. K., Chung, K., Chung, J. M. The effect of lumbar sympathectomy in the spinal nerve ligation model of neuropathic pain. J Pain. 2 (5), 270-278 (2001).
- Lee, D. H., Katner, J., Iyengar, S., Lodge, D. The effect of lumbar sympathectomy on increased tactile sensitivity in spinal nerve ligated rats. Neurosci Lett. 298 (2), 99-102 (2001).
- Ringkamp, M., et al. Lumbar sympathectomy failed to reverse mechanical allodynia-and hyperalgesia-like behavior in rats with l5 spinal nerve injury. Pain. 79 (2-3), 143-153 (1999).
- Zhao, C., et al. Lumbar sympathectomy attenuates cold allodynia but not mechanical allodynia and hyperalgesia in rats with spared nerve injury. J Pain. 8 (12), 931-937 (2007).
- Zheng, Z. -. F., et al. Recovery of sympathetic nerve function after lumbar sympathectomy is slower in the hind limbs than in the torso. Neural Regen Res. 12 (7), 1177 (2017).
- Holmberg, K., Shi, T. -. J. S., Albers, K. M., Davis, B. M., Hökfelt, T. Effect of peripheral nerve lesion and lumbar sympathectomy on peptide regulation in dorsal root ganglia in the ngf-overexpressing mouse. Exp Neurol. 167 (2), 290-303 (2001).
- Thoenen, H., Tranzer, J. Chemical sympathectomy by selective destruction of adrenergic nerve endings with 6-hydroxydopamine. Naunyn Schmiedebergs Arch. Exp. Pathol. Pharmakol. 261, 271-288 (1968).
- Thoenen, H., Tranzer, J. P., Häusler, G. Chemical sympathectomy with 6-hydroxydopamine. New Aspects of Storage and Release Mechanisms of Catecholamines. , 130-143 (1970).
- Xie, W., et al. Localized sympathectomy reduces mechanical hypersensitivity by restoring normal immune homeostasis in rat models of inflammatory pain. J Neuroscience. 36 (33), 8712-8725 (2016).
- Zhu, X., Xie, W., Zhang, J., Strong, J. A., Zhang, J. -. M. Sympathectomy decreases pain behaviors and nerve regeneration by downregulating monocyte chemokine ccl2 in dorsal root ganglia in the rat tibial nerve crush model. Pain. 163 (1), e106-e120 (2022).
- Tonello, R., et al. Local sympathectomy promotes anti-inflammatory responses and relief of paclitaxel-induced mechanical and cold allodynia in mice. Anesthesiology. 132 (6), 1540-1553 (2020).
- Kostrzewa, R. M., Jacobowitz, D. M. Pharmacological actions of 6-hydroxydopamine. Pharmacol Rev. 26 (3), 199-288 (1974).
- Michel, P., Hefti, F. Toxicity of 6-hydroxydopamine and dopamine for dopaminergic neurons in culture. J Neuroscience Res. 26 (4), 428-435 (1990).
- Andrew, R., et al. The determination of hydroxydopamines and other trace amines in the urine of parkinsonian patients and normal controls. Neurochemical Res. 18, 1175-1177 (1993).
- Glinka, Y., Gassen, M., Youdim, M. Mechanism of 6-hydroxydopamine neurotoxicity. J Neural Transm Suppl. 5, 55-66 (1997).
- Treuting, P. M., Dintzis, S. M., Montine, K. S. . Comparative anatomy and histology: A mouse, rat, and human atlas. , (2017).
- Hweidi, S. A., Lee, S., Wolf, P. Effect of sympathectomy on microvascular anastomosis in the rat. Microsurgery. 6 (2), 9-96 (1985).
- Navarro, X., Kennedy, W. R. Sweat gland reinnervation by sudomotor regeneration after different types of lesions and graft repairs. Exp Neurol. 104 (3), 229-234 (1989).
- Gaudet, A. D., Popovich, P. G., Ramer, M. S. Wallerian degeneration: Gaining perspective on inflammatory events after peripheral nerve injury. J Neuroinflammation. 8 (1), 1-13 (2011).
- Babetto, E., et al. Targeting nmnat1 to axons and synapses transforms its neuroprotective potency in vivo. J Neuroscience. 30 (40), 13291-13304 (2010).
- Brumovsky, P. R. Dorsal root ganglion neurons and tyrosine hydroxylase-an intriguing association with implications for sensation and pain. Pain. 157 (2), 314 (2016).
- Tian, T., Harris, A., Owyoung, J., Sima, H., Ward, P. J. Conditioning electrical stimulation fails to enhance sympathetic axon regeneration. bioRxiv. , (2023).
- Tian, T., Ward, P. J. The ThCre: Mtmg mouse has sparse expression in the sympathetic nervous system. bioRxiv. , (2023).
- Ohman-Gault, L., Huang, T., Krimm, R. The transcription factor Phox2b distinguishes between oral and non-oral sensory neurons in the geniculate ganglion. J Comparative Neurol. 525 (18), 3935-3950 (2017).
- Pattyn, A., Morin, X., Cremer, H., Goridis, C., Brunet, J. -. F. The homeobox gene phox2b is essential for the development of autonomic neural crest derivatives. Nature. 399 (6734), 366-370 (1999).
- François, M., et al. Sympathetic innervation of the interscapular brown adipose tissue in mouse. Ann N Y Acad Sci. 1454 (1), 3-13 (2019).
.