تسجيل نشاط العضلات الأمامية في الفئران المثبتة بالرأس باستخدام أقطاب EMG المزروعة بشكل مزمن
Summary
يصف هذا البروتوكول تصنيع اليد والزرع الجراحي لأقطاب تخطيط كهربية العضل (EMG) في عضلات الأطراف الأمامية للفئران لتسجيل نشاط العضلات أثناء تجارب السلوك الثابت للرأس.
Abstract
مكنت الأدوات الجينية والجزيئية القوية المتوفرة في أبحاث علم الأعصاب في أنظمة الفئران الباحثين من استجواب وظيفة النظام الحركي بدقة غير مسبوقة في الفئران الثابتة الرأس التي تؤدي مجموعة متنوعة من المهام. يجعل الحجم الصغير للفأر قياس الناتج الحركي أمرا صعبا ، حيث تم تصميم الطريقة التقليدية لتسجيل تخطيط كهربية العضل (EMG) لنشاط العضلات للحيوانات الكبيرة مثل القطط والرئيسيات. في انتظار أقطاب EMG المتاحة تجاريا للفئران ، فإن الطريقة القياسية الذهبية الحالية لتسجيل نشاط العضلات في الفئران هي صنع مجموعات أقطاب كهربائية داخلية. توضح هذه المقالة صقل الإجراءات المعمول بها لتصنيع مجموعة الأقطاب الكهربائية يدويا ، وزرع الأقطاب الكهربائية في نفس الجراحة مثل زرع صفيحة الرأس ، وتثبيت موصل على لوح الرأس ، ورعاية التعافي بعد الجراحة. بعد الاسترداد ، يمكن الحصول على تسجيلات EMG بدقة ميلي ثانية أثناء السلوك الثابت للرأس لعدة أسابيع دون تغييرات ملحوظة في جودة الإشارة. تتيح هذه التسجيلات قياسا دقيقا لنشاط عضلات الأطراف الأمامية جنبا إلى جنب مع التسجيل العصبي في الجسم الحي و / أو الاضطراب لاستكشاف آليات التحكم الحركي في الفئران.
Introduction
في العقود الأخيرة ، أصبحت الفئران كائنا نموذجيا جذابا لدراسة النظام الحركي للثدييات. تتضمن الأساليب التجريبية الشائعة الفئران الثابتة الرأس التي تؤدي المهام الحركية جنبا إلى جنب مع مراقبة و / أو اضطراب النشاط العصبي1،2،3،4،5. اعتمدت دراسات النظام الحركي في الأنواع الأكبر (مثل القطط والرئيسيات) تقليديا على تخطيط كهربية العضل (EMG) لقياس الناتج الحركي مباشرة خلال هذه التجارب6،7،8. ومع ذلك ، فإن تسجيل نشاط العضلات في الفئران يمثل تحديا لأن عضلاتها صغيرة جدا بالنسبة لأقطاب EMG المتاحة تجاريا المستخدمة في تجارب الثدييات الكبيرة9. يختار العديد من الباحثين تتبع حركية الأطراف من خلال الفيديو4،10،11 و / أو الأداء السلوكي2،4،12 لفحص الناتج الحركي بشكل غير مباشر ، لكن هذه الطرق تفتقر إلى الدقة للكشف عن تأثير المقياس الزمني ميلي ثانية للنشاط العصبي واضطرابه على العضلات. وبالتالي ، فإن تسجيل EMG أمر مرغوب فيه للباحثين المهتمين بالتحكم العصبي المباشر في العضلات.
يتضمن EMG قياس الجهد بين نقطتين ، مفصولة عادة بمسافة قصيرة موازية تقريبا لألياف العضلات التي يتم تسجيلها. تأتي أقطاب EMG في أصناف سطحية (أو “رقعة”) وعضلية (أو “إبرة”). يتم وضع الأقطاب الكهربائية السطحية فوق الجلد أو تراكبها على الأنسجة العضلية ويتم تثبيتها بمادة لاصقة أو خياطة. على هذا النحو ، فإن الأقطاب الكهربائية السطحية أقل توغلا من الأقطاب الكهربائية العضلية وهي الأكثر شيوعا لدى البشر والقطط والرئيسيات نظرا لسهولة استخدامها النسبية. كما تم استخدام الأقطاب الكهربائية السطحية بنجاح مع الجرذان والفئران13،14 ؛ ومع ذلك ، يجب تصنيعها يدويا وزرعها جراحيا تحت الجلد بسبب ميل القوارض لمحاولة إزالة الأجسام الغريبة أثناء الاستمالة. من ناحية أخرى ، يتم زرع أقطاب EMG العضلية جراحيا داخل الأنسجة العضلية. نظرا لأنها غارقة في الأنسجة العضلية ، فإنها توفر دقة مكانية عالية وتظل ثابتة في موضعها إلى أجل غير مسمى. وبالتالي ، فإن أقطاب EMG العضلية المزروعة مثالية على الأقطاب الكهربائية السطحية للتجارب طويلة المدى باستخدام القوارض. لتسجيل EMG العضلي بشكل موثوق في الفئران ، طور الباحثون طريقة لتصنيع وزرع أقطاب EMG يدويا في عضلات صغيرة مثل تلك الموجودة في ساعد الفأر البالغ. تتيح هذه الأقطاب الكهربائية تسجيل العضلات المزمنة أثناء السلوك الحركي في القوارض على مدار عدة أسابيع.
البروتوكول الموصوف هنا هو نتيجة صقل دام عقدا من الزمن للطرق المعمول بها15،16،17،18 ، والتي أسفرت عن إجراء لتصنيع اليد وزرعها وتسجيلها من أقطاب EMG السلكية المزروعة بشكل مزمن في أزواج العضلات المثنية / الباسطة للكوع والمعصم في الفئران التصرفية. يصف القسم الأول التصنيع اليدوي لمجموعة أقطاب كهربائية بأربعة أزواج من الأقطاب الكهربائية وموصل ذو 8 سنون لواجهة مرحلة الرأس. يفصل القسم التالي الزرع الجراحي للأقطاب الكهربائية في العضل في عضلات الذراع العلوية والسفلية في نفس جراحة زرع صفيحة الرأس. أخيرا ، تتم مناقشة التسجيلات التمثيلية من الفئران التي تؤدي مجموعة متنوعة من السلوكيات. بشكل عام ، تعد هذه الطريقة طريقة فعالة من حيث التكلفة وقابلة للتخصيص لتضمين قياسات نشاط العضلات في تجارب السلوك الثابت للرأس والتي تعتبر مثالية للمختبرات التي تتمتع ببعض الخبرة في تصنيع الأقطاب الكهربائية.
Protocol
Representative Results
Discussion
يتيح هذا البروتوكول تسجيلات نشاط العضلات المستقرة من الفئران الثابتة الرأس التي تؤدي مجموعة متنوعة من السلوكيات لعدة أسابيع. في الآونة الأخيرة ، تم استخدام هذه الطريقة لفحص التحكم العصبي في عضلات الأطراف أثناء سلوكيات مثل حركة جهاز المشي18,20 ، ومهمة سحب عصا التحكم18 ، ومهمة الانكماش المشترك21. في حين أن البروتوكول الموصوف هنا خاص بعضلات مرفق الفأر والمعصم ، إلا أنه يمكن تعديله بسهولة للتسجيل من عضلات مختلفة أو عدد مختلف من العضلات عن طريق تغيير الطول و / أو العدد الإجمالي لأزواج الأقطاب الكهربائية. تم تكييف الطريقة الموصوفة هنا من تلك المستخدمة سابقا لتسجيل نشاط عضلات الأطراف الأمامية والخلفية في الفئران بدون تقييد الرأس15،16،17.
يتطلب تصنيع القطب ممارسة كبيرة لإتقانها. يوصى بالممارسة اليومية لمدة 1-2 ساعات أثناء التعلم. يعد تجريد الأقطاب الكهربائية الخطوة الأكثر تحديا نظرا للمستوى الدقيق للقوة المطلوبة لقطع العزل دون إتلاف السلك الأساسي. يعتمد هذا المستوى من القوة على حدة الشفرة ، لذا فإن استبدال شفرة المشرط بشكل متكرر يمكن أن يساعد في ضمان قابلية التكرار أثناء التعلم. قد يكون لحام الأسلاك بالشفرات النحاسية للموصل أمرا صعبا أيضا لأن الفولاذ المقاوم للصدأ لا يلحم بسهولة. يساعد تطبيق كمية ليبرالية من التدفق المتوافق مع الفولاذ المقاوم للصدأ على تعزيز الاتصال.
التحدي الرئيسي أثناء جراحة الزرع هو ربط العقدة البعيدة دون إزعاج السلك المزروع أو العقدة القريبة. يجب أن تكون العقدة القريبة كبيرة بما يكفي لمقاومة الانزلاق إلى العضلات في موقع الإدخال – وبالتالي ، تجنب ربط العقدة بإحكام شديد في الخطوة 2 من تصنيع مجموعة الأقطاب الكهربائية. إذا هاجرت العقدة القريبة بعد الزرع ، فاستخدم ملقط ذو رأس من ألياف الكربون لإعادة وضعه بعناية. شد العقدة البعيدة ببطء مع الحفاظ على قبضة قوية على السلك بالملقط لتجنب سحب القطب بأكمله من خلاله. هذه الخطوة ضرورية لضمان طول عمر الأقطاب الكهربائية المزروعة: الكثير من التوتر الموجود على القطب يمكن أن يتسبب في كسره عندما يتحرك ، في حين أن القطب الفضفاض يمكن أن يتحول أثناء الشفاء ويفقد الاتصال بالعضلات المرتبطة به أثناء شفاء الأنسجة.
تتعافى بشكل جيد بشكل ملحوظ من الجراحة ، على الرغم من وجود مضاعفات محتملة يجب ملاحظتها. أولا ، سوف تمضغ الفئران الغرز والأقطاب الكهربائية إذا أتيحت لها الفرصة. في حين أن طوق الإليزابيثي يمنع ذلك ، فإنه يمنع أيضا من الاستمالة بنفسه. تصاب بعض الفئران بتراكم يشبه المخاط حول عيونها. تعاني ذكور الفئران العرضية ، وخاصة الأكبر سنا ، من انسداد مجرى البول الذي يمكن أن يكون مؤلما للحيوان. السماح للحيوان بالعناية بنفسه لمدة 20 دقيقة كل يوم قبل فحص الغرز يجب أن يمنح وقتا كافيا لمنع هذه المشكلات.
هناك قيود مهمة لهذه الطريقة يجب ملاحظتها. أولا ، لا يمكن لهذه الأقطاب الكهربائية المخصصة عموما حل نشاط وحدة المحرك المفردة. علاوة على ذلك ، ليس من المضمون أن تنبعث الإشارة الكهربائية حصريا من عضلة معينة (أي العضلة ذات الرأسين) ، حيث يصعب استبعاد الحديث المتبادل من النشاط في عضلات التآزر القريبة. لذلك ، في المنشورات ، يشير الباحثون عادة إلى العضلات المسجلة من خلال مجموعة التآزر الخاصة بهم (أي ثني الكوع). يوصى بإجراء تشريح بعد الوفاة بعد كل تجربة للتحقق من موضع كل قطب كهربائي ، حيث يمكن أن يتحول في الأنسجة أثناء الشفاء.
يجب على الباحثين المهتمين بنشاط الوحدة الحركية المفردة التفكير في تجربة أقطاب EMG المطورة حديثا من قبل مركز أبحاث الهندسة الحيوية الحركية المتقدمة (CAMBER) في جامعة إيموري. لا تزال هذه الأقطاب الكهربائية قيد التطوير ، لكن CAMBER ستوفر أحدث تصميم للقطب الكهربائي. العيب الرئيسي لهذه الأقطاب الكهربائية هو طول العمر: تسمح الأقطاب الكهربائية المصنعة يدويا الموصوفة في هذا البروتوكول عموما بالتسجيلات لعدة أسابيع ، في حين أن أقطاب CAMBER تعمل بشكل أفضل للتجارب قصيرة المدى. يمكن للباحثين الذين يختارون طريقة تسجيل EMG الاتصال ب CAMBER مباشرة لتحديد ما إذا كانت أقطابهم الكهربائية مناسبة لتجربة معينة.
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
يود المؤلفون أن يشكروا الدكتورة كلير وارينر لمساهمتها في تطوير هذه الطريقة. ساعد مارك أجريوس وساجيشنو سافيا في إعداد الأرقام. تم دعم هذا البحث من خلال جائزة Searle Scholar ، وزمالة Sloan Research ، وتعاون Simons في جائزة Global Brain Pilot ، وجائزة Whitehall Research Grant ، واتحاد شيكاغو الطبي الحيوي بدعم من صناديق سيرل في The Chicago Community Trust ، ومنحة المعاهد الوطنية للصحة DP2 NS120847 (AM) ، ومنحة المعاهد الوطنية للصحة 2T32MH067564 (AK).
Materials
| #11 Scalpel Blades | World Precision Instruments | 504170 | For EMG electrode fabrication |
| #3 Scalpel Handle | Fine Science Tools | 10003-12 | For EMG electrode fabrication |
| 1 mL Sub-Q Syringe (100 pack) | Becton Dickinson | 309597 | For administering injectable drugs |
| 12-pin connector | Newark | 33AC2371 | 12-pin connector with brass fittings; for EMG electrode fabrication |
| 18 G Needles | Exel International | 26419 | For EMG electrode fabrication |
| 27 G Needles | Exel International | 26426 | For EMG electrode fabrication |
| 3 M Transpore Surgical Tape | 3M | 1527-0 | For taping animal's limbs out during surgery |
| 6-0 silk sutures | Henry Schein | 101-2636 | These sutures work well with delicate skin around the wrists |
| C&B Metabond Complete Kit | Pearson Dental | P16-0126 | Dental cement to affix connector to headplate |
| C57BL6/J Mice | Jackson Laboratories | #000664 | Wild type mice |
| Carbofib 5-CF Tweezers (2) | Aven tools | 18762 | Carbon fiber tipped forceps, used to manipulate delicate parts of electrode (stripped or inserted sections) |
| Carprodyl (Carprofen) 50 mg/mL Injection | Ceva Animal Health, LLC | G43010B | Injectable analgesic for pain management during and after surgery |
| Castroviejo Micro Needle Holder | Fine science tools | 12060-01 | For suturing |
| Castroviejo Needle Holder (large) | Fine science tools | 12565-14 | For inserting needle into muscle |
| Delicate Bone Scraper | Fine science tools | 10075-16 | To separate skin from underlying tissue |
| Dietgel 76A Dietary Supplement | Clear H2O | 72-07-5022 | For post-operative care |
| Dumont #5/45 Forceps | Fine science tools | 11251-35 | To remove fascia overlying muscle |
| Elizabethan collar for mouse | Kent Scientific Corporation | EC201V-10 | For post-operative care |
| Enrofloxacin 2.27% | Covetrus | #074743 | Injectable antibiotic for use during and after surgery |
| Epoxy gel | Devcon | 14265 | For EMG electrode fabrication |
| Hopkins Bulldog Clamp (4) | Stoelting | 10-000-481 | Tissue clamps for headplate implantation |
| Isoflurane Solution | Covetrus | 11695067771 | Inhalable anesthesia |
| Lidocaine Hydrochloride Injectable – 2% | Covetrus | #002468 | Topical analgesic for pain management during surgery |
| Medical Grade Oxygen | Airgas | OX USP200 | For administering isoflurane during surgery |
| MetriCide 1 Gallon | Metrex | 10-1400 | Glutaraldehyde solution for cold-sterilization of headplate and electrodes |
| MetriTest Strips 1.5% | Metrex | 10-303 | Test strips for monitoring glutaraldehyde solution (recommended) |
| Model 900LS Small Animal Stereotaxic Instrument | Kopf Instruments | 900LS | Stereotax with lazy susan feature that allows platform rotation during surgery |
| PFA-coated 0.0055" braided stainless steel wire | A-M systems | 793200 | For EMG electrode fabrication |
| Povidone-iodine prep pads | Dynarex | 1108 | For cleaning skin |
| Puralube Vet Ointment | Dechra | 37327 | Eye ointment for surgery |
| Sterile alcohol prep pads | Dynarex | 1113 | For cleaning skin |
| Straight fine #5 forceps | Fine science tools | 11295-10 | For curling wire after insertion |
| Straight fine scissors | Fine science tools | 14060-11 | For cutting wire |
| Student Vannas Spring Scissors | Fine science tools | 91500-09 | For making incisions, trimming fat and fascia, and suturing |
| Technik Tweezers 7B-SA (2) | Aven tools | 18074USA | Curved blunt forceps, for general use during surgery |
| Triple Antibiotic Ointment | Walgreens | 975863 | Topical antibiotic for surgery |
| V-1 Tabletop Laboratory Animal Anesthesia System | VetEquip | 901806 | Contains all necessary equipment for anesthesia induction and scavenging including vaporizer, induction chamber, moveable plastic nose cone, and tubing |
References
- Dombeck, D. A., Khabbaz, A. N., Collman, F., Adelman, T. L., Tank, D. W. Imaging large scale neural activity with cellular resolution in awake mobile mice. Neuron. 56 (1), 43-57 (2007).
- Guo, Z. V., et al. Flow of cortical activity underlying a tactile decision in mice. Neuron. 81 (1), 179-194 (2014).
- Guo, J. Z., et al. Cortex commands the performance of skilled movement. eLife. 4, e10774 (2015).
- Morandell, K., Huber, D. The role of forelimb motor cortex areas in goal directed action in mice. Sci Rep. 7 (1), 15759 (2017).
- Galiñanes, G. L., Bonardi, C., Huber, D. Directional reaching for water as a cortex-dependent behavioral framework for mice. Cell Rep. 22 (10), 2767-2783 (2018).
- Evarts, E. V., Tanji, J. Reflex and intended responses in motor cortex pyramidal tract neurons of monkey. J Neurophysiol. 39 (5), 1069-1080 (1976).
- Hounsgaard, J., Hultborn, H., Jespersen, B., Kiehn, O. Bistability of alpha-motoneurones in the decerebrate cat and in the acute spinal cat after intravenous 5-hydroxytryptophan. J Physiol. 405, 345-367 (1988).
- Murphy, P. R., Hammond, G. R. The role of cutaneous afferents in the control of gamma-motoneurones during locomotion in the decerebrate cat. J Physiol. 434, 529-547 (1991).
- Manuel, M., Chardon, M., Tysseling, V., Heckman, C. J. Scaling of motor output, from mouse to humans. Physiol Bethesda Md. 34 (1), 5-13 (2019).
- Sauerbrei, B. A., et al. Cortical pattern generation during dexterous movement is input-driven. Nature. 577 (7790), 386-391 (2020).
- Barrett, J. M., Raineri Tapies, M. G., Shepherd, G. M. G. Manual dexterity of mice during food-handling involves the thumb and a set of fast basic movements. PLoS One. 15 (1), e0226774 (2020).
- Serradj, N., et al. Task-specific modulation of corticospinal neuron activity during motor learning in mice. Nat Commun. 14, 2708 (2023).
- Scholle, H. C., et al. Spatiotemporal surface EMG characteristics from rat triceps brachii muscle during treadmill locomotion indicate selective recruitment of functionally distinct muscle regions. Exp Brain Res. 138 (1), 26-36 (2001).
- Scholle, H. C., et al. Kinematic and electromyographic tools for characterizing movement disorders in mice. Mov Disord off J Mov Disord Soc. 25 (3), 265-274 (2010).
- Pearson, K. G., Acharya, H., Fouad, K. A new electrode configuration for recording electromyographic activity in behaving mice. J Neurosci Methods. 148 (1), 36-42 (2005).
- Akay, T., Acharya, H. J., Fouad, K., Pearson, K. G. Behavioral and electromyographic characterization of mice lacking EphA4 receptors. J Neurophysiol. 96 (2), 642-651 (2006).
- Akay, T., Tourtellotte, W. G., Arber, S., Jessell, T. M. Degradation of mouse locomotor pattern in the absence of proprioceptive sensory feedback. Proc Natl Acad Sci USA. 111 (47), 16877-16882 (2014).
- Miri, A., et al. Behaviorally selective engagement of short-latency effector pathways by motor cortex. Neuron. 95 (3), 683-696 (2017).
- Osborne, J., Dudman, J. RIVETS: A mechanical system for in vivo and in vitro electrophysiology and imaging. PloS One. 9 (2), e89007 (2014).
- Santuz, A., Laflamme, O. D., Akay, T. The brain integrates proprioceptive information to ensure robust locomotion. J Physiol. 600 (24), 5267-5294 (2022).
- Warriner, C. L., Fageiry, S., Saxena, S., Costa, R. M., Miri, A. Motor cortical influence relies on task-specific activity covariation. Cell Rep. 40, 111427 (2022).
